本發(fā)明涉及應(yīng)用核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)鑒別ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7和k562細(xì)胞差異性標(biāo)志物的方法，屬于¹hnmr的代謝組學(xué)分析技術(shù)。

背景技術(shù)：

代謝組學(xué)：

代謝組學(xué)是鑒定和定量小分子代謝物的分析技術(shù)，通過(guò)現(xiàn)代超高效液相色譜/高分辨質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)分析體液中的代謝物組成譜，利用多變量統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)把所有代謝物的信息整合到一起，在系統(tǒng)和整體層面上比較和分析生物的差異性代謝物的技術(shù)。

目前常用的檢測(cè)儀器有高效液相色譜(hplc)、氣相色譜(gc)、質(zhì)譜(ms)、核磁共振(nmr)、紅外光譜(ir)等，其中核磁共振技術(shù)靈敏度較高，重復(fù)性好，樣品處理簡(jiǎn)便，成本較低，可體外、體內(nèi)檢測(cè)，可對(duì)代謝物變化進(jìn)行定性和定量分析。

維生素c代謝物鑒定現(xiàn)狀：

維生素c(vitaminc)，又名l-抗壞血酸，一種強(qiáng)氧化劑，是許多重要酶的輔因子。根據(jù)who(worldhealthorganization)數(shù)據(jù)表明正常成年人對(duì)維生素c的推薦攝入量(recommendednutrientintakes,rnis)為10mg/day，可耐受最高攝入量(tolerableupperintakelevel,ul)為2000mg/day，目前尚未有利用核磁共振代謝組學(xué)方法同時(shí)研究體外高劑量維生素c對(duì)于正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的影響。已知高劑量維生素c對(duì)癌癥的細(xì)胞毒性比對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性大，但作用機(jī)理未知。目前有文獻(xiàn)利用毛細(xì)管-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(ce-tofms)探究了ic50劑量維生素c對(duì)糖酵解、三羧酸循環(huán)(tca)和磷酸戊糖途徑(ppp)中相關(guān)代謝物的影響，但代謝物變化的生物學(xué)意義尚不清楚；且維生素c誘導(dǎo)的細(xì)胞中代謝物變化情況未知，生物學(xué)意義也未知。

因此，有必要研究維生素c在小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7和慢性髓性白血病胸腔積液淋巴細(xì)胞k562的ic50濃度時(shí)，對(duì)不同細(xì)胞差異性代謝產(chǎn)物以及代謝通路的影響，這有助于進(jìn)一步了解維生素c的亞毒性，對(duì)高劑量維生素c的作用提供一基礎(chǔ)性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞亞毒性的分析方法，包括以下步驟：

(1)確定維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的ic50劑量；

(2)細(xì)胞萃取液的制備：

維生素c組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞在相應(yīng)的維生素cic50劑量下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振預(yù)處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸干后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振檢測(cè)：將核磁共振預(yù)處理后的維生素c組和空白組的上清液進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，獲得細(xì)胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細(xì)胞樣品中代謝物的信號(hào)值；

(5)差異性代謝物的篩選：將細(xì)胞核磁共振譜圖的積分面積進(jìn)行歸一化處理，得到積分面積數(shù)據(jù)，使用偏最小二乘判別(pls-da)和正交-偏最小二乘判別(opls-da)分析數(shù)據(jù)，并采用排列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證篩選差異性變量，選取偏最小二乘判別(pls-da)中第一主成分的變量權(quán)重重要性排序值>0.1的代謝物作為差異性代謝物，并得到差異性代謝物的變化趨勢(shì)；

(6)代謝通路分析：將確定的差異性代謝物導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)中，歸屬出相關(guān)的代謝通路；通過(guò)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件metaboanalyst對(duì)差異性代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，得到由差異性代謝物歸屬出的代謝影響分析通路以及代謝序列富集分析通路，代謝影響分析通路的通路影響值>0.1的代謝通路以及代謝序列富集分析通路的通路影響值<0.1的代謝通路均被識(shí)別為基于維生素c組受到顯著影響的通路；最后從所述受到顯著影響的通路中篩選出具有代表性的代謝途徑。

基于以上ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞亞毒性的分析，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供以下任一應(yīng)用：

(1)促進(jìn)半乳糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(2)抑制谷胱甘肽代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(3)抑制丙酮酸代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(4)抑制果糖和甘露糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(5)抑制糖異生途徑試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(6)促進(jìn)甘油酯代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的癌細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(7)促進(jìn)磷酸肌醇代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(8)抑制甜菜堿代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的差異性代謝物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)確定維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的ic50劑量；

(2)細(xì)胞萃取液的制備：

維生素c組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞在相應(yīng)的維生素cic50劑量下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振預(yù)處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸發(fā)后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振檢測(cè)：將核磁共振預(yù)處理后的維生素c組和空白組的上清液進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，獲得細(xì)胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細(xì)胞樣品中代謝物的信號(hào)值；

(5)差異性代謝物的篩選：

將細(xì)胞核磁共振譜圖的積分面積進(jìn)行歸一化處理，得到積分面積數(shù)據(jù)，使用偏最小二乘判別(pls-da)和正交-偏最小二乘判別(opls-da)分析數(shù)據(jù)，并采用排列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證篩選差異性變量，選取偏最小二乘判別(pls-da)中第一主成分的變量權(quán)重重要性排序值>0.1的代謝物作為差異性代謝物。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的差異性代謝物，包括：

raw264.7細(xì)胞的差異性代謝物為d-葡糖酸-1,5-內(nèi)酯、l-乳酸、甲酸鹽、甘油、乙醇酸鹽、dl-α-甘油磷酸酯、乙酸、山梨糖醇、赤蘚糖醇、肌醇、l-絲氨酸、木糖醇、葡糖酸、甘氨酸、l-半胱氨酸、氧化三甲胺、d-果糖、戊二酸、半胱胺、核糖醇、甲醇、α—酮戊二酸、n,n-二甲基甲酰胺、3-羥基-3-甲基戊二酸和腐胺；

k562細(xì)胞的差異性代謝物為三甲胺、肌醇、赤蘚糖醇、核糖醇、甘油和n,n-二甲基甘氨酸。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：

