本發(fā)明涉及中成藥的質(zhì)量控制技術(shù)，具體涉及一種麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法。

背景技術(shù)：

麝香壯骨膏是一種上市多年的中成藥，現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)是國家藥品標(biāo)準(zhǔn)ws3-b-2268-96。麝香壯骨膏是由八角茴香、山柰、生川烏、生草烏、麻黃、蒼術(shù)、白芷、當(dāng)歸、干姜、人工麝香、薄荷腦、水楊酸甲酯、硫酸軟骨素、冰片、鹽酸苯海拉明、樟腦等十六味原料組成，具有鎮(zhèn)痛、消炎之功效，可用于風(fēng)濕、關(guān)節(jié)痛，腰痛，神經(jīng)痛，肌肉酸痛和扭挫傷。

麝香壯骨膏作為中成藥，其藥效是多種活性成分共同作用的結(jié)果。但目前麝香壯骨膏的質(zhì)量控制方法為僅檢測單一指標(biāo)成分的含量，如中國發(fā)明專利申請公開號cn101991839a、cn200610036947.3、cn200610036858.9、cn200510046400.7、cn201410170043.4和名稱為“八角茴香水溶性成分hplc指紋圖譜及莽草酸的定量研究”、“草烏藥材hplc指紋圖譜研究”、“川烏hplc指紋圖譜研究”等專利和文獻(xiàn)均只涉及部分藥材指紋圖譜的檢測方法，而名稱為“hplc法測定麝香壯骨膏藥材浸膏中歐前胡素的含量”測定的則是藥材浸膏中歐前胡素的含量，另有名稱為“rp－h(huán)plc法測定麝香壯骨膏中鹽酸苯海拉明的含量”和“氣相法測定麝香壯骨膏中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量”的文獻(xiàn)研究中只涉及到麝香壯骨膏中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯和鹽酸苯海拉明含量的測定，因此，現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法未能對其他有效成分，如八角茴香、山柰、生川烏、生草烏、麻黃、蒼術(shù)、當(dāng)歸、干姜進(jìn)行檢測，因此存在一定的局限性，無法全面反映產(chǎn)品質(zhì)量狀況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的是提供一種操作方便、重現(xiàn)性好、精密度高的麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種麝香壯骨膏標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建方法，步驟如下：

a)標(biāo)樣溶液、參照物溶液的準(zhǔn)備：將至少15批次合格的麝香壯骨膏分別回流提取得到各標(biāo)樣溶液，將鹽酸苯海拉明對照品加甲醇制成參照物溶液；

b)高效液相色譜分析：精密吸取等量的各標(biāo)樣溶液、參照物溶液，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測定，即得各標(biāo)樣溶液和參照物溶液的色譜圖；

c)標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建：將得到的各標(biāo)樣溶液的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，制定得到麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜，該標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中有17個(gè)特征峰，按出現(xiàn)的時(shí)間順序?qū)⑺龅?7個(gè)特征峰依次編號1～16、s，以參照物溶液的色譜峰的相對保留時(shí)間為1，計(jì)算得知1～16號特征峰的平均相對保留時(shí)間分別為0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.46、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92；所述的s號色譜峰是鹽酸苯海拉明的特征峰，其平均相對保留時(shí)間為1。

本發(fā)明公開的麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建方法是申請人經(jīng)多年的試驗(yàn)研究獲得，不僅能反映麝香壯骨膏的內(nèi)在質(zhì)量，而且操作簡便快捷。采用本發(fā)明公開的上述方法構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中的17個(gè)特征峰的分離度高，從而為后續(xù)麝香壯骨膏產(chǎn)品的質(zhì)量檢測有效地提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，進(jìn)而為麝香壯骨膏今后的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供一種可行的質(zhì)量控制模式。具體說來，本發(fā)明是將合格的各麝香壯骨膏制得的標(biāo)樣溶液與對鹽酸苯海拉明照品制得的參照物溶液在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下測定分析得到色譜圖，這樣將鹽酸苯海拉明對照品的色譜圖與合格的各麝香壯骨膏的色譜圖進(jìn)行比對，從而可以確定兩者之間的共有特征峰，亦即找出各麝香壯骨膏測得的色譜圖上的鹽酸苯海拉明的特征峰，從而以鹽酸苯海拉明特征峰的相對保留時(shí)間為1，計(jì)算出各麝香壯骨膏的色譜圖上其他特征峰的相對保留時(shí)間，進(jìn)而為后續(xù)的待測麝香壯骨膏產(chǎn)品的質(zhì)量檢測提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

