本發(fā)明涉及一種水溶液中膽紅素濃度的定量測定方法，屬于分析檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：膽紅素是人體內(nèi)衰老的紅細(xì)胞中血紅素的正常代謝產(chǎn)物，為紅褐色的色素體，不溶于水，難溶于醇、醚、易溶于堿。它是臨床醫(yī)學(xué)試驗中常規(guī)檢驗項目之一，對肝膽疾病及溶血性疾病的診斷有著重要的意義。當(dāng)膽紅素的某一個或幾個代謝環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙時，導(dǎo)致血清總膽紅素濃度超過正常水平，出現(xiàn)高膽紅素血癥(黃疸)，尤其在新生嬰兒中，游離膽紅素能透過血腦屏障，進(jìn)一步引起各種組織的細(xì)胞尤其是大腦細(xì)胞死亡，導(dǎo)致智障、腦癱甚至是死亡；同時造成肝或膽管功能紊亂，加重肝損傷，尤其是肝炎病人。膽紅素的檢測和清除是治療膽紅素相關(guān)疾病的重要手段。采用吸附劑進(jìn)行血液體外灌注是去除膽紅素的臨床方法?；A(chǔ)研究中，為了解決膽紅素不溶于水溶液，通用的方法是先用少量0.1NNaOH溶液溶解，再用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2～7.4)或蒸餾水稀釋，配制膽紅素溶液，然后用于膽紅素與吸附劑的相互作用研究。但是該方法的最大的缺點是在堿的作用下，水不溶的膽紅素轉(zhuǎn)變成了水溶的膽紅素鈉。由于膽紅素和膽紅素鈉具有明顯不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，導(dǎo)致其與同一種吸附劑的相互作用機(jī)制和吸附能力將出現(xiàn)明顯差異。同時這種方法所配置的較高濃度膽紅素溶液體系不穩(wěn)定，靜置一段時間后，膽紅素易從溶液中析出。因此，從這種方法配置的膽紅素溶液中難以準(zhǔn)確測定膽紅素的濃度，也不能真實反映膽紅素在吸附劑上的吸附能力，研究結(jié)果存在明顯偏差。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種水溶液中膽紅素濃度的定量測定方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：本發(fā)明提供一種水溶液中膽紅素濃度的定量測定方法，其包括如下步驟：S1：制備膽紅素溶液，并制作膽紅素溶液濃度與吸光度關(guān)系的工作曲線；S2：將吸附劑加入所述膽紅素溶液中，在避光條件下進(jìn)行吸附后，取上層清液測量吸光度，計算吸附劑的對膽紅素的吸附率與吸附量；膽紅素不溶于水，醇、醚，易溶于堿，所以人們常用堿性水溶液來配置膽紅素溶液。但在堿性水溶液的作用下，水不溶的膽紅素轉(zhuǎn)變成了水溶的膽紅素鈉，由于膽紅素和膽紅素鈉具有明顯不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，導(dǎo)致其與吸附劑的相互作用機(jī)制和吸附能力將出現(xiàn)明顯差異。而膽紅素能夠溶于二甲亞砜等有機(jī)溶劑中，故選用二甲亞砜作為溶劑來溶解膽紅素。我們發(fā)現(xiàn)二甲亞砜單一溶劑配置出來的膽紅素溶液，并不能被殼聚糖或活性炭等吸附劑所吸附，但是加入一定體積的水之后，吸附劑對于膽紅素的吸附能力大大提高。而且水所占的體積不同，吸附效果也不同。所以本發(fā)明提供一種水溶液中膽紅素濃度的定量測定方法具體為：在避光條件下，將膽紅素在有機(jī)溶劑中先進(jìn)行初溶后，再加入有機(jī)溶劑和水的混合液進(jìn)行稀釋，得到所述膽紅素溶液，并記錄膽紅素溶液的濃度。通過一系列實驗，我們探索出了步驟S1中所述的用來初溶的有機(jī)溶劑的體積優(yōu)選為2～30mL，所述有機(jī)溶劑和水的混合液中，有機(jī)溶劑和水的體積比優(yōu)選為1:1～4:1。作為優(yōu)選方案，所述有機(jī)溶劑和水的混合液中，有機(jī)溶劑和水的體積比最佳為2.5:1。作為優(yōu)選方案，步驟S1中所述的有機(jī)溶劑為二甲亞砜。作為優(yōu)選方案，步驟S2中，吸附是在4～40℃、振蕩的條件下進(jìn)行的。作為優(yōu)選方案，所述吸附的最佳溫度為37℃。作為優(yōu)選方案，步驟S2中所述的吸附劑為殼聚糖或活性炭。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：為了準(zhǔn)確檢測水溶液中膽紅素的濃度以及水溶液中吸附劑對膽紅素的吸附能力，如何配置穩(wěn)定的膽紅素水溶液體系是首要問題；本發(fā)明的核心內(nèi)容是找到了一種新的含水溶劑體系，在不改變膽紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提下溶解膽紅素，并測定它與吸附劑的相互作用，從而為水溶液中膽紅素濃度的測定提供一種新方法。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1為本發(fā)明實施例1中繪制的膽紅素濃度-吸光度工作曲線；圖2為膽紅素在二甲亞砜/水溶液中吸光度隨時間變化的曲線；圖3為膽紅素二甲亞砜/水溶液和膽紅素氫氧化鈉水溶液分別靜置一小時后的表觀對比；圖4為膽紅素溶于NaOH/D2O時的1H-NMR譜圖；圖5為膽紅素溶于DMSO-d6/D2O時的1H-NMR譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中使用的儀器：可見光-紫外分光光度計(V-1200)，水浴振蕩鍋(SHA-C型)。