(1)用¹hnmr的代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)w外細(xì)胞raw264.7和k562細(xì)胞中的差異性代謝物信息進(jìn)行一個(gè)整體的獲得。

¹hnmr可以檢測(cè)到所有含氫原子的代謝產(chǎn)物的信號(hào)，提供所有含氫原子的代謝物的圖譜信息。代謝物是疾病、藥物、食物等與體內(nèi)相互作用的最終體現(xiàn)，代謝組學(xué)方法能夠?qū)⒕S生素c組和空白對(duì)照組的差異性代謝物進(jìn)行鑒定和定量，為探討維生素c與體內(nèi)的相互作用提供借鑒信息。

(2)前處理方法操作簡(jiǎn)單。

本發(fā)明最終確定采用甲醇氯仿水提取法，甲醇、氯仿、超純水的比例為4:4:2.8～2.9，超聲破碎收集水相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后溶于d2o，凍干機(jī)凍干重溶于d2o及磷酸緩沖液即可待測(cè)，方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

(3)數(shù)據(jù)預(yù)處理可靠快捷，可利用網(wǎng)站信息對(duì)差異性代謝物進(jìn)行鑒定和定量。

數(shù)據(jù)預(yù)處理包括傅里葉變換、加指數(shù)窗函數(shù)(提高信噪比)、相位和基線校正、定標(biāo)及去除溶劑峰和其他雜峰、譜峰對(duì)齊、分段積分和面積歸一化等，通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理使數(shù)據(jù)更加規(guī)整，減少水峰的干擾，使后續(xù)更加準(zhǔn)確。利用豐富的網(wǎng)站信息可對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定和定量，結(jié)果相對(duì)更加準(zhǔn)確。

(4)體外條件下探究ic50濃度的維生素c對(duì)細(xì)胞的代謝物產(chǎn)生的影響，并對(duì)差異性代謝物進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，為基礎(chǔ)性研究提供理論基礎(chǔ)。

(5)體外可以達(dá)到人體內(nèi)不能達(dá)到的維生素c濃度，對(duì)于探究高劑量維生素c利弊提供借鑒意義。

(6)ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的差異性代謝物為兩種細(xì)胞的代謝通路分析提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。

圖1是維生素c對(duì)raw264.7細(xì)胞存活率的影響及線性回歸方程，注：**p＜0.01vc組vs空白組。

圖2是維生素c對(duì)k562細(xì)胞存活率的影響及線性回歸方程，注：**p＜0.01vc組vs空白組。

圖3是raw264.7細(xì)胞vc組和空白組的pca得分圖。

圖4是raw264.7細(xì)胞vc組和空白組的pls-da得分圖。

圖5是raw264.7細(xì)胞vc組和空白組pls-da分析的置換排列驗(yàn)證圖。

圖6是raw264.7細(xì)胞vc組和空白組opls-da得分圖。

圖7是raw264.7細(xì)胞vc組和空白組¹hnmr譜圖。

圖8(a)是raw264.7細(xì)胞中由差異性代謝產(chǎn)物歸屬出的代謝通路，1.氰基氨基酸代謝；2.乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝；3.甲烷代謝；4.丙酮酸代謝；5.三羧酸循環(huán)；6.賴氨酸降解；7.丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；8.酪氨酸代謝；9.丁酸代謝；10.?；撬岷蛠喤；撬岽x；11.硫代謝；12.維生素b6代謝；13.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成；14.硒氨基酸代謝；15.氮代謝；16.脂肪酸代謝；17.d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代謝；18.氨酰trna的生物合成；19.硫胺代謝；20.脂肪酸在線粒體中的延長(zhǎng)；21.糖酵解或糖異生；22.賴氨酸生物合成；23.泛醌和其他萜醌類生物合成；24.葉酸生物合成；25.苯丙氨酸代謝；26.組氨酸代謝；27.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變；28.半胱氨酸和甲硫氨酸代謝。

圖8(b)是raw264.7細(xì)胞代謝產(chǎn)物組富集概述圖，由上至下分別為：蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、氨循環(huán)、?；撬岷蛠喤；撬岽x、谷胱甘肽代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝、糖異生、半胱氨酸代謝、蘋果酸-天冬氨酸代謝、泛酸和輔酶a的生物合成、葡萄糖-丙氨酸循環(huán)、甘油脂代謝、淀粉和蔗糖代謝、鞘脂代謝、戊糖磷酸途徑、谷氨酸代謝、肌醇代謝、蛋白質(zhì)生物合成、尿素循環(huán)、卟啉代謝、檸檬酸循環(huán)和膽汁酸生物合成。

圖9是k562細(xì)胞vc組和對(duì)照組的pca得分圖。

圖10是k562細(xì)胞vc組和對(duì)照組的pls-da得分圖。

圖11是k562細(xì)胞vc組和空白組pls-da分析的置換排列驗(yàn)證圖。

圖12是k562細(xì)胞vc組和對(duì)照組的opls-da得分圖

圖13是k562細(xì)胞vc組和對(duì)照組¹hnmr譜圖。

圖14(a)是k562細(xì)胞中由差異性代謝產(chǎn)物歸屬出的代謝通路，1.甘油脂代謝；2.肌醇磷酸代謝；3.甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝；4.半乳糖代謝；5.核黃素代謝；6.甲烷代謝；7.維生素c代謝；8.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變。

圖14(b)是k562細(xì)胞代謝產(chǎn)物組富集概述圖，由上至下分別為：半乳糖代謝、甜菜堿代謝、甘油脂代謝、肌醇代謝、蛋氨酸代謝和甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