需要說明的是，所述的合格的麝香壯骨膏也可以理解為是標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏，其是質(zhì)量完全符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的麝香壯骨膏。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是基于以上方法構(gòu)建的麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜，提供一種麝香壯骨膏的質(zhì)量檢測方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種麝香壯骨膏的質(zhì)量檢測方法，步驟如下：按照標(biāo)樣溶液和參照物溶液的方法制備并測定得到待測麝香壯骨膏的色譜圖和鹽酸苯海拉明對照品的色譜圖，將待測麝香壯骨膏的色譜圖與構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜比對，若待測麝香壯骨膏的色譜圖中出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中相同的17個(gè)特征峰，與參照物峰相應(yīng)的峰為s峰，計(jì)算各特征峰與s峰的相對保留時(shí)間，各特征峰的相對保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中各特征峰的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±5％以內(nèi)，則該麝香壯骨膏的質(zhì)量合格，反之則不合格，如此可以實(shí)現(xiàn)快速檢測判斷麝香壯骨膏的質(zhì)量。

附圖說明

圖1-12為實(shí)施例1測得的色譜圖；

圖13實(shí)施例2測得的鹽酸苯海拉明的色譜圖；

圖14為實(shí)施例2測得的標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏的色譜圖；

圖15為實(shí)施例2測得的15批標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)中進(jìn)行分析導(dǎo)出的截圖；

圖16為實(shí)施例2制定得到的麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例1-4對本發(fā)明公開的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明：

實(shí)施例1：不同條件下麝香壯骨膏的供試液的hplc測定

1、儀器與藥品

儀器：waters高效液相色譜儀，2489檢測器。

試藥：磷酸(分析純)；甲醇(色譜級，sigama)；麝香壯骨膏(安科余良卿藥業(yè)有限公司，批號為20160101)；鹽酸苯海拉明對照品(純度99.9％)，批號為100066-200807。

2、方法與結(jié)果

2.1供試液制備

取麝香壯骨膏2片，除去蓋襯，剪成小片，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇40～60ml，稱定重量，回流1小時(shí)，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即為供試液，結(jié)果表明以回流提取的供試液色譜圖較好，如圖1所示，故以下2.2均采用回流提取方法制備供試液進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2色譜條件的選擇

(1)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部干姜藥材項(xiàng)下含測方法色譜條件：采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇-乙腈-水(40:5:55)流動(dòng)相，檢測波長為280nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為280nm時(shí)，色譜峰較少，且分離度不高。如圖2所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(2)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部白芷藥材項(xiàng)下含測方法色譜條件：采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇-水(55：45)為流動(dòng)相，檢測波長為300nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為280nm時(shí)，色譜峰較少，且分離度不高。如圖3所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(3)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部當(dāng)歸藥材項(xiàng)下含測方法的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以乙腈-0.085％磷酸(17：83)為流動(dòng)相，檢測波長為316nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為316nm時(shí)，色譜峰較少。如圖4所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(4)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部白芷藥材項(xiàng)下指紋圖譜檢測的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a，以水為流動(dòng)相b，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為254nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為254nm時(shí)，色譜峰雖然不少多，但分離度很差。如圖5所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(5)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部當(dāng)歸藥材項(xiàng)下指紋圖譜檢測的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a,以0.4％冰醋酸為流動(dòng)相b，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為280nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為280nm時(shí)，色譜峰雖然不少，但分離度很差。如圖6所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(6)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部八角茴香藥材項(xiàng)下指紋圖譜檢測的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm，粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a,以0.05％磷酸為流動(dòng)相b，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為254nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為254nm時(shí)，色譜峰雖然不少，但分離度很差。如圖7所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(7)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部川烏藥材項(xiàng)下含測方法的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以乙腈-四氫呋喃(25:15)為流動(dòng)相a,以o.lmol/l醋酸銨溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)為流動(dòng)相b，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。檢測波長為235nm。在波長為235nm時(shí)，色譜峰較少。如圖8所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(8)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部草烏藥材項(xiàng)下指紋圖譜檢測的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以乙腈-醋酸銨緩沖溶液(2.5‰冰醋酸,用濃氨水調(diào)ph10.5左右)(60∶40)為流動(dòng)相，流速1.0ml/min,檢測波長240nm，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為240nm時(shí)，色譜峰雖然不少，但分離度很差。如圖9所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(9)依據(jù)2015年版《中國藥典》一部關(guān)節(jié)止痛膏項(xiàng)下鹽酸苯海拉明含測方法的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇-1％硫酸銨溶液(47:53)流動(dòng)相，檢測波長為210nm，流速1.0ml/min,，柱溫30℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為210nm時(shí)，色譜峰較少。如圖10所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

