本發(fā)明屬于血液檢測領(lǐng)域，涉及一種血清中尿素氮含量的測定方法，尤其涉及一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法。
背景技術(shù)：
尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，氨基酸脫氨基產(chǎn)生NH3和C02，兩者在肝臟中合成尿素。通常腎臟為排泄尿素的主要器官，尿素從腎小球濾過后在各段小管均可重吸收。各種腎實質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭等均可使血尿素氮增高。如能排除腎外因素，尿素氮可作為尿毒癥診斷指標之一。
血清(或血漿)中的尿素氮，在尿素氮試劑的酸性環(huán)境中與二乙酰-肟(DAM)共沸后，可縮合成一紅色化合物，稱為fearon反應(yīng)。其顏色的深淺與血清(或血漿)中尿素氮的含量成正比，與同樣處理的尿素氮標準液比色，即可測算出血清(或血漿)中尿素氮的含量。由于此方法干擾性大，目前臨床實驗室多采用尿素酶偶聯(lián)法，用尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下使NADH氧化為NAD+時，通過340nm吸光度的降低值可計算出尿素氮含量。但是，尿素酶偶聯(lián)法測試時間較長，步驟繁瑣，檢測效率慢，且大量的人為操作易造成檢測結(jié)果不準確。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，步驟一、配制若干個含有不同尿素氮含量的血清標定液；步驟二、用近紅外光譜儀對每個血清標定液進行光譜采集；步驟三、根據(jù)血清標定液的近紅外光譜，建立鑒別模型；步驟四、用近紅外光譜儀對待檢測的血清樣品進行光譜采集，將血清樣品的光譜與鑒別模型對比，獲得血清樣品中的尿素氮含量。
其中，步驟一中，血清標定液是指已知其尿素氮含量的血清樣品。且血清標定液的數(shù)量需滿足建立模型的要求。優(yōu)選的，血清標定液的數(shù)量至少為30個。若干個血清標定液的尿素氮含量的范圍為2-7mmol/L。
步驟三中，鑒別模型是指血清標定液的光譜與血清標定液中尿素氮含量之間的對應(yīng)關(guān)系。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，步驟一是采用尿素酶偶聯(lián)法測定血清中的尿素氮含量，并配制出不同尿素氮含量的血清標定液；尿素酶偶聯(lián)法是指采用尿素酶、谷氨酸脫氫酶、α-酮戊二酸、NADH與血清混合，根據(jù)NADH與血清反應(yīng)前后的變化，即依據(jù)NADH與血清反應(yīng)前后的結(jié)果，得到血清中尿素氮的含量。
其中，上述血清可以為采集而來的多份血清，用以配制血清標定液。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，尿素酶偶聯(lián)法的具體步驟為：步驟a、試劑與血清混合，并于36～38℃溫浴3-6min；試劑包括尿素酶、谷氨酸脫氫酶、α-酮戊二酸和NADH；步驟b、在340nm波長處測量試劑和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并與相同處理的尿素氮標準液比較，計算獲得樣品中尿素氮的含量。
其中，步驟b中，“與相同處理的尿素氮標準液比較”是指：配置尿素氮標準液，加入試劑，混合均勻并溫浴，其中，尿素氮標準液與血清等量，試劑的加入量與其加入至血清中的量相等，溫浴溫度和時間也與樣品的處理條件相同。然后，在340nm波長處測量試劑和尿素氮標準液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮標準液的濃度已知，通過計算可知血清中尿素氮的含量。并且，尿素氮標準液可以與血清同時處理，以使檢測結(jié)果更加準確并節(jié)省檢測時間。
尿素氮標準液的配制方法為：稱取尿素，溶于無氨去離子水中，并用無氨去離子水定容。尿素氮標準液的濃度為6～8mmol/L。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，試劑還包括磷酸鹽緩沖液；磷酸鹽緩沖液的pH指為7.7±0.2；優(yōu)選的，磷酸鹽緩沖液為TRIS-鹽酸緩沖劑。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，試劑還包括防腐劑；優(yōu)選的，防腐劑為ProcIin-300。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，試劑由磷酸鹽緩沖液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脫氫酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐劑150～250μl/L組成；試劑與血清的體積比為1:70～80。
其中，試劑由上述各組分混合制成。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，步驟二和步驟四中，使用近紅外光譜儀檢測血清標定液和血清樣品時，還采用配合近紅外光譜儀的液體檢測裝置；液體檢測裝置包括通光孔、半透半反鏡片和樣品通道探測器；通光孔、半透半反鏡片和樣品通道探測器設(shè)于同一直線上，形成樣品測試光路。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，液體檢測裝置還包括空氣通道探測器；空氣通道探測器設(shè)于半透半反鏡片的一側(cè)，與樣品測試光路垂直的方向，用于接收半透半反鏡片的反射光。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，液體檢測裝置還包括樣品試管；樣品試管放置在半透半反鏡片和樣品通道探測器之間，位于樣品測試光路上；進行近紅外光譜采集時，血清標定液或待檢測的血清樣品均放入樣品試管中。
