本發(fā)明屬于化學(xué)分析、生物分子檢測領(lǐng)域，涉及一種基于納米銀/氧化石墨烯/氯化鈉的拉曼增強(qiáng)基底免標(biāo)記檢測牛血清蛋白的方法。

背景技術(shù)：

增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可直接分析水相生物分子的結(jié)構(gòu)狀態(tài)且用量少，是一種無損非接觸檢測技術(shù)，具有高效靈敏，性價(jià)比高，便于現(xiàn)場快速檢測的特點(diǎn)。越來越多的科研人員嘗試?yán)迷鰪?qiáng)拉曼光譜技術(shù)的非破壞性和指紋式的分辨能力研究蛋白質(zhì)、dna等生物分子藥品之間的相互作用，并取得了一定的成果，促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測方法，包括質(zhì)譜，x-射線晶體，核磁共振和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，但使用方式復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。拉曼檢測法檢測蛋白，通過分析蛋白質(zhì)拉曼圖普的峰強(qiáng)信息以及特征峰位置，不但可以得到蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)、肽鏈骨架的振動(dòng)，而且可以獲得測驗(yàn)環(huán)境的化學(xué)信息以及蛋白質(zhì)受外界環(huán)境的影響信息，具有對樣品無損、樣品制備簡單和所需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)使其檢測限度提高了4至10個(gè)數(shù)量級，不僅在物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方面，而且在痕量檢測方面也顯示出巨大的潛力。免標(biāo)記是一種不需要任何連接劑的技術(shù)，特點(diǎn)是能直接測得蛋白信號，是一種理想的檢測技術(shù)。

在蛋白質(zhì)檢測中金屬納米溶膠基底是一類應(yīng)用比較廣泛的活性基底，文獻(xiàn)1(liyt,etal.label-freein-situmonitoringofproteintyrosinenitrationinbloodbysurface-enhancedramanspectroscopy[j].biosensorsandbioelectronics,2015,69:1-7.)報(bào)道了一種用于原位監(jiān)測蛋白酪氨酸硝化(ptn)的無標(biāo)記方法，實(shí)現(xiàn)了快速鑒定ptn，同時(shí)得到了非硝化肽和硝化肽之間的sers光譜的區(qū)別，但是，此方法在檢測的過程中存在著基底材料制備復(fù)雜，sers譜圖的重現(xiàn)性不好等問題。文獻(xiàn)2(hanxx,etal.label-freehighlysensitivedetectionofproteinsinaqueoussolutionsusingsurface-enhancedramanscattering[j].analyticalchemistry,2009,81(9):3329-3333.)報(bào)道了一種溶膠基底，以銀溶膠做基底，以硫酸做聚集劑，但基底表面不清潔，可能會(huì)出現(xiàn)雜峰，對探針分子sers信號造成干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于納米銀/氧化石墨烯/氯化鈉的拉曼增強(qiáng)基底免標(biāo)記檢測牛血清蛋白的方法，將銀溶膠與氧化石墨烯(go)混合，在氯化鈉的作用下，使銀納米粒子團(tuán)聚并且負(fù)載在go上，基底酸化后與蛋白溶液混合，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)在水相中的免標(biāo)記檢測，進(jìn)行定性分析。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于納米銀/氧化石墨烯/氯化鈉的拉曼增強(qiáng)基底免標(biāo)記檢測牛血清蛋白的方法，具體步驟如下：

步驟1，將銀溶膠與氧化石墨烯混合均勻，超聲條件下加入nacl溶液，nacl在混合溶液中的終濃度為0.11-0.27m，超聲混合均勻，離心去除上清液，將沉淀分散于水中，得到納米銀/氧化石墨烯/氯化鈉的基底溶液；

步驟2，在納米銀/氧化石墨烯/氯化鈉的基底溶液中加入nacl溶液，nacl的終濃度為0.03-0.06m，加hcl調(diào)節(jié)基底的ph為2～3，加入牛血清蛋白溶液，混合均勻，進(jìn)行拉曼檢測。

優(yōu)選地，步驟1中，所述的銀溶膠與氧化石墨烯的質(zhì)量比為176:1。

本發(fā)明引入go，作為一種新型表面活性劑，go在溶液中呈現(xiàn)相對舒展的平面結(jié)構(gòu)，可作為雙面負(fù)載平臺。在nacl的作用下，銀納米粒子團(tuán)聚并被go捕捉，go將納米粒子團(tuán)聚體穩(wěn)定在其表面上，使納米粒子大部分表面裸露，實(shí)現(xiàn)和蛋白的直接結(jié)合。一方面，nacl作為納米粒子表面清潔劑，氯離子和銀極易結(jié)合，去除銀溶膠表面的檸檬酸三鈉，得到了表面清潔的基底，使蛋白檢測沒有雜峰的干擾。另一方面，nacl的濃度直接影響團(tuán)聚體的大小，調(diào)控nacl的濃度得到大小可控的團(tuán)聚體，保證蛋白檢測信號的穩(wěn)定。

