本發(fā)明屬于質譜分析裝置，涉及一種用于質譜分析的96孔高通量固相萃取裝置，該裝置可以用于生物樣品的蛋白質提取并直接用于質譜檢測。

背景技術：

臨床蛋白質組學質譜檢測已經在疾病中得到了廣泛的應用研究。由于蛋白質而并非核酸才是生命活動的具體執(zhí)行者和體現(xiàn)者，因此研究疾病發(fā)病機制，尋找特異、靈敏的疾病標志物，客觀上要求在蛋白質組的水平進行進一步探索。按技術和研究的目的分，腫瘤蛋白質組學可以分為表達蛋白質組學和功能蛋白質組學。表達蛋白質組學包括二維凝膠電泳(2-DE),色譜與質譜結合分析法,肽和蛋白質的微陣列,組織陣列等等。磁珠結合MALDI-TOF-MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)研究體液的蛋白質多肽差異圖譜是近年來發(fā)展起來的一種蛋白質組學研究手段，該方法相比其它傳統(tǒng)蛋白質組學研究方法，具有直接對臨床標本高通量檢測的潛質。

但是生物樣品成分復雜，除了含有大量的蛋白質和多肽外，還含有鹽、各種小分子、脂類等成分，導致其無法在MALDI等質譜上直接加樣檢測。如何實現(xiàn)快速、有效、高通量、多樣本的同時提取蛋白質和多肽，制備樣品的技術，是目前得到高敏感度可重性的臨床蛋白質組學結果的關鍵。體液、細胞裂解液等生物樣品的質譜蛋白質組學檢測是一個重要領域。疾病相關的生物樣品，比如血清，尿液等的臨床蛋白質組學檢測在疾病相關的標志物的篩選和鑒定方面有著重要的應用。為了解決將血清，血漿、尿液、唾液、細胞裂解液等生物樣本高質量快速的處理用于臨床蛋白質組學，目前研究者主要應用蛋白質芯片或磁珠這兩種方法。蛋白質芯片主要用于SELDI-TOF MS質譜，MALDI-TOF MS系統(tǒng)以磁珠制備樣品的技術為主。磁珠分離提取是一種近年來用的比較多的臨床蛋白質組學樣品預處理方法，通過將磁性的小珠子表面進行不同的修飾，使其可結合具有某類化學性質的蛋白分子。但是由于本身的結構限制，一般以8個樣本一排同時操作為主，很難進行96孔樣本高通量同時快速操作。而進口的臨床蛋白質組學磁珠主要為德國Bruker公司生產，價格非常昂貴。另外萃取小柱是傳統(tǒng)的質譜預處理方法，萃取小柱可用于蛋白質等大分子和藥物鹽類等小分子的分離。但傳統(tǒng)的萃取小柱由于需要較大的樣本體積，無法高通量快速的針對臨床蛋白質組學的要求實現(xiàn)少量、大規(guī)模樣本數(shù)、快速批量操作、直接用于質譜檢測。為此我們發(fā)明一種直接用于臨床蛋白質組學質譜檢測的96孔高通量固相萃取小柱裝置，能夠低廉的實現(xiàn)大樣本快速高、通量、規(guī)?；幚砗椭苽渑R床樣本,快速高效分離和富集蛋白質和多肽用于臨床蛋白質組學研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有質譜檢測生物樣品制備技術的局限，提供一種用于質譜分析的96孔高通量固相萃取裝置，是一種具有高通量、操作簡單、成本低廉、快速高效的生物樣本(如血液、尿液、唾液、細胞或組織裂解液等)中的蛋白質或多肽的分離富集和提取，并直接高敏感度的用于蛋白質組學質譜檢測中的96孔固相萃取裝置。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種用于質譜分析的96孔高通量固相萃取裝置，由硅膠密封蓋板、聯(lián)排萃取柱孔、96孔聯(lián)排萃取柱板、上篩板、固相萃取柱填料、下篩板、96孔樣本收集板、樣本收集孔組成，在96孔聯(lián)排萃取柱板上排列設置聯(lián)排萃取柱孔，聯(lián)排萃取柱孔為兩頭開口，硅膠密封蓋板和96孔聯(lián)排萃取柱板通過硅膠顆粒密封，密封后在負壓環(huán)境下可提供柱孔內外壓力差使溶液流出柱體。固相萃取柱填料填在96孔聯(lián)排萃取柱板的96個聯(lián)排萃取柱孔中，先在聯(lián)排萃取柱孔中裝好下篩板，加裝固相萃取柱填料后，再裝好上篩板，壓緊，填裝好的96孔聯(lián)排萃取柱板可直接放置于96孔樣本收集板上。

