本申請是國際申請日為2009年9月24日的國際申請pct/us2009/058270進入中國、申請?zhí)枮?00980146571.3的題為“用于檢測分析物的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2008年9月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/099,830的利益，其通過引用并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域和

背景技術(shù)：

檢測特定靶物的重要性。用于檢測特定的分子、細胞和病毒靶物的方法，是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)診斷、環(huán)境試驗和工業(yè)質(zhì)量控制的基礎(chǔ)工具。在臨床醫(yī)學(xué)中用于檢測特定靶物的方法的實例包括柜臺有售的快速妊娠試驗、用于測定傳染因子對特定抗生素的抗性的微生物學(xué)培養(yǎng)試驗，和血樣中癌癥標志物的高度自動化的試驗。檢測食物中的病原體污染物、用于藥物開發(fā)的候選化合物的高效篩選、定量藥物中的活性成分，例證了依賴于用于測定特定靶物的存在的方法的工業(yè)生產(chǎn)用途。需要測試特定靶物的環(huán)境用途包括，檢測供水污染、空氣傳播的生物威脅因子和家庭的真菌污染。

用于檢測特定靶物的方法的希望的屬性。用于檢測特定靶物的方法應(yīng)當是準確的，也就是說，它們應(yīng)當是靈敏的和特異性的。所述方法應(yīng)當足夠靈敏，以檢測以顯著量存在的靶物。而且它們應(yīng)當是特異性的；它們不應(yīng)當指示不以顯著量存在的靶物。其它有益屬性包括潛在靶分析物的寬度、快速結(jié)果、容易使用、節(jié)省成本、靶物量化、和自動化。不同的希望的屬性的重要性可以取決于特定用途和測試地點。

靶物的寬度。測試方法應(yīng)當能檢測寬范圍的特定靶物。代表性的靶物類型包括人細胞(例如，在hiv/aids診斷中的cd4+細胞)、細菌細胞(例如，甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌或mrsa或大腸桿菌)、病毒(例如，丙型肝炎病毒)、朊病毒(例如，牛海綿狀腦病因子，即“瘋牛病”的病因)、大分子(例如，蛋白、dna、rna、碳水化合物)和小分子(例如，化學(xué)治療藥、脂質(zhì)、糖、氨基酸、核苷酸)。

標記特定靶物。一個用于檢測特定細胞、病毒或分子的重要方案是，用光學(xué)上可檢測的標記來標記靶物，所述標記特異性地結(jié)合靶物。靶物特異性標記可以具有不同類型的靶物結(jié)合部分，包括大分子(例如，抗體、蛋白受體、核酸、碳水化合物和凝集素)和小分子(例如，激素、濫用藥、代謝物)。靶物特異性標記的可檢測的信號發(fā)射部分可以使用多種信號發(fā)射模式，包括熒光、磷光、色原體發(fā)光（chromogenicity）、化學(xué)發(fā)光、光散射和拉曼散射。

用于檢測特異性地標記的靶物的存在的方法。已經(jīng)為檢測樣品中特異性地標記的靶分子、細胞和病毒的存在而開發(fā)了許多方法。所述技術(shù)的差別在于容納的樣品的類型、標記與靶物的結(jié)合模式、由標記遞送的信號的類型、檢測的標記的靶物的多樣性、將結(jié)合的標記與未結(jié)合的標記區(qū)分開的方法、和用于檢測特異性地標記的靶物的技術(shù)。

使用哪種方法取決于要檢測的分析物的類型、測試地點、需要的自動化程度、臨床上有關(guān)的濃度范圍、操作人員的技術(shù)、和價格敏感性。例如，免疫測定使用靶物特異性的抗體進行檢測。為了使它們是光學(xué)上可檢測的，可以將抗體連接到信號發(fā)射部分上，包括放射性同位素、熒光分子、化學(xué)發(fā)光分子、生成有色產(chǎn)物的酶、用熒光化合物染色的顆粒、共振光散射顆?；蛄孔狱c?；诳贵w的技術(shù)包括手工側(cè)向流、elisa、流式細胞術(shù)、直接熒光免疫測定、蛋白印跡和高度自動化的中心實驗室方法。類似地，特定核酸序列的檢測可以使用與許多類型的信號部分結(jié)合的互補核酸探針，其中使用包括核酸擴增、dna和rna印跡以及原位雜交在內(nèi)的方法。