本發(fā)明通過引入go和nacl，得到了表面清潔、團(tuán)聚體大小可控、懸浮性好的基底，結(jié)合表面拉曼增強(qiáng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)在液相中的痕量、無損、免標(biāo)記檢測。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，快速、靈敏，且不需要連接劑，增加了檢測的可靠性，為后續(xù)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及疾病的診斷研究提供了重復(fù)性良好的方法。

附圖說明

圖1是基底及牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖。

圖2是不同nacl濃度下牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖。

圖3是不同bsa濃度下牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖。

圖4是基底溶液中的nacl濃度為0.1m和0.3m時(shí)，牛血清蛋白的拉曼檢測圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

實(shí)施例1

基底的制備：取25ml合成好的銀溶膠在7000rpm下離心15min，去除上清液，將固體分散于15ml去離子水中，再加入1.5ml0.017mg/ml的go，混合均勻后在超聲的條件下加入3.62ml濃度為1m的nacl，使nacl的最終濃度為0.18m，至顏色不再變化時(shí)，停止超聲。在7000rpm下離心15min，去除上清液，分散于12ml去離子水中，超聲分散均勻。

樣品的檢測：取1.5ml制備好的基底，然后加入0.05ml濃度為1m的nacl，再加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)溶液的ph為2-3。加入0.75ml濃度為1mg/ml的bsa溶液，拉曼檢測。

圖1是基底及牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖，上面為牛血清蛋白的拉曼圖普，下面為基底的拉曼圖譜，基底的鹽濃度都為0.18m。基底只有氧化石墨烯的峰，說明基底是相對清潔的，蛋白檢測不會(huì)受銀溶膠表面檸檬酸三鈉雜峰的影響。

實(shí)施例2

基底的制備：取2份25ml合成好的銀溶膠在7000rpm下離心15min，去除上清液，將固體分散于15ml去離子水中，再分別加入1.5ml0.017mg/ml的go，混合均勻后在超聲的條件下分別加入2.04ml，6.10ml濃度為1m的nacl，使nacl的最終濃度為0.11m，0.27m，至顏色不再變化時(shí)，停止超聲。在6000rpm下離心15min，去除上清液，分散于12ml去離子水中，超聲分散均勻。

取1.5ml制備好的基底，加入0.05ml濃度為1m的nacl，再加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)溶液的ph為2-3。加入0.75ml濃度為1mg/ml的bsa溶液，拉曼檢測。

圖2是不同鹽(nacl)濃度下牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖，基底的鹽濃度不同：a-0.27m，b-0.11m，c-0.15m，d-0.24m，e-0.21m，f-0.18m?；椎膎acl濃度不同，則團(tuán)聚體大小不同，從而影響蛋白檢測的信號強(qiáng)度。當(dāng)基底鹽濃度為0.18m時(shí)，蛋白信號最強(qiáng)。

實(shí)施例3

基底的制備：取5份25ml合成好的銀溶膠在7000rpm下離心15min，去除上清液，將固體分散于15ml去離子水中，再分別加入1.5ml0.017mg/ml的go，混合均勻后在超聲的條件下分別加入3.62ml濃度為1m的nacl，使nacl的最終濃度為0.18m，至顏色不再變化時(shí)，停止超聲。在6000rpm下離心15min，去除上清液，分散于12ml去離子水中，超聲分散均勻。

樣品的檢測：取二份1.5ml制備好的基底，加入0.05ml濃度為1m的nacl，再加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)溶液的ph為2-3。分別加入0.75ml、0.05ml濃度為1mg/ml的bsa溶液，使bsa的終濃度為0.03mg/ml和0.33mg/ml，拉曼檢測。bsa的檢測限度可以達(dá)到0.03mg/ml。

圖3是不同蛋白(bsa)濃度下牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖，bsa在溶液中的最終濃度為：a-0.03mg/ml，b-0.05mg/ml，c-0.1mg/ml，d-0.2mg/ml，e-0.33mg/ml，bsa的檢測限度可以達(dá)到0.03mg/ml。濃度越大，信號越強(qiáng)。

綜上，本發(fā)明制備了一種相對清潔的、懸浮性好的基底，實(shí)現(xiàn)了對蛋白的免標(biāo)記檢測，該免標(biāo)記檢測方法操作簡單，重現(xiàn)性高。

對比例

基底的制備：取2份25ml合成好的銀溶膠在7000rpm下離心15min，去除上清液，將固體分散于15ml去離子水中，再分別加入1.5ml0.017mg/ml的go，混合均勻后在超聲的條件下分別加入1.8ml、7.1ml濃度為1m的nacl，使nacl的終濃度為0.10m、0.3m,至顏色不再變化時(shí)，停止超聲。在6000rpm下離心15min，去除上清液，分散于12ml去離子水中，超聲分散均勻。

樣品的檢測：分別取1.5ml制備好的基底，加入0.05ml濃度為1m的nacl，再加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)溶液的ph為2-3。加入0.75ml濃度為1mg/ml的bsa溶液，拉曼檢測。

圖4是基底溶液中的nacl濃度為0.1m和0.3m時(shí)，牛血清蛋白的拉曼檢測圖譜，1-基底的nacl濃度為0.10m，2-基底的nacl濃度為0.3m。由圖可以看出，當(dāng)基底的nacl濃度范圍不在0.11-0.27m時(shí)，不能得到bsa的拉曼圖譜。