聯(lián)排萃取柱孔與普通萃取小柱結構一樣，上口部開放式，底部有一開放式小管，可插入樣本收集孔連接96孔樣本收集板。

聯(lián)排萃取柱孔與樣本收集孔一一對應，樣本收集孔底部封閉，用于收集溶液。

固相萃取柱填料選用碳十八(C18)或者弱陽離子交換聚合物填料或者強陽離子交換聚合物，其填料重量為30-50mg。

使用時將溶液注入96孔聯(lián)排固相萃取柱板后，上部用硅膠密封蓋板密封，下部連接96孔樣本收集板，將整個96孔固相萃取裝置放入外部連接真空泵的真空干燥器中，抽真空后利用壓力差，使溶液快速流過96孔高通量固相萃取柱，進入96孔樣本收集板；或者不密封96孔固相萃取裝置上部，直接在底部連接密封真空泵裝置，抽真空，為96孔高通量固相萃取裝置提供負壓，使溶液快速流過96孔高通量固相萃取柱，進入96孔樣本收集板；或者不密封96孔固相萃取裝置上部，在96孔板離心機中離心，利用離心重力使溶液快速流過96孔高通量固相萃取柱，進入96孔樣本收集板。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述裝置在真空負壓環(huán)境或者重力離心情況下應用。所述真空負壓環(huán)境或者重力離心情況下應用，包括在真空干燥器中的應用，在底部密封真空裝置中的應用，在96孔板離心機中的應用。

本發(fā)明的再一個目的是提供所述裝置在多生物樣品高通量提取蛋白質或者多肽直接用于質譜分析上的應用，所述的生物樣品為體液或者生物樣品裂解液，所述體液為血液、尿液或唾液，所述的生物樣品裂解液為細胞裂解液、組織勻漿裂解液。

本發(fā)明的應用通過如下步驟實現(xiàn)：

(1)激活和平衡96孔高通量固相萃取裝置；

(2)將多個生物樣品溶液分別加入96孔高通量固相萃取裝置的各自孔道，利用96孔高通量固相萃取裝置的組合在真空或重力離心下分離掉雜質和鹽分后，用萃取液提取蛋白質和多肽溶液保留在收集板中；

(3)提取蛋白質和多肽溶液直接用于質譜分析。

本發(fā)明裝置的目的是簡便高通量對生物樣本進行前處理用于質譜蛋白質組學分析的應用。激活和平衡96孔高通量固相萃取柱后，直接將血液、尿液、唾液、細胞或組織裂解液等制成的多個樣本溶液分別加入各自孔道中，用緩沖液沖洗掉雜質并保留蛋白質或多肽后，用萃取液富集和提取蛋白質或多肽溶液進入96孔樣本收集板，溶液可直接用于質譜檢測，不需要額外干燥、富集、溶解等步驟。整個過程操作簡便、快速、高通量，在質譜的高通量生物樣本前處理中有著極好的應用價值。

附圖說明

圖1是96孔高通量固相萃取裝置側視示意圖。

圖2是96孔聯(lián)排固相萃取柱俯視示意圖。

圖3是硅膠密封蓋板密封96孔高通量固相萃取裝置在真空干燥器中示意圖。

圖4是96孔高通量固相萃取裝置在底部密封真空裝置中示意圖。

圖5是96孔高通量固相萃取裝置在96孔板離心機中示意圖。

圖6是質譜檢測結果圖。

具體實施方式

本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。但本發(fā)明不僅限于以下實施例。

實施例1 一種用于質譜分析的96孔高通量固相萃取裝置的制作

參見圖1-2，本發(fā)明提供的一種用于質譜分析的96孔高通量固相萃取裝置，96孔高通量固相萃取裝置主要結構見圖1，主要由硅膠密封蓋板1、聯(lián)排萃取柱孔2、96孔聯(lián)排萃取柱板3、上篩板4、固相萃取柱填料5、下篩板6、96孔樣本收集板7、樣本收集孔8組成，在96孔聯(lián)排萃取柱板3上排列設置聯(lián)排萃取柱孔2，聯(lián)排萃取柱孔2為兩頭開口，硅膠密封蓋板1和96孔聯(lián)排萃取柱板3通過硅膠顆粒密封，密封后在負壓環(huán)境下可提供柱孔內外壓力差使溶液流出柱體。固相萃取柱填料5填在96孔聯(lián)排萃取柱板3的96個聯(lián)排萃取柱孔2中，先在聯(lián)排萃取柱孔2中裝好下篩板6，加裝30mg固相萃取柱填料5后，再裝好上篩板4，壓緊，填裝好的96孔聯(lián)排萃取柱板3可直接放置于96孔樣本收集板7上。

96孔聯(lián)排萃取柱板3結構見圖2，規(guī)格為：板128mm長，85mm寬。按縱向8個，橫向12個排列設置96個聯(lián)排萃取柱孔2，每個聯(lián)排萃取柱孔2體積為1-2ml，聯(lián)排萃取柱孔2與普通萃取小柱結構一樣，上口部開放式，底部有一開放式小管(圖中為示出)，可插入樣本收集孔8連接96孔樣本收集板7。