使用成像來計數(shù)標記的靶物。成像是用于檢測在檢測表面上的特異性地選擇的標記的靶物的有力方法。成像方法將從檢測區(qū)中的每個點發(fā)射出的光信號映射成圖像中的對應(yīng)點。相反，非成像檢測方法通常整合從整個檢測區(qū)發(fā)射出的光信號。

一些成像方法可以檢測和計數(shù)單個標記的靶分子。與檢測區(qū)整合方法相比，計算特異性地標記的靶分子可以導(dǎo)致非常低靶物水平的檢測。基于圖像的靶物計數(shù)方法的靈敏度優(yōu)點主要源自下述事實，即隨著靶物水平降低，光信號與背景之比基本上保持恒定。相反，對于檢測區(qū)整合方法，隨著靶物水平降低，信號與背景之比降低。

一類方法通過用顯微光束系統(tǒng)性掃描檢測區(qū)來建立圖像。掃描方法比使用數(shù)字陣列檢測器(例如，ccd或cmos照相機)來同時計算整個檢測區(qū)中的特異性地標記的靶物的方法耗費更多時間。

用于靈敏的靶物計數(shù)的在低放大率的大面積成像。一些方法使用高放大率顯微術(shù)來計算單個微型靶物。顯微成像缺少靈敏度，因為每個圖像僅取樣小面積?？梢詫Ω蟮拿娣e連續(xù)成像，但是許多圖像的獲取是費力的、昂貴的且耗時的?；蛘撸梢允褂迷诘头糯舐实拇竺娣e成像，單個地檢測和計算標記的微型靶物。低放大率成像可以在單個圖像中計算在相對大面積中的小量微型靶物。

已經(jīng)開發(fā)了一些使用大面積自動化數(shù)字成像的方法，用于同時檢測單個標記的靶物。這些方法通常在毛細管室中檢測標記的靶物，并使用側(cè)向流來去除未結(jié)合的標記。關(guān)于其它側(cè)向流方法，該技術(shù)方案使自動化復(fù)雜化，并限制可以方便地分析的樣品的體積。

使用選擇來從游離標記和其它標記的實體分離特異性地標記的靶物。為了檢測特異性地標記的靶物，方法通常必須從結(jié)合的標記去除或區(qū)分開未結(jié)合的標記和其它標記的實體。一個常見的方案使用標記的靶物絡(luò)合物的物理選擇，然后可以通過重復(fù)洗滌來去除游離標記。該方案盡管有效，但是通常需要勞力（對于手工方法而言）或復(fù)雜的液體處理工程（對于自動化系統(tǒng)而言）。

標記的靶物絡(luò)合物的選擇，可以通過對靶物特異性的結(jié)合部分包被的表面上的物理捕獲來介導(dǎo)(例如，在elisa或側(cè)向流試驗中的捕獲抗體，或在微陣列試驗中的dna探針)。類似地，通過使用靶物-結(jié)合部分包被的選擇顆粒，可以從游離標記分離標記的靶物絡(luò)合物。例如，在去除游離標記的洗滌步驟中，可以使用磁性選擇來選擇結(jié)合到靶物特異性的磁性顆粒上的標記的靶物絡(luò)合物。

通過使用毛細管流來從標記的靶物（其通過捕獲在表面上而被選擇）洗去游離標記，側(cè)向流方法可以在一定程度上簡化洗滌過程。這類洗滌可能需要加入洗液，作為額外的用戶步驟。側(cè)向流方法不是非常靈敏的，且通常不適用于圖像分析、自動化或高處理量。

不需要洗滌來從特異性地標記的靶物去除游離標記的方法。已經(jīng)開發(fā)了幾種方法，其檢測用標記的靶物特異性的結(jié)合部分特異性地絡(luò)合的靶物。一類方法使用除非它們結(jié)合靶物時不發(fā)射信號的標記。這些標記具有限制，因為它們不會發(fā)射足夠強的信號用于單個標記的靶物的有效大面積檢測。不需要洗滌的另一種方法通過液相屏障進行選擇，以從未結(jié)合的標記中分離出標記的靶物絡(luò)合物。該方案使用檢測區(qū)整合而不是靈敏的圖像分析，因而缺少高靈敏度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種改進的用于靈敏且特異性地檢測靶分子、細胞或病毒的方法。本發(fā)明的方法使用大面積成像來檢測與靶物特異性的選擇部分絡(luò)合的單個標記的靶物。本發(fā)明通過一個或更多個液體層使用靶物特異性的選擇，消除了洗滌步驟，所述液體層可以含有光學(xué)染料和密度試劑。通過消除洗滌，本發(fā)明簡化了儀器化工程，并使用戶步驟和成本最小化。本發(fā)明使用靈敏的圖像分析來計算大面積中的單個靶物，是可放大的，且可以用于復(fù)雜性范圍是從手工到高度自動化的系統(tǒng)中。