本發(fā)明對(duì)術(shù)語(yǔ)的解釋：

亞毒性：是指具有毒性或有小毒而未列入國(guó)務(wù)院《醫(yī)療用毒性藥品管理法》規(guī)定的有毒中藥品種，臨床使用過(guò)量或應(yīng)用不當(dāng)會(huì)中毒或產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng),應(yīng)用或藥房管理上需加以注意。

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)：是指被測(cè)量的拮抗劑的半抑制濃度

raw264.7：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，也是常用的炎癥細(xì)胞模型之一。

k562：人慢性髓性白血病胸腔積液淋巴細(xì)胞。

topspin3.2：一種核磁分析軟件。

simca-p軟件：多元分析軟件。

pca：主成分分析(principalcomponentsanalysis)，是一種無(wú)監(jiān)督的模式統(tǒng)計(jì)方法。通過(guò)正交變換將一組可能存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的變量，轉(zhuǎn)換后的這組變量叫主成分。

pls-da：偏最小二乘判別(partialleastsquaresprojectiontolatentstructure-discriminantanalysis)，是一種有監(jiān)督的模式統(tǒng)計(jì)方法，利用偏最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行投影分析。

opls-da：正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal-pls-da)，將正交信號(hào)校正方法(orthogonalsignalcorrection,osc)與pls-da進(jìn)行結(jié)合從而對(duì)pls-da進(jìn)行修正的分析方法。

京都基因和基因組百科全書(shū)(kegg)：是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。

metaboanalyst：是一種代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站，能夠由差異性代謝產(chǎn)物歸屬出代謝通路。

正如背景技術(shù)中所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7和k562細(xì)胞的影響分析方法，針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目標(biāo)是采用半抑制濃度(ic50)維生素c處理raw264.7細(xì)胞和k562細(xì)胞兩種細(xì)胞系，利用核磁共振氫譜分析比較兩種細(xì)胞系在代謝水平的變化。針對(duì)此，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提出一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞亞毒性的分析方法，該方法包括以下步驟：

(1)確定維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的ic50劑量；

采用mtt法確定維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的ic50劑量，其中，raw264.7的ic50為920mm，k562的ic50為800mm。

(2)細(xì)胞萃取液的制備：

維生素c組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞在相應(yīng)的維生素cic50劑量下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

在制備細(xì)胞萃取液的過(guò)程中，針對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞這兩種細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和成分，為了保證盡可能多的獲取維生素c組細(xì)胞和空白組細(xì)胞代謝物信息，提取試劑優(yōu)先選用的是甲醇、氯仿和超純水的混合溶劑，對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行多次超聲破碎提取，提取后即可進(jìn)行核磁共振預(yù)處理，前處理步驟簡(jiǎn)單，易于操作。

為達(dá)到較好的提取代謝物的效果、更有利于提高后續(xù)差異性代謝物、代謝通路分析的準(zhǔn)確性，本發(fā)明采用的提取劑為甲醇、氯仿和超純水的混合溶液，體積比例為4:4:2.8～2.9，在本發(fā)明的優(yōu)選的技術(shù)方案中，甲醇、氯仿和超純水的體積比例為4:4:2.85。

(3)核磁共振預(yù)處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸發(fā)后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

核磁共振待測(cè)樣品制備階段，樣品的預(yù)處理方法會(huì)對(duì)核磁共振檢測(cè)結(jié)果和主成分分析的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，由于代謝組學(xué)需要高通量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，必須保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可比較性，基于對(duì)核磁共振檢測(cè)影響，本發(fā)明建立了針對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞萃取液的預(yù)處理方法。故在本發(fā)明的優(yōu)選的技術(shù)方案中，核磁共振預(yù)具體的處理方法是：將維生素c組和空白組的水相蒸干后用900μl含有0.1％(w/w)tsp的d2o溶解，離心后取上清液凍干，將凍干的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解至650μl，離心后取上清液至核磁管中，待測(cè)。

(4)核磁共振檢測(cè)：將核磁共振預(yù)處理后的維生素c組和空白組的上清液進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，獲得細(xì)胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細(xì)胞樣品代謝物的信號(hào)值，該信號(hào)值指的是不同化學(xué)位移處的核磁信號(hào)，每個(gè)信號(hào)峰既包含了代謝物的定性信息，也包含了定量信息，定性信息就是該代謝物的特征譜圖和化學(xué)位移，定量信息就是該代謝物的核磁響應(yīng)強(qiáng)度，如峰高、峰面積；

核磁共振樣品檢測(cè)階段中，核磁共振的檢測(cè)參數(shù)對(duì)核磁共振檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，代謝組學(xué)是一種需要高通量試驗(yàn)數(shù)據(jù)的技術(shù)，必須保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，本發(fā)明篩選優(yōu)化得到一套針對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞萃取液的核磁共振檢測(cè)條件。所有的核磁共振氫譜都采用配備了¹³c、¹h雙優(yōu)化5mmcptci三共振反式超低溫探頭的iii600mhz超導(dǎo)超屏蔽傅立葉變換核磁共振波譜儀檢測(cè)。其中質(zhì)子共振頻率為600.104mhz，脈沖序列為zg30，譜寬為12019.230hz，累加次數(shù)為256次，空采次數(shù)為2次，實(shí)驗(yàn)溫度為298k，使用topspin3.2(brukerbiospin,germany)處理譜圖。