96孔樣本收集板7規(guī)格為：板128mm長，85mm寬，每孔1ml柱體積，按縱向8個，橫向12個排列設置96個樣本收集孔8。每個樣本收集孔8上口部開放，每個樣本收集孔8可與96孔聯(lián)排萃取柱板3中的96個聯(lián)排萃取柱孔2底部一一對應連接。樣本收集孔8底部封閉，用于收集溶液。

固相萃取柱填料5為碳十八(C18)或者弱陽離子交換聚合物填料或者強陽離子交換聚合物，其填料重量為30-50mg。

實施例2 96孔高通量萃取裝置在真空干燥器中的應用

填裝好固相萃取柱填料5的96孔聯(lián)排萃取柱板3，置于96孔樣本收集板7上，緩沖液或樣本溶液加入96孔聯(lián)排萃取柱板3的聯(lián)排萃取柱孔2中，用硅膠密封蓋板1蓋緊96孔聯(lián)排萃取柱板3，將組裝好的整個96孔高通量萃取裝置放入真空干燥器9中，真空泵連接真空干燥器真空泵連接口10，抽真空，如圖3,溶液快速流過固相萃取柱填料5。取出96孔樣本收集板7，丟棄溶液或者收集萃取液。重新加入緩沖液或樣本溶液到聯(lián)排萃取柱孔2中，重復以上過程，直到完成蛋白質或多肽提取過程。

實施例3 96孔高通量萃取裝置在底部密封真空裝置中的應用

填裝好固相萃取柱填料5的96孔聯(lián)排萃取柱板3，置于96孔樣本收集板7上，緩沖液或樣本溶液加入96孔聯(lián)排萃取柱板3的聯(lián)排萃取柱孔2中，并置入底部密封真空裝置12中，底部密封真空裝置的橡膠或硅膠密封圈13密封96孔聯(lián)排萃取柱板3后，真空泵連接密封真空裝置真空泵連接口11抽真空，如圖4；速流過固相萃取柱填料5。取出96孔樣本收集板7，丟棄溶液或者收集樣本萃取液。重新加入緩沖液或樣本溶液到聯(lián)排萃取柱孔2中，重復以上過程，直到完成蛋白質或多肽提取過程。

實施例4 96孔高通量萃取裝置在96孔板離心機中的應用

緩沖液或樣本溶液加入填裝好固相萃取柱填料5的96孔聯(lián)排萃取柱板3的聯(lián)排萃取柱孔2中，96孔聯(lián)排萃取柱板3置于96孔樣本收集板7上，溶液加入圖中萃取柱孔2中，置96孔聯(lián)排萃取柱板3于96孔樣本收集板7上并放進96孔板離心機14，離心，如圖5；使溶液快速流過固相萃取柱填料5。取出96孔樣本收集板7，丟棄溶液或者收集樣本萃取液。重新加入緩沖液或樣本溶液到聯(lián)排萃取柱孔2中，重復以上過程，直到完成蛋白質或多肽提取過程。

實施例5 96孔高通量萃取裝置在血清臨床蛋白質質譜中的應用

實施例5將使用在實施例1描述的96孔高通量萃取裝置，并按實施例2、3、4描述的方法真空或離心來提取蛋白質。

在96孔高通量萃取裝置的每孔中分別加入1ml含80％乙腈(ACN，Acetonitrile，HPLC grade，美國Sigma Inc.)的激活溶液，真空或離心去掉溶液，激活萃取柱，每孔加入1ml含0.5％三氟乙酸(TFA，Trifluoro-Acetic Acid，美國Sigma Inc.)和5％乙腈的平衡液，真空或離心去掉溶液，平衡萃取柱。每個血清樣本分別取60ul，分別加入20ul含2％TFA和20％乙腈的樣本緩沖液，配置樣本溶液后分別加入各個萃取柱孔中，真空或離心去掉溶液。每孔加入1ml含0.5％TFA和5％乙腈的平衡液，真空或離心洗掉填料上殘留小分子或鹽份等。每孔加入100ul含70％乙腈和0.1％TFA的樣本萃取緩沖液，真空或離心收集溶液到96孔樣本收集板中，萃取的蛋白質或多肽的溶液直接用于質譜檢測或者-80度冷凍保存。將每個樣本取1ul直接點于MALDI金屬靶上，干燥后加1ul基質(3mg/ml CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid,Bruker),50％ACN,2％TFA)，再次干燥后置于MALDI-TOF儀器中檢測。檢測結果如圖6，圖6a和6b為同一個血清樣本分兩個重復處理，圖6c和6d為另一個血清樣本，同樣一個血清樣本分兩個重復處理。從圖中可以看出本裝置具有很好的重復性和敏感。