在一個方面，本發(fā)明表征了用于檢測樣品中一種或更多種靶物的方法，例如，測量在至少2個正交維數(shù)的小于50微米的方法：提供具有檢測表面的容器，所述檢測表面具有最短線性尺寸≥1mm的檢測區(qū)；在容器的液體覆蓋層中，使信號發(fā)射部分(例如，具有光子信號發(fā)射特征)、選擇部分接觸包含靶物的組合物，以形成靶物和信號發(fā)射部分或選擇部分的絡(luò)合物；施加選擇力，以移動覆蓋層中的選擇部分通過下面的墊子層，并接觸檢測表面；和檢測與檢測區(qū)相對應(yīng)的檢測帶內(nèi)的信號發(fā)射部分，由此檢測靶物。所述方法不包括洗滌步驟。下面的墊子層可以包括染料，其干擾投向或來自信號發(fā)射部分的光的生成或透射。

在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明表征了用于檢測樣品中一種或更多種靶物的方法，例如，測量在至少2個正交維數(shù)的小于50微米的方法：提供具有檢測表面的容器，所述檢測表面具有最短線性尺寸≥1mm的檢測區(qū)；在容器的液體中，使一個或更多個信號發(fā)射部分(例如，具有光子信號發(fā)射特征)、選擇部分接觸包含靶物的組合物，以形成靶物和信號發(fā)射部分或選擇部分的絡(luò)合物；施加選擇力，以移動絡(luò)合物通過液體，并接觸檢測表面；和檢測與檢測區(qū)相對應(yīng)的檢測帶內(nèi)的信號發(fā)射部分，由此檢測靶物。所述方法不包括洗滌步驟。

在本發(fā)明的不同的實施方案中，所述信號發(fā)射部分或選擇部分綴合到種類-結(jié)合分子上，諸如抗體、抗原、凝集素、核酸分子、配體、受體或小分子。優(yōu)選地，所述信號發(fā)射部分特異性地結(jié)合靶物?？梢酝瑫r檢測靶物與檢測帶中的信號發(fā)射部分的單個絡(luò)合物，例如，使用光電陣列檢測器。優(yōu)選地，檢測采用小于5×的放大率，例如，零放大率。示例性的靶物是細胞，諸如細菌細胞(例如，金黃色葡萄球菌細胞或炭疽芽孢桿菌)或由微生物細胞分泌的分子。當檢測細胞時，所述方法可以另外包括，使細胞接觸特異性地結(jié)合細胞內(nèi)部組分（例如，核酸分子或脂質(zhì)）的第二個信號發(fā)射部分?？梢怨馄祝╬hotobleach）第二個信號發(fā)射部分，所述方法可以包括，在光漂白以后，檢測原始的信號發(fā)射部分。示例性的信號發(fā)射部分是熒光顆粒和dna染色劑?？梢詫悠放c微生物生長培養(yǎng)基相組合，例如，所述培養(yǎng)基包含抗生素或微生物生長抑制劑，然后溫育超過1小時，再接觸選擇或信號發(fā)射部分。信號發(fā)射部分或選擇部分可以以干燥形式存在于容器中。當存在時，下面的墊子層可以以干燥形式存在于容器中。所述包含靶物的組合物可以水合容器中干燥形式的任意試劑。在某些實施方案中，所述組合物水合下面的墊子和信號發(fā)射和選擇部分，從而生成2個液體層。靶物可以存在于生物流體中，或從生物流體得到，所述生物流體例如，人全血、血清、血漿、粘液或尿。示例性的選擇力包括重力、磁力、電勢、離心力、向心力、浮力密度、過濾、和壓力。信號發(fā)射部分可以包括熒光團、化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑、共振光散射顆粒、光吸收或發(fā)色信號發(fā)射劑或上轉(zhuǎn)化(up-converting)磷光體。選擇部分可以包括磁性顆粒、二氧化硅顆粒或鐵蛋白。一種示例性的容器是具有大于2mm的成像深度的成像孔。