(5)差異性代謝物的篩選：核磁共振譜圖使用mestrenova6.11(mestrelabresearch,espain)處理，所有譜圖添加指數(shù)窗函數(shù)(exponential:0.5)，以提高信噪比。手動(dòng)相位矯正，基線矯正后，用tsp定標(biāo)，手動(dòng)切除水峰，選取0.002ppm為間隔標(biāo)準(zhǔn)分段積分，這一間隔標(biāo)準(zhǔn)能夠提高細(xì)胞萃取液譜峰的識(shí)別度，減小核磁共振譜峰重疊引起的誤差，之后對(duì)譜圖積分面積進(jìn)行歸一化。積分面積數(shù)據(jù)以excel文件保存，分組編號(hào)。之后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入simca-p+12.0軟件(umetricsinc.,umea,sweden)中。使用偏最小二乘判別分析(pls-da)分析數(shù)據(jù)。為了確保pls-da模型建立的可信性，運(yùn)用排列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證篩選差異性變量。根據(jù)第一主成分的變量權(quán)重重要性排序值(vip)和載荷權(quán)重(loadingweights)確定差異性代謝產(chǎn)物。選取在偏最小二乘判別分析(pls-da)中vip值大于1的物質(zhì)，判定為差異性代謝產(chǎn)物。載荷權(quán)重的正負(fù)代表相關(guān)差異性代謝產(chǎn)物在空白組與維生素c組中的上下調(diào)關(guān)系。最后通過(guò)人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(hmdb)以及生物核磁共振數(shù)據(jù)庫(kù)(bmrb)進(jìn)行定性分析，得到差異性代謝產(chǎn)物的種類名稱。

(6)代謝通路分析：將確定的差異性代謝產(chǎn)物導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書(shū)(kegg)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得kegg號(hào)，然后metaboanalyst(metpa)中進(jìn)行通路富集分析，得到由差異性代謝物歸屬出的代謝影響分析通路以及代謝序列富集分析通路，代謝影響分析通路的通路影響值>0.1的代謝通路和代謝序列富集分析通路的通路影響值<0.1的代謝通路均被識(shí)別為基于維生素c組受到顯著影響的通路；最后從所述受到顯著影響的通路中篩選出具有代表性的代謝途徑。

篩選具有代表性的代謝途徑時(shí)，將各種氨基酸、?；撬岷蛠喤；撬?、乙醛酸鹽、二羧酸鹽代謝、甲烷代謝、氨循環(huán)等代謝途徑排除，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞受到ic50劑量維生素c作用時(shí)，上述的代謝途徑均為常規(guī)的代謝途徑(或者屬于細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝途徑)，并不可以作為代表性的代謝途徑。

基于以上ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞亞毒性的分析研究，本發(fā)明的第二個(gè)方面，提出下述任一應(yīng)用：

(1)促進(jìn)半乳糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(2)抑制谷胱甘肽代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(3)抑制丙酮酸代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(4)抑制果糖和甘露糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(5)抑制糖異生途徑試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(6)促進(jìn)甘油酯代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的癌細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(7)促進(jìn)磷酸肌醇代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用；

(8)抑制甜菜堿代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細(xì)胞亞毒性的試劑中的應(yīng)用。

其中，促進(jìn)半乳糖代謝試劑為能夠促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞半乳糖代謝的試劑，使得細(xì)胞內(nèi)的半乳糖的含量降低。

抑制谷胱甘肽代謝的試劑為能夠抑制體內(nèi)細(xì)胞谷胱甘肽代謝的試劑，使得細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的含量增加。

抑制丙酮酸代謝試劑為能夠抑制體內(nèi)細(xì)胞丙酮酸代謝的試劑，使得細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸的含量增加。

抑制果糖和甘露糖代謝試劑為能夠抑制體內(nèi)細(xì)胞果糖和半乳糖代謝的試劑，使得細(xì)胞中的果糖和甘露糖的含量增加。

抑制糖異生途徑試劑為能夠抑制體內(nèi)細(xì)胞糖異生途徑發(fā)生的試劑，使得細(xì)胞中的非糖前體(例如：乳酸、甘油、生糖氨基酸等)的含量增加。

促進(jìn)甘油酯代謝試劑為能夠促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞甘油酯代謝的試劑，使得細(xì)胞中的甘油酯的含量增加。

促進(jìn)磷酸肌醇代謝試劑為能夠促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞磷酸肌醇代謝的試劑，使得細(xì)胞中的磷酸肌醇的含量增加。

抑制甜菜堿代謝試劑為能夠促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞甜菜堿代謝的試劑，使得細(xì)胞中的甜菜堿的含量降低。

所述的正常細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7，所述的癌細(xì)胞為人白血病淋巴細(xì)胞k562。

本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的差異性代謝物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)確定維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的ic50劑量；

(2)細(xì)胞萃取液的制備：

維生素c組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞在相應(yīng)的維生素cic50劑量下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細(xì)胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后加入冷甲醇使細(xì)胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進(jìn)行超聲破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振預(yù)處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸發(fā)后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振檢測(cè)：將核磁共振預(yù)處理后的維生素c組和空白組的上清液進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，獲得細(xì)胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細(xì)胞樣品中代謝物的信號(hào)值；

(5)差異性代謝物的篩選：

將細(xì)胞核磁共振譜圖的積分面積進(jìn)行歸一化處理，得到積分面積數(shù)據(jù)，使用偏最小二乘判別(pls-da)和正交偏最小二乘判別分析(opls-da)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用排列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證篩選差異性變量，選取偏最小二乘判別(pls-da)中第一主成分的變量權(quán)重重要性排序值>0.1的代謝物作為差異性代謝物。

每一步的具體技術(shù)方案可參照本發(fā)明的第一個(gè)方面。

本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的差異性代謝物，包括：

raw264.7細(xì)胞的差異性代謝物為d-葡糖糖酸-1,5-內(nèi)酯、乳酸、甲酸、甘油、乙醇酸、dl-α-甘油磷酸、乙酸、山梨糖醇、赤蘚糖醇、肌醇、l-絲氨酸、木糖醇、葡糖酸、甘氨酸、半胱氨酸、氧化三甲胺、d-果糖、戊二酸、半胱胺、核糖醇、甲醇、α—酮戊二酸、n,n-二甲基甲酰胺、3-羥基-3-甲基戊二酸和腐胺；

k562細(xì)胞的差異性代謝物為三甲胺、肌醇、赤蘚糖醇、核糖醇、甘油和二甲基甘氨酸。

ic50劑量維生素c對(duì)raw264.7或k562細(xì)胞的差異性代謝物為兩種細(xì)胞的代謝通路分析提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的主要技術(shù)創(chuàng)新