(10)依據(jù)壯骨麝香止痛膏指紋圖譜測定方法(申請?zhí)枮閏n101991839a)專利方法，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以0.1％-1％三乙胺的水溶液(磷酸調(diào)ph2.5-4.5)為流動(dòng)相a，以乙腈或乙腈和四氫呋喃的混合溶液為流動(dòng)相b，梯度洗脫；檢測波長為200-300nm，流速1.0ml/min，柱溫30～50℃。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定。在波長為245nm時(shí)，色譜峰較少。如圖11所示，說明采用該色譜條件不能很好的反映樣品的特征信息。

從上述(1)-(10)可以看出，按照以上現(xiàn)有文獻(xiàn)的特征圖譜或指紋圖譜色譜條件方法測定所得的麝香鎮(zhèn)痛膏樣品的hplc圖譜峰較少，不能準(zhǔn)確地反映該品種內(nèi)在質(zhì)量的特征信息。需要說明的是，圖5-9中的峰值數(shù)據(jù)顯示在圖中有交叉重疊的問題，導(dǎo)致數(shù)據(jù)顯示不夠清楚，但是這些附圖主要是說明了采用現(xiàn)有的條件測定得到的圖譜存在缺陷，這些圖并不對本發(fā)明需要保護(hù)的技術(shù)內(nèi)容產(chǎn)生影響，故此處不再對附圖的具體數(shù)據(jù)做出說明。

(12)依據(jù)本發(fā)明公開的色譜條件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a，以0.1％甲酸為流動(dòng)相b，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為280nm，流速為1.0ml/min。精密吸取供試液10μl，注入液相色譜儀中，測定，即得。在波長為280nm時(shí)，色譜峰的分離度高，且在1小時(shí)后色譜峰無明顯變化，如圖12所示，說明采用該色譜條件能夠很好的反映樣品的特征信息。

實(shí)施例2：麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建

1、儀器與藥品

儀器：waters高效液相色譜儀，2489檢測器。

試藥：磷酸(分析純)；甲醇(色譜級，sigama)；由安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司提供的15批標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏，批號分別為20160101、20160501、20160801、20161101、20170101、20170102、20170103、20170301、20170302、20170303、20170304、20170305、20170306、20170401、20170403，上述15批標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏依次編號為s1～s15；鹽酸苯海拉明對照品(純度99.9％)，批號為100066-200807。

2、色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為250mm，內(nèi)徑為4.6mm，粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a，以0.1％甲酸為流動(dòng)相b，流動(dòng)相按體積比為50～80：50～20的a相和b相梯度洗脫，梯度洗脫的時(shí)間及流動(dòng)相比例為：0～50min，a相50％→80％，b相50％→20％；50～60min，a相80％→50％，b相20％→50％，流速0.5ml/min；檢測波長280nm；柱溫30℃；進(jìn)樣液的進(jìn)樣量為10μl；按照鹽酸苯海拉明峰計(jì)算，理論塔板數(shù)≥10000。