所述方法可以用作競爭測定，其中選擇部分綴合到靶物競爭物上；在選擇部分和信號發(fā)射部分之間以及在靶物和信號發(fā)射部分之間形成絡(luò)合物；所述靶物不會特異性地結(jié)合選擇部分；且通過在沒有靶物存在下形成的選擇部分和信號發(fā)射部分的絡(luò)合物的量的減小，間接地進行靶物的檢測。

在試驗裝置中可以含有一些或所有試驗試劑。用戶可以手工地或通過自動化儀器加入一些或所有試劑。試驗裝置可以是簡單的容器?；蛘?，它們可以是復(fù)雜的筒，包括，例如，一個或更多個下述物體：載泵、流控通道、閥、試劑儲存器、電子器件、檢測器、樣品輸入模塊和廢物模塊。

在某些實施方案中，所述方法采用標記顆粒作為信號發(fā)射部分。標記顆粒與靶物的接觸，導(dǎo)致靶物:標記顆粒絡(luò)合物的形成。標記顆?？梢杂糜谒龇椒ㄖ?，其量會產(chǎn)生指定的標記比，例如，小于100。

“成像”是指從檢測區(qū)同時獲取圖像。

“洗滌”是指這樣的過程，其從容器或表面物理地去除液體，所述液體含有來自靶物的不希望的組分，所述靶物不同于不希望的組分，被保留、選擇或捕獲在容器中或表面上。

“不需要洗滌”的試驗是指這樣的試驗，其中不使用洗滌步驟來檢測靶物。

“分析儀”或“成像分析儀”是指這樣的儀器，其具有本文定義的允許檢測區(qū)同時成像的陣列光檢測器和成像光學(xué)器件。分析儀可以具有許多用于增強檢測的其它功能，包括用于將選擇力施加于選擇部分上、運輸或溫育的模塊。

“孔”是指可以容納液體的容器?？淄ǔ＞哂小?mm的孔深度。

“成像孔”是指可以用于通過成像來檢測標記的靶物的孔。成像孔具有檢測表面，在所述表面上，成像分析儀可以檢測標記的靶物顆粒。位于檢測表面和成像分析儀的光檢測器之間的材料具有用于支持標記的靶物的成像檢測的光學(xué)性質(zhì)。例如，所述材料通常是可穿透的，且在與裝置的信號發(fā)射部分的信號標志相對應(yīng)的光譜區(qū)中具有低光學(xué)背景。

“成像孔深度”是指沿著垂直于檢測表面的軸的成像孔高度。

“墊子”、“密度墊子”、“液體墊子”、“墊子層”或“液體密度墊子”是指其密度大于覆蓋層的基本上液體層(例如，所述液體層的密度比覆蓋層大至少1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、30%、35%、40%或50%或更多)。在本發(fā)明中，墊子存在于成像孔中，位于檢測表面和包括樣品和實驗試劑的液體層之間。該墊子提供了實驗試劑和檢測表面之間的物理分離。使用選擇，與選擇部分絡(luò)合的標記的靶物移動穿過墊子，并沉積在檢測表面上進行成像。墊子的致密液體層將未與選擇部分絡(luò)合的信號發(fā)射部分從檢測帶排除。

“染料”是指加入反應(yīng)中的物質(zhì)或混合物，其干擾投向或來自信號發(fā)射部分的光的生成或透射。所述染料減小或消除在檢測帶以外發(fā)出的信號，同時允許檢測從檢測帶內(nèi)的信號發(fā)射部分衍生出的信號。對于包括熒光信號發(fā)射部分的裝置，染料可以吸收熒光激發(fā)頻率、熒光發(fā)射頻率或二者的光。不同的染料性質(zhì)可以用于該目的，包括光散射和吸收。在不同的實施方案中，所述染料會使信號減小至少50%、75%、85%、90%、95%或甚至99%。

“染色的墊子”是指包括染料的墊子。染色的墊子同時提供主體反應(yīng)從檢測帶的物理排除(隨著染色的墊子的密度而變化)，同時防止或減小信號從覆蓋反應(yīng)向檢測器的透射(隨著致密層中包括的染料而變化)。