(1)用¹hnmr的代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)w外細(xì)胞raw264.7和k562細(xì)胞中的差異性代謝物信息進(jìn)行一個(gè)整體的獲得。

¹hnmr可以檢測(cè)到所有含氫原子的代謝產(chǎn)物的信號(hào)，提供所有含氫原子的代謝物的圖譜信息。代謝物是疾病、藥物、食物等與體內(nèi)相互作用的最終體現(xiàn)，代謝組學(xué)方法能夠?qū)⒕S生素c組和對(duì)照組的差異性代謝物進(jìn)行鑒定和定量，為探討維生素c與體內(nèi)的相互作用提供借鑒信息。

(2)前處理方法操作簡(jiǎn)單。

本發(fā)明最終確定采用甲醇氯仿水提取法，甲醇、氯仿、超純水的比例為4:4:2.8～2.9，超聲破碎收集水相。前處理步驟簡(jiǎn)單，易于操作。

核磁共振預(yù)處理方法操作簡(jiǎn)單，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后溶于d2o，凍干機(jī)凍干重溶于d2o及磷酸緩沖液即可待測(cè)，方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。從主成分分析的分析結(jié)果可知，通過(guò)該核磁共振預(yù)處理方法，主成分分析模型擬合的較好，模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高，同組內(nèi)差異性較小，不同組的樣品分離更加明顯。

(3)數(shù)據(jù)預(yù)處理可靠快捷，可利用網(wǎng)站信息對(duì)差異性代謝物進(jìn)行鑒定和定量。

數(shù)據(jù)預(yù)處理包括傅里葉變換、加指數(shù)窗函數(shù)(提高信噪比)、相位和基線校正、定標(biāo)及去除溶劑峰和其他雜峰、譜峰對(duì)齊、分段積分和面積歸一化等，通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理使數(shù)據(jù)更加規(guī)整，減少水峰的干擾，使后續(xù)更加準(zhǔn)確。利用豐富的網(wǎng)站信息可對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定和定量，結(jié)果相對(duì)更加準(zhǔn)確。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

1、方法原理

高濃度劑量的維生素c作用于細(xì)胞后會(huì)影響細(xì)胞的代謝水平，使細(xì)胞內(nèi)代謝物種類和濃度發(fā)生改變，通過(guò)利用¹hnmr技術(shù)可以將維生素c處理后和對(duì)照組的差異性代謝物進(jìn)行鑒定，然后利用代謝組學(xué)分析技術(shù)對(duì)所得的數(shù)據(jù)應(yīng)用pca、pls-da、opls-da等技術(shù)進(jìn)行分析，尋找差異性代謝物。通過(guò)人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(hmdb)以及生物核磁共振數(shù)據(jù)庫(kù)(bmrb)進(jìn)行定性分析，確定差異性代謝物的種類名稱。將確定的差異性代謝產(chǎn)物導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書(shū)(kegg)數(shù)據(jù)庫(kù)以及metaboanalyst(metpa)中進(jìn)行通路富集分析。

2、儀器與材料

儀器與設(shè)備：

statfax-2000酶標(biāo)儀美國(guó)awareness公司

labservco2培養(yǎng)箱美國(guó)thermofisher公司

epsilon2-4lscplus凍干機(jī)德國(guó)christ公司

5804r高速冷凍離心機(jī)德國(guó)eppendorf公司

sb-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本eyela公司

vc130pb細(xì)胞超聲波破碎儀美國(guó)sonic公司

avanceiii600mhz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振波譜儀德國(guó)bruker公司

材料與試劑：

raw264.7細(xì)胞上海中科院細(xì)胞庫(kù)

k562細(xì)胞上海中科院細(xì)胞庫(kù)

維生素c(純度≥98％)美國(guó)sigma公司

含有0.1％tsp的d2o美國(guó)sigma公司

dmem培養(yǎng)基美國(guó)hyclone公司

rpmi1640培養(yǎng)基美國(guó)hyclone公司

二甲基亞砜北京solarbio公司

雙抗試劑、谷氨酰胺試劑北京邁晨公司

胎牛血清杭州四季青公司

3、樣品前處理

首先利用mtt實(shí)驗(yàn)分別確定維生素c作用于raw264.7細(xì)胞和k562細(xì)胞的ic50濃度，分別用ic50濃度的維生素c處理細(xì)胞24小時(shí)，處理后用冷甲醇使細(xì)胞代謝猝滅；然后按甲醇：氯仿：超純水為4:4:2.85的體積比例即甲醇氯仿水提取法收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲破碎收集水相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清蒸干后溶于含有0.1％tsp的d2o，12000rpm，4℃離心取上清，凍干機(jī)凍干后重溶于650μld2o和d2o配制的磷酸緩沖液中，12000rpm，4℃離心15min后，取550μl上清加入5mm核磁管中，待核磁檢測(cè)。

4、核磁共振檢測(cè)

所有¹hnmr譜都采用配備¹³c、¹h雙優(yōu)化5mmcptci三共振反式超低溫探頭的avance600ⅲ(bruker)超導(dǎo)超屏蔽傅立葉變換核磁共振波譜儀檢測(cè)。其中，質(zhì)子共振頻率為600.104mhz，采用zg30脈沖序列，譜寬(swh)為12019.230hz，累加次數(shù)(ns)為256次，空采次數(shù)(ds)為2次，實(shí)驗(yàn)溫度(te)為298k，使用topspin3.2(brukerbiospin,germany)處理譜圖。

5、成果展示

(1)mtt法確定維生素c對(duì)raw264.7細(xì)胞和k562細(xì)胞的ic50作用濃度。

為了確定維生素c對(duì)raw264.7和k562細(xì)胞活性的影響，本發(fā)明用含有不同濃度維生素c的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，細(xì)胞活性的影響如圖1和2所示。mtt實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維生素c處理細(xì)胞24h后有明顯抑制作用，并且確定了兩種細(xì)胞不同的ic50濃度。