3、標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的特征峰的測定

3.1標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建

(1)標(biāo)樣溶液的制備：取15批上述合格的麝香壯骨膏分別進(jìn)行回流提取操作，各麝香壯骨膏的回流提取步驟為：取麝香壯骨膏2片，除去蓋襯，剪成小片，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇40ml，稱定重量，回流1小時(shí)，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即為標(biāo)樣溶液。

(2)參照物溶液的制備：取鹽酸苯海拉明對照品，加甲醇制成每1ml含30μg鹽酸苯海拉明的溶液，濾過，取續(xù)濾液即為參照物溶液。

(3)高效液相色譜分析：精密吸取參照物溶液和標(biāo)樣溶液各10μl，分別注入液相色譜儀中進(jìn)行測定，記錄60分鐘的圖譜，即得鹽酸苯海拉明對照品的色譜圖(見圖13)和標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏的色譜圖(見圖14，為批號為20160101的麝香壯骨膏的色譜圖)。

(4)標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的構(gòu)建

將檢測得到的15批標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，相應(yīng)操作后得到如圖15所示的標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏的特征圖譜，圖15中的r號圖譜為系統(tǒng)生成的對照圖譜，導(dǎo)出即得如圖16所示的標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜。

3.2標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中特征峰的確定

經(jīng)比較15批標(biāo)準(zhǔn)麝香壯骨膏色譜圖和鹽酸苯海拉明的色譜圖，確定麝香壯骨膏的色譜圖中有17個(gè)特征峰，按出現(xiàn)的時(shí)間順序?qū)⑦@17個(gè)特征峰依次編號1～16、s，其中s號色譜峰為鹽酸苯海拉明的特征峰，設(shè)定s號峰的相對保留時(shí)間為1，計(jì)算其他16個(gè)峰的相對保留時(shí)間，結(jié)果如表2所示。經(jīng)計(jì)算，1～16號峰的平均相對保留時(shí)間分別為：0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.46、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92，相對標(biāo)準(zhǔn)差均不超過0.62％。

3.3標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的精密度試驗(yàn)

取麝香壯骨膏(批號為20160101)，按照3.1中步驟(1)公開的方法制備成標(biāo)樣溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到6個(gè)色譜圖，均出現(xiàn)17個(gè)特征峰，設(shè)定鹽酸苯海拉明的特征峰的相對保留時(shí)間為1，計(jì)算6個(gè)色譜圖中其它16個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間。經(jīng)計(jì)算，6個(gè)色譜圖中16個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd≤0.25％。

3.4標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的重復(fù)性試驗(yàn)

取麝香壯骨膏(批號為20160101)6份，按照3.1中步驟(1)公開的方法分別制備成標(biāo)樣溶液，分別檢測得到6個(gè)色譜圖，均出現(xiàn)17個(gè)特征峰，設(shè)定鹽酸苯海拉明的特征峰的相對保留時(shí)間為1，計(jì)算6個(gè)色譜圖中16個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間。經(jīng)計(jì)算，6個(gè)色譜圖中16個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd≤0.12％。

3.5標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取麝香壯骨膏(批號為20160101)，按照3.1中步驟(1)公開的方法制備成標(biāo)樣溶液，精密吸取6份標(biāo)樣溶液，每份10μl，按上述色譜條件分別在0h、1h、2h、4h、8h和12h進(jìn)樣，檢測得到6個(gè)色譜圖，均出現(xiàn)17個(gè)特征峰，設(shè)定鹽酸苯海拉明的特征峰的相對保留時(shí)間為1，計(jì)算6個(gè)色譜圖中16個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間。經(jīng)計(jì)算，6個(gè)色譜圖中16個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd≤0.64％。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明公開的方法構(gòu)建得到的麝香壯骨膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜精密度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，其能全面的反映麝香壯骨膏的化學(xué)信息，進(jìn)而確保該產(chǎn)品的質(zhì)量與療效。

實(shí)施例3：麝香壯骨膏的質(zhì)量檢測

1、儀器與試藥

儀器：waters高效液相色譜儀，2489檢測器。

藥品：磷酸(分析純)；甲醇(色譜級，sigama)；由安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司提供的麝香壯骨膏，批號為20160501；鹽酸苯海拉明對照品(純度99.9％)，批號為100066-200807。