檢測時，近紅外光線通過通光孔，射至半透半反鏡片上，一部分近紅外光線由半透半反鏡片反射進入空氣通道探測器；另一部分近紅外光線透過半透半反鏡片照射樣品試管，透過樣品試管及其內(nèi)部的測試液體(血清標定液或血清樣品)射入樣品通道探測器，光線在透過測試液體時發(fā)生吸收現(xiàn)象。
進一步，本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，還可以具有這樣的特征：其中，樣品試管呈長方體，測試光線與樣品試管的管壁垂直。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，采集若干個不同尿素氮含量血清的近紅外光譜，建立尿素氮含量與光譜相對應(yīng)的鑒別模型，當需要檢測其他血清樣品的尿素氮含量時，僅需采集該血清樣品的近紅外光譜，并將其與上述鑒別模型對比，即可獲得該血清樣品中的尿素氮含量。與傳統(tǒng)的標準檢測方法相比，首先，本方法的待檢測血清樣品無需預(yù)處理，不使用任何化學(xué)試劑，無環(huán)境污染、成本低；其次，檢測所需的血清樣品量少，且每份樣品的檢測時間約為近紅外光譜的采集時間，檢測時間短、效率高；此外，本方法避免了人為操作的誤差，提高檢測準確率。
具體實施方式
實施例一
本實施例提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法：
步驟一、采用尿素酶偶聯(lián)法測定血清中的尿素氮含量，并配制出若干個不同尿素氮含量的血清標定液。上述血清可以為采集而來的多份血清，用以配制血清標定液。
其中，血清標定液的數(shù)量需滿足建立模型的要求。優(yōu)選的，血清標定液的數(shù)量至少為30個。
若干個血清標定液的尿素氮含量的范圍為2-7mmol/L。
尿素酶偶聯(lián)法的具體步驟為：步驟a、試劑與血清混合，并于36℃溫浴6min。其中，試劑由磷酸鹽緩沖液30nmol/L、尿素酶4000U/L、谷氨酸脫氫酶8000U/L、α-酮戊二酸140nmol/L、NADH2.0nmol/L、防腐劑150μl/L組成。其中，磷酸鹽緩沖液為TRIS-鹽酸緩沖劑，防腐劑為ProcIin-300。血清與試劑的體積比為1:70。步驟b、在340nm波長處測量試劑和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并與相同處理的尿素氮標準液比較，計算獲得樣品中尿素氮的含量。
其中，尿素氮標準液的濃度為6mmol/L。在尿素氮標準液中加入試劑，混合均勻并溫浴，其中，尿素氮標準液與血清等量，試劑的加入量與其加入至血清中的量相等，溫浴溫度和時間也與樣品的處理條件相同。然后，在340nm波長處測量試劑和尿素氮標準液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮標準液的濃度已知，通過計算可知血清中尿素氮的含量。
步驟二、用近紅外光譜儀對每個血清標定液進行光譜采集。
步驟三、根據(jù)血清標定液的近紅外光譜，建立鑒別模型。該鑒別模型是指血清標定液的光譜與血清標定液中尿素氮含量之間的對應(yīng)關(guān)系。
步驟四、用近紅外光譜儀對待檢測的血清樣品進行光譜采集，將血清樣品的光譜與鑒別模型對比，獲得血清樣品中的尿素氮含量。
其中，步驟二和步驟四中，使用近紅外光譜儀檢測血清標定液和血清樣品時，還采用配合近紅外光譜儀的液體檢測裝置。該液體檢測裝置包括通光孔、半透半反鏡片、樣品試管、樣品通道探測器和空氣通道探測器。
通光孔、半透半反鏡片和樣品通道探測器設(shè)于同一直線上，形成樣品測試光路。空氣通道探測器設(shè)于半透半反鏡片的一側(cè)，與樣品測試光路垂直的方向，用于接收半透半反鏡片的反射光。樣品試管放置在半透半反鏡片和樣品通道探測器之間，位于樣品測試光路上，進行近紅外光譜采集時，血清標定液或待檢測的血清樣品均放入樣品試管中。樣品試管呈長方體，測試光線與樣品試管的管壁垂直。
檢測時，近紅外光線通過通光孔，射至半透半反鏡片上，一部分近紅外光線由半透半反鏡片反射進入空氣通道探測器；另一部分近紅外光線透過半透半反鏡片照射樣品試管，透過樣品試管及其內(nèi)部的測試液體(血清標定液或血清樣品)射入樣品通道探測器，光線在透過測試液體時發(fā)生吸收現(xiàn)象。
實施例二
本實施例提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，與實施例一的方法基本相同，區(qū)別僅在于：步驟一中的尿素酶偶聯(lián)法不同。
尿素酶偶聯(lián)法的具體步驟為：步驟a、試劑與血清混合，并于38℃溫浴3min。其中，試劑由磷酸鹽緩沖液70nmol/L、尿素酶6000U/L、谷氨酸脫氫酶10000U/L、α-酮戊二酸180nmol/L、NADH4.0nmol/L、防腐劑250μl/L組成。其中，磷酸鹽緩沖液為TRIS-鹽酸緩沖劑，防腐劑為ProcIin-300。血清與試劑的體積比為1:80。步驟b、在340nm波長處測量試劑和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并與相同處理的尿素氮標準液比較，計算獲得樣品中尿素氮的含量。
其中，尿素氮標準液的濃度為8mmol/L。處理方式與實施例一相同。
實施例三
本實施例提供一種血清中尿素氮含量近紅外光譜測定方法，與實施例一的方法基本相同，區(qū)別僅在于：步驟一中的尿素酶偶聯(lián)法不同。
尿素酶偶聯(lián)法的具體步驟為：步驟a、試劑與血清混合，并于37℃溫浴4min。其中，試劑由尿素酶5000U/L、谷氨酸脫氫酶9000U/L、α-酮戊二酸160nmol/L、NADH3.0nmol/L。血清與試劑的體積比為1:75。步驟b、在340nm波長處測量試劑和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并與相同處理的尿素氮標準液比較，計算獲得樣品中尿素氮的含量。
其中，尿素氮標準液的濃度為7mmol/L。處理方式與實施例一相同。