實施例1本實施例涉及膽紅素濃度-吸光度工作曲線的繪制：1、分別配制濃度為6mg/L、12mg/L、18mg/L、30mg/L的膽紅素溶液；2、然后分別測定上述各濃度膽紅素溶液在438nm處的吸光度，如表1所示，并根據(jù)表1中數(shù)據(jù)繪制濃度-吸光度工作曲線，如圖1所示，可以明顯看到，吸光度與濃度的關(guān)系滿足朗伯比爾定律，成線性正比關(guān)系，因此，本發(fā)明方法可以用于膽紅素濃度的測定；其中，膽紅素溶液的配制方法為：在避光條件下，將膽紅素溶解于15mL二甲亞砜中進(jìn)行初溶后，加入二甲亞砜和水按照2.5:1的體積比配制的混合液稀釋至50mL，得到膽紅素溶液，并記錄膽紅素溶液的濃度。表1實施例1中各濃度膽紅素溶液的吸光度濃度/(mg.L-1)6121830吸光度(Abs)0.1340.2910.4640.804實施例2本實施例涉及膽紅素在二甲亞砜水溶液中的穩(wěn)定性研究按實施例1中制備的任意一種濃度的膽紅素溶液的方法，配置200mg/L的膽紅素溶液。在37℃的水浴中，避光震蕩。每隔一定時間取膽紅素溶液1mL，稀釋10倍后，測量其在438nm處吸光度，觀察隨著時間的延長，該溶液的吸光度是否有改變，結(jié)果如表2和圖2所示，可以明顯看出，隨著時間的延長，吸光度雖然有所波動，但是波動范圍為-1.5％～1.3％，屬于誤差范圍。說明溶液在2.5h內(nèi)非常穩(wěn)定。表2實施例2中不同時間內(nèi)膽紅素在溶液中的吸光度時間/min020304090150吸光度/Abs1.8831.8841.8451.8681.8591.898實施例3本實施例涉及膽紅素分別在二甲亞砜水溶液和氫氧化鈉水溶液中的穩(wěn)定性比較避光條件下，稱取0.01g的膽紅素，加入15mL二甲亞砜進(jìn)行初溶，通過攪拌和超聲使膽紅素完全溶解，然后加入二甲基亞砜和水按照3:1的體積比配制的混合溶液稀釋至50mL，記為膽紅素二甲亞砜溶液；同樣在避光條件下，利用通用方法制備膽紅素溶液，即：稱取0.01g的膽紅素，先用少量0.1NNaOH水溶液溶解，再用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2～7.4)稀釋至50mL，記為膽紅素氫氧化鈉溶液；將膽紅素二甲亞砜水溶液和膽紅素氫氧化鈉水溶液分別靜置一小時后，觀察現(xiàn)象并分別進(jìn)行氫核磁共振譜檢測，結(jié)果分別如圖3a、3b、圖4和圖5所示，明顯可以看到，膽紅素氫氧化鈉水溶液底部出現(xiàn)了沉淀，而膽紅素二甲亞砜水溶液依舊澄清透明；膽紅素-NaOH/D2O溶液在10.0ppm附近沒有出現(xiàn)羧基氫峰，這是因為NaOH/D2O溶劑與膽紅素的羧基發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成了羧酸鈉結(jié)構(gòu)。而膽紅素-DMSO-d6/D2O溶液在10.0ppm出現(xiàn)了羧基氫的峰，說明膽紅素的羧基氫在DMSO-d6/D2O溶劑中仍然存在，沒有被破壞，因此，DMSO-d6/D2O可認(rèn)定為膽紅素的真溶劑。實施例4本實施例涉及利用活性炭對200mg/L的膽紅素二甲亞砜溶液進(jìn)行吸附的實驗避光條件下，稱取0.01g的膽紅素，加入15mL二甲亞砜進(jìn)行初溶，通過攪拌和超聲使膽紅素完全溶解，然后加入二甲基亞砜和水按照3:1的體積比配制的混合溶液稀釋至50mL，得到濃度為200mg/L的膽紅素二甲亞砜溶液；稱取0.1g活性炭置于試劑瓶中，加入5mL上一步配置的200mg/L的膽紅素溶液，并設(shè)置空白對照組。避光條件下，在37℃的水浴中振蕩吸附2h后，取上層清液稀釋10倍后測量各自在438nm處吸光度，結(jié)合實施例1中繪制的膽紅素濃度-吸光度工作曲線，計算吸附劑的吸附率以及吸附容量，結(jié)果如表3所示。表3樣品吸光度(Abs)吸附率(％)吸附量(ng/g)空白樣2.18100活性炭1.37249.83.76實施例5本實施例涉及利用殼聚糖作對100mg/L的膽紅素二甲亞砜水溶液進(jìn)行吸附的實驗避光條件下，稱取0.005g的膽紅素，加入15mL二甲亞砜進(jìn)行初溶，通過攪拌和超聲使膽紅素完全溶解，然后加入二甲基亞砜和水的混合溶液(二甲亞砜：水體積比為2.5:1)稀釋至50mL。配置膽紅素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作膽紅素溶液濃度與吸光度的工作曲線。稱取0.1g殼聚糖置于試劑瓶中，加入5mL標(biāo)準(zhǔn)膽紅素溶液,并設(shè)置空白對照組。避光條件下，在37℃的水浴中振蕩吸附2.2h后，取上層清液稀釋10倍后測量各自在438nm處吸光度，計算吸附劑的吸附率以及吸附容量。結(jié)果如表4所示。表4樣品吸光度(Abs)吸附率(％)吸附量(ng/g)空白樣1.07100殼聚糖0.589552.1以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3