根據(jù)圖1，巨噬細(xì)胞raw264.7經(jīng)mtt法最終確定的維生素c的ic50作用濃度為920mmol/l(21.528g/130ml)。

根據(jù)圖2，白血病細(xì)胞k562經(jīng)mtt法最終確定的維生素c的ic50作用濃度為800mmol/l(8.64g/30ml)。

(2)核磁共振譜圖分析

根據(jù)raw264.7和k562兩種細(xì)胞水相萃取物的核磁共振氫譜譜圖，能夠確定相應(yīng)的差異性代謝產(chǎn)物并進(jìn)一步進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。兩種細(xì)胞系各自維生素c組和空白組的核磁共振譜圖如圖7和13所示。從譜圖中可見(jiàn)，維生素c組和空白組相比，兩者的信號(hào)峰具有較大的差異，這預(yù)示著維生素c組和空白組中的具有差異性代謝物，而且代謝物的種類非常多。

(3)多元統(tǒng)計(jì)分析

將核磁共振譜圖使用mestrenova6.11(mestrelabresearch,espain)處理，所有譜圖添加指數(shù)窗函數(shù)(exponential:0.5)，以提高信噪比。手動(dòng)相位矯正，基線矯正后，用tsp定標(biāo)，手動(dòng)切除水峰，選取0.002ppm為間隔標(biāo)準(zhǔn)分段積分，之后對(duì)譜圖積分面積進(jìn)行歸一化。積分面積數(shù)據(jù)以excel文件保存，分組編號(hào)。之后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入simca-p+12.0軟件(umetricsinc.,umea,sweden)中。使用主成分分析(pls-da)和正交偏最小二乘判別分析(opls-da)分析數(shù)據(jù)。為了確保pls-da和opls-da模型建立的可信性，運(yùn)用排列實(shí)驗(yàn)和cv-anova進(jìn)行驗(yàn)證篩選差異性變量。根據(jù)第一主成分的變量權(quán)重重要性排序值(vip)和載荷權(quán)重(loadingweights)確定差異性代謝產(chǎn)物。選取在偏最小二乘判別分析(pls-da)中vip值大于1的物質(zhì)，判定為差異性代謝產(chǎn)物。載荷權(quán)重的正負(fù)代表相關(guān)差異性代謝產(chǎn)物在空白組與維生素c組中的上下調(diào)關(guān)系。最后通過(guò)人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(hmdb)以及生物核磁共振數(shù)據(jù)庫(kù)(bmrb)進(jìn)行定性分析，得到差異性代謝產(chǎn)物的種類名稱，如表1和表2。

取vip≥1的化學(xué)位移。其中vip值越大對(duì)差異性分組貢獻(xiàn)越大。兩種細(xì)胞系的化學(xué)位移確定的差異性代謝產(chǎn)物以及比較差異性代謝產(chǎn)物的上下調(diào)程度見(jiàn)表1和表2。

表1raw264.7細(xì)胞系差異性代謝物

表2k562細(xì)胞系差異性代謝物

simca-p軟件中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析的pca和pls－da分析結(jié)果表明，對(duì)于raw264.7和k562細(xì)胞，維生素c組和空白組能夠分開(kāi)。兩種細(xì)胞的pca得分圖(圖3和圖9)和載荷圖表明，兩種細(xì)胞經(jīng)過(guò)維生素c處理后都有各自的差異性代謝產(chǎn)物。

首先，使用pca模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，提取數(shù)據(jù)集中的大部分信息觀察空白組和維生素c組的自然分組狀況。結(jié)果顯示對(duì)于raw264.7細(xì)胞來(lái)說(shuō)，維生素c組和空白組能夠從第一主成分和第二主成分上明顯區(qū)分。同樣地，k562的維生素c組和空白組也能在其第一主成分和第二主成分上有良好的區(qū)分。pca作為無(wú)師監(jiān)督的分析方法，只能反應(yīng)數(shù)據(jù)的原始狀況。但是，在實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作中存在許多因子影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，例如環(huán)境或某些系統(tǒng)性錯(cuò)誤。為了獲取更為準(zhǔn)確的分組情況，盡可能排除這些外在影響因子，我們使用有師監(jiān)督的分析方法pls-da和opls-da處理數(shù)據(jù)。巨噬細(xì)胞raw264.7和k562細(xì)胞的pls-da得分圖中vc組和對(duì)照組都能發(fā)生明顯區(qū)分，見(jiàn)圖4和圖10。通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證模型的有效性，觀察兩個(gè)細(xì)胞系的排列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，如圖5和圖11所示，結(jié)果表明raw264.7(r²x＝0.891，r²y＝0.972，q²＝0.939)，無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象，具有較好的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)能力。k562細(xì)胞系建立的pls-da模型擬合的也較好(r²x＝0.98，r²y＝0.989，q²＝0.978)，無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象，也具有較好的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)能力。

利用opls-da分析建立raw264.7細(xì)胞的模型，根據(jù)得分圖(圖6)發(fā)現(xiàn)空白組和維生素c組能夠最大程度的得到區(qū)分并且能夠降低組內(nèi)差異。k562細(xì)胞建立opls-da模型，對(duì)其得分圖(圖12)觀察發(fā)現(xiàn)也能夠很好的區(qū)分。