2、色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為250mm，內(nèi)徑為4.6mm,粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a，以0.1％甲酸為流動(dòng)相b，流動(dòng)相按體積比為50～80：50～20的a相和b相梯度洗脫，梯度洗脫的時(shí)間及流動(dòng)相比例為：0～50min，a相50％→80％，b相50％→20％；50～60min，a相80％→50％，b相20％→50％，流速1.5ml/min；檢測波長280nm；柱溫30℃；進(jìn)樣液的進(jìn)樣量為10μl；按照鹽酸苯海拉明峰計(jì)算，理論塔板數(shù)≥10000。

3、特征圖譜中的特征峰的測定

(1)待測溶液的制備：取待測麝香壯骨膏2片，除去蓋襯，剪成小片，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇60ml，稱定重量，回流1.5小時(shí)，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得待測溶液。

(2)參照物溶液的制備：取鹽酸苯海拉明對照品，加甲醇制成每1ml含30μg鹽酸苯海拉明的溶液，濾過，取續(xù)濾液即為參照物溶液。

(3)高效液相色譜分析：精密吸取參照物溶液和待測溶液各10μl，分別注入液相色譜儀中進(jìn)行測定，記錄60分鐘的圖譜，即得鹽酸苯海拉明對照品的色譜圖和待測麝香壯骨膏的色譜圖。待測麝香壯骨膏的色譜圖中共有17個(gè)特征峰，以鹽酸苯海拉明的特征峰的相對保留時(shí)間為1，其1-16號峰的相對保留時(shí)間分別為：0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.48、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92。經(jīng)計(jì)算，待測麝香壯骨膏的色譜圖中的1-16號峰的相對保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中相應(yīng)特征峰的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±5％以內(nèi)，即在規(guī)定范圍內(nèi)，說明該麝香壯骨膏(批號為20160501)的質(zhì)量合格。

實(shí)施例4麝香壯骨膏的質(zhì)量檢測

1、儀器與試藥

儀器：waters高效液相色譜儀，2489檢測器。

藥品：磷酸(分析純)；甲醇(色譜級，sigama)；由安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司提供的麝香壯骨膏，批號分別為20170101；鹽酸苯海拉明對照品(純度99.9％)，批號為100066-200807。

2、色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為250mm，內(nèi)徑為4.6mm，粒徑5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a，以0.1％甲酸為流動(dòng)相b，流動(dòng)相按體積比為50～80：50～20的a相和b相梯度洗脫，梯度洗脫的時(shí)間及流動(dòng)相比例為：0～50min，a相50％→80％，b相50％→20％；50～60min，a相80％→50％，b相20％→50％，流速1.0ml/min；檢測波長280nm；柱溫30℃；進(jìn)樣液的進(jìn)樣量為10μl；按照鹽酸苯海拉明峰計(jì)算，理論塔板數(shù)≥10000。

3、特征圖譜中的特征峰的測定

(1)待測溶液的制備：取待測麝香壯骨膏2片，除去蓋襯，剪成小片，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，回流1小時(shí)，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得待測溶液。

(2)參照物溶液的制備：取鹽酸苯海拉明對照品，加甲醇制成每1ml含30μg鹽酸苯海拉明的溶液，濾過，取續(xù)濾液即為參照物溶液。

(3)高效液相色譜分析：精密吸取參照物溶液和待測溶液各10μl，分別注入液相色譜儀中進(jìn)行測定，記錄60分鐘的圖譜，即得鹽酸苯海拉明對照品的色譜圖和待測麝香鎮(zhèn)痛膏的色譜圖。待測麝香壯骨膏的色譜圖中共有17個(gè)特征峰，以鹽酸苯海拉明的特征峰的相對保留時(shí)間為1，其1-16號峰的相對保留時(shí)間分別為：0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.46、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92。經(jīng)計(jì)算，待測麝香壯骨膏的色譜圖中的1-16號峰的相對保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中相應(yīng)特征峰的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±5％以內(nèi)，即在規(guī)定范圍內(nèi)，說明該麝香壯骨膏(批號為20170101)的質(zhì)量合格。