(4)代謝通路分析

為了研究維生素c作用于raw264.7和k562細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)志物的代謝通路，本發(fā)明將篩選得到的差異性代謝物通過(guò)kegg數(shù)據(jù)庫(kù)確定kegg號(hào)，然后再通過(guò)metaboanalyst(metpa)(網(wǎng)址：http://www.metaboanalyst.ca/)歸屬出這些差異性代謝物的代謝通路，從而探究差異性代謝物與代謝通路之間的相互作用關(guān)系。metpa能夠根據(jù)代謝信息數(shù)據(jù)庫(kù)(kegg)得到相應(yīng)代謝物的kegg序列號(hào)(keggid)，利用計(jì)算機(jī)自動(dòng)對(duì)不同代謝物的生化變化進(jìn)行分組，從而尋找出相關(guān)度最高的代謝通路和疾病。一種是路徑分析，即整合富集分析和路徑拓?fù)浞治?，該模型能夠?qū)?1種模式生物進(jìn)行可視化分析。所得結(jié)果以通路影響特性作為橫坐標(biāo)，代表代謝通路富集重要性的-logp值為縱坐標(biāo)，計(jì)算代謝通路重要性的拓?fù)浞治鲞M(jìn)行作圖。代謝途徑影響的-logp值越大，不同分組之間的代謝相關(guān)性越高。兩種細(xì)胞得到的路徑分析圖見(jiàn)圖7和11。另一種是對(duì)人類和哺乳動(dòng)物的代謝物組富集分析(msea)，基于數(shù)據(jù)庫(kù)中的大約6300組代謝物組進(jìn)行的通路歸屬分析。本實(shí)驗(yàn)選取表征分析(overrepresentaionanalysis,ora)作為富集分析算法，該方法只需要將對(duì)應(yīng)化合物的kegg序列號(hào)導(dǎo)入即可進(jìn)行后續(xù)分析。該模型通過(guò)傳統(tǒng)的特征選擇方法或是聚類算法檢測(cè)有意義的生物模式。

將raw264.7的25種差異性代謝物和k562的6種差異性代謝物分別導(dǎo)入metpa軟件中，通過(guò)兩種數(shù)據(jù)庫(kù)歸屬代謝通路。raw264.7細(xì)胞相關(guān)的25個(gè)差異性代謝產(chǎn)物歸屬出28條代謝通路，包括：1.氰基氨基酸代謝；2.乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝；3.甲烷代謝；4.丙酮酸代謝；5.三羧酸循環(huán)；6.賴氨酸降解；7.丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；8.酪氨酸代謝；9.丁酸代謝；10.牛磺酸和亞?；撬岽x；11.硫代謝；12.維生素b6代謝；13.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成；14.硒氨基酸代謝；15.氮代謝；16.脂肪酸代謝；17.d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代謝；18.氨酰trna的生物合成；19.硫胺代謝；20.脂肪酸在線粒體中的延長(zhǎng)；21.糖酵解或糖異生；22.賴氨酸生物合成；23.泛醌和其他萜醌類生物合成；24.葉酸生物合成；25.苯丙氨酸代謝；26.組氨酸代謝；27.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變；28.半胱氨酸和甲硫氨酸代謝。而k562細(xì)胞相關(guān)的6個(gè)生物標(biāo)記物歸屬出8條相關(guān)代謝通路，包括：1.甘油脂代謝；2.肌醇磷酸代謝；3.甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝；4.半乳糖代謝；5.核黃素代謝；6.甲烷代謝；7.維生素c代謝；8.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變。

raw264.7細(xì)胞差異代謝物的通路富集分析顯示經(jīng)ic50劑量vc處理后，細(xì)胞代謝的改變途徑主要集中在蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、氨循環(huán)、?；撬峒皝喤；撬岽x、果糖和甘露糖的降解、谷胱甘肽代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝、糖異生、半胱氨酸代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭、泛酸和輔酶a的生物合成、葡萄糖-丙氨酸循環(huán)、甘油酯代謝、淀粉和蔗糖的代謝、鞘脂代謝、戊糖磷酸途徑、谷氨酸代謝、肌醇代謝、蛋白質(zhì)合成、尿素循環(huán)、卟啉代謝、檸檬酸循環(huán)、膽酸生物合成，共25種信號(hào)通路。

raw264.7細(xì)胞信號(hào)通路影響分析結(jié)果與通路富集分析結(jié)果綜合來(lái)看，兩者在蛋氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝、糖異生、三羧酸循環(huán)和谷氨酸代謝中共發(fā)生代謝通路的改變。其中在信號(hào)通路分析中存在顯著性差異的有氰基氨基酸代謝、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、甲烷代謝和丙酮酸代謝(如圖8(a)所示，pi值大于0.1)。蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、氨循環(huán)、?；撬岷蛠喤；撬岽x、谷胱甘肽代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝和糖異生在信號(hào)通路富集分析中存在顯著性差異(如圖8(b)所示，pvalue值小于0.1，圖中5e-03代表5×10^-3)。

報(bào)道表明甲烷的產(chǎn)生與氧化還原調(diào)節(jié)有關(guān)，且在抗壞血酸存在下由膽堿形成甲烷，ic50濃度維生素c作用細(xì)胞后，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞缺氧從而導(dǎo)致甲烷產(chǎn)生。丙酮酸對(duì)于真核生物和人類新陳代謝的許多方面是一個(gè)重要的分子，線粒體丙酮酸代謝由許多酶調(diào)節(jié)，其中在應(yīng)激條件下代謝物乙酸能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酯化誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，未解離的乙酸穿透細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層酯化內(nèi)環(huán)境而誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，因此細(xì)胞在ic50濃度維生素c作用后，乙酸含量上升丙酮酸代謝發(fā)生顯著性差異；蛋氨酸是細(xì)胞存活的必需氨基酸，在蛋氨酸循環(huán)中檢測(cè)出一種甜菜堿同型半胱氨酸-s-甲基轉(zhuǎn)移酶，該酶在維持蛋氨酸水平和滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮雙重作用，蛋氨酸代謝酶的變化能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中atpase和adpase活性的增加，因此蛋氨酸代謝的改變對(duì)于細(xì)胞維持滲透壓平衡和正常生命狀態(tài)有關(guān)；半乳糖與誘導(dǎo)細(xì)胞衰老有關(guān)，但誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，似乎與葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，d-半乳糖通過(guò)4種酶催化反應(yīng)代謝為丙酮酸和d-甘油醛-3-磷酸，這與ic50劑量維生素c作用后導(dǎo)致的果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝、甘油脂代謝等變化是相符的；據(jù)報(bào)道?；撬岚l(fā)揮許多生理功能，包括膜穩(wěn)定，滲透調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)作用，抗氧化和抗炎作用以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和離子通道功能，能夠影響多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的線粒體功能、細(xì)胞凋亡以及抗氧化防御；已有研究表明?；撬崮軌蜃鳛樯窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，這意味著在raw264.7細(xì)胞中亞?；撬峤档秃铣闪烁嗟呐；撬?，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞在ic50濃度維生素c作用時(shí)發(fā)生凋亡，且?；撬岬母淖兺茰y(cè)也與細(xì)胞滲透壓的變化有關(guān)；細(xì)胞可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞外的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)而代謝成半胱氨酸，這是半胱氨酸代謝中代謝物濃度增高的一個(gè)原因，有研究表明丙氨酸能夠拮抗?；撬岬霓D(zhuǎn)運(yùn)，因此丙氨酸代謝也隨之發(fā)生變化。氧化三甲胺(tmao)主要被認(rèn)為是膽堿代謝的廢物，許多研究表明tmao參與許多生物體的重要生物學(xué)功能，例如細(xì)胞使用tmao以在滲透壓和靜水壓力的條件下維持細(xì)胞體積，所以當(dāng)ic50濃度維生素c作用細(xì)胞后，tmao在維持細(xì)胞正常體積方面發(fā)揮部分作用；谷胱甘肽在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷、異質(zhì)親電子毒性及維持氧化還原穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，是細(xì)胞中合成的低分子量抗氧化劑，ic50濃度維生素c作用巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)發(fā)生變化，谷胱甘肽為維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)而發(fā)生顯著性變化；在巨噬細(xì)胞raw264.7的代謝障礙過(guò)程中還涉及了糖異生、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、氨循環(huán)的顯著性差異，該代謝通路的改變是細(xì)胞應(yīng)激時(shí)會(huì)發(fā)生的正常的變化。每種代謝通路顯著性變化的具體意義仍然需要進(jìn)一步研究，以明確各自分子機(jī)制。

k562細(xì)胞差異代謝物的通路富集分析顯示經(jīng)ic50劑量維生素c處理后，細(xì)胞代謝的改變途徑主要集中在蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、甜菜堿代謝、甘油酯代謝、肌醇代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝，共6種信號(hào)通路。k562細(xì)胞信號(hào)通路影響分析結(jié)果與通路富集分析結(jié)果綜合來(lái)看，兩者在半乳糖代謝、甘油酯代謝、肌醇代謝和甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝中都發(fā)生顯著變化。在信號(hào)通路分析中發(fā)生顯著性變化的代謝通路有甘油脂代謝和肌醇磷酸代謝(如圖14(a)所示，pi值大于0.1)；信號(hào)通路富集分析中半乳糖代謝、甜菜堿代謝和甘油脂代謝存在顯著性差異(如圖14(b)所示，pvalue值小于0.1，圖中1e-02代表1×10^-2)。

研究發(fā)現(xiàn)磷酸肌醇代謝途徑的成員能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和磷脂酰肌醇-3-激酶/akt的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，ic50濃度維生素c作用k562細(xì)胞后，肌醇含量顯著下降，不利于細(xì)胞膜雙層結(jié)構(gòu)的維持、細(xì)胞滲透性和代謝穩(wěn)態(tài)的維持；半乳糖代謝中甘油和肌醇表達(dá)量下降表明維生素c也加速了細(xì)胞的衰老過(guò)程；二甲基甘氨酸表達(dá)量上升導(dǎo)致甜菜堿代謝發(fā)生顯著差異，這對(duì)于維持細(xì)胞滲透壓的平衡具有重要意義，且甜菜堿作為蛋氨酸循環(huán)中的甲基供體，導(dǎo)致蛋氨酸代謝也發(fā)生相同的變化趨勢(shì)；遺傳和生物化學(xué)分析顯示，甘油脂在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程起重要作用，其生物合成的調(diào)節(jié)對(duì)于細(xì)胞脂質(zhì)存儲(chǔ)和膜穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，甘油含量的下降表明ic50劑量維生素c作用后，能量存儲(chǔ)水平下降、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受到影響；k562細(xì)胞供能效率的下降還與細(xì)胞有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒獾暮粑绞接嘘P(guān)。

綜上，針對(duì)巨噬細(xì)胞raw264.7，半乳糖代謝、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝和糖異生為其代表性代謝途徑，也就是說(shuō)，維生素c對(duì)raw264.7細(xì)胞的亞毒性的影響體現(xiàn)在半乳糖代謝、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝和糖異生代謝途徑上；針對(duì)k562細(xì)胞，甘油脂代謝、肌醇磷酸代謝、甜菜堿代謝和半乳糖代謝為其代表性的代謝途徑，也就是說(shuō)，維生素c對(duì)k562細(xì)胞的亞毒性體現(xiàn)在甘油脂代謝、肌醇磷酸代謝、甜菜堿代謝和半乳糖代謝。申請(qǐng)人后續(xù)經(jīng)過(guò)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以驗(yàn)證以上結(jié)論。

raw264.7細(xì)胞和k562細(xì)胞共同改變的細(xì)胞代謝途徑有蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、甘油脂代謝、肌醇代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝。結(jié)果表明ic50劑量維生素c作用細(xì)胞后，蛋氨酸代謝變化、各種氨基酸代謝變化與維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)有關(guān)，屬于細(xì)胞正常的代謝變化途徑；而ic50劑量維生素c在使癌細(xì)胞k562細(xì)胞衰老的同時(shí)也加速正常細(xì)胞的衰老，且導(dǎo)致巨噬細(xì)胞raw264.7中大量物質(zhì)的代謝紊亂。因此我們應(yīng)該合理、正確辯證地態(tài)度對(duì)待和服用維生素c。本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)方法對(duì)ic50劑量維生素c作用細(xì)胞后產(chǎn)生的影響作了初步研究，為后期實(shí)驗(yàn)探究提供實(shí)驗(yàn)方法、思路和理論基礎(chǔ)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。