“取樣裝置”是指用于收集樣品的裝置。取樣裝置的實例包括拭子、毛細管、擦拭器、燒杯、多孔過濾器、吸水過濾器和吸頭。

“靶物”是指可能存在于樣品中的細胞、病毒、分子(例如，大分子諸如蛋白、dna、rna或碳水化合物，和小分子，諸如化學(xué)治療藥、脂質(zhì)、糖、氨基酸、或核苷酸)或分子絡(luò)合物，通過本發(fā)明測試其存在。

“靶物競爭物”是指與靶物競爭結(jié)合種類-結(jié)合分子的細胞、病毒、分子(例如，大分子諸如蛋白、dna、rna或碳水化合物，和小分子，諸如化學(xué)治療藥、脂質(zhì)、糖、氨基酸、或核苷酸)或分子絡(luò)合物。靶物競爭物可以是與選擇部分綴合或穩(wěn)定連接的靶物。

“靶物種類”是指多個靶物共有的一個或更多個特征，使得多個靶物被視作對于使用本發(fā)明構(gòu)建的實驗?zāi)康亩允窍嗤?。例如，對于用于檢測所有hiv病毒的實驗，所述種類是hiv。這樣的實驗會檢測所有hiv病毒，而不區(qū)分hiv-1和hiv-2變體。在該情況下，靶物的種類包括hiv-1和hiv-2。另一個實驗的目的可能是將hiv-1與hiv-2區(qū)分開。在該情況下，每類hiv被視作不同的種類。如果實驗?zāi)康氖菣z測白色假絲酵母菌，3個探針被視作對于實驗?zāi)康亩允窍嗤?，因為它們具有共同特征，即它們特異性地結(jié)合白色假絲酵母菌，且被視作屬于相同的靶物種類分子。

“種類-結(jié)合分子”是指特異性地結(jié)合種類特異性的結(jié)合位點的分子或分子絡(luò)合物。種類-結(jié)合分子的實例是雜交基因組dna的核酸探針；已經(jīng)在體外選擇或“進化”成特異性地結(jié)合蛋白上的位點的核酸適體；結(jié)合細胞抗原或血清蛋白的抗體；和特異性地結(jié)合激素受體或結(jié)合分子（諸如抗生物素蛋白）的配體（諸如表皮生長因子或生物素）。如果它們結(jié)合不同的且無重疊的種類特異性的結(jié)合位點，則2個種類-結(jié)合分子是不同的?？梢愿鶕?jù)它們的分子組成提及種類-結(jié)合分子，例如，種類結(jié)合的寡核苷酸、探針、抗體、配體等。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“抗體”包括、例如，能特異性地結(jié)合分子或分子絡(luò)合物的任意多肽，包括、例如，完整的整個抗體、嵌合抗體、雙體、雙特異性的抗體、fab片段、f(ab’)2分子、單鏈fv(scfv)分子、串聯(lián)scfv分子和適體。完整的整個抗體包括單克隆抗體諸如鼠單克隆抗體(mab)、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化的抗體和人抗體。所述抗體也可以包括合成地衍生的序列。

“特異性地結(jié)合”是指以小于10^-6m、更優(yōu)選小于10^-7m、10^-8m、10^-9m、10^-10m、10^-11m或10^-12m和最優(yōu)選小于10^-13m、10^-14m或10^-15m的解離常數(shù)結(jié)合分子或分子絡(luò)合物的種類-結(jié)合分子。種類-結(jié)合分子與靶物種類的特異性結(jié)合可以在結(jié)合條件下發(fā)生于作為實驗掃描的種類的成員的基本上所有靶物(例如，至少約70%、80%、90%、95%、99%或更多的靶物結(jié)合種類-結(jié)合分子)，但基本上不發(fā)生于可能存在于樣品中的其它分子(例如，小于約1%、5%、10%、15%、20%或25%非靶分子結(jié)合種類-結(jié)合分子)。在掃描的種類中的靶物所結(jié)合的種類-結(jié)合分子的數(shù)目相對于不在這樣的種類中的靶物所結(jié)合的數(shù)目，通常是2倍、5倍、10倍、或大于50倍大。

“捕獲分子”是指穩(wěn)定地結(jié)合在表面、膜或非顆粒的其它基質(zhì)上的種類-結(jié)合分子。

“信號元件”是指直接產(chǎn)生可檢測信號的分子或顆粒。短語“直接產(chǎn)生”表示下述事實，即信號元件是可檢測信號的直接來源或關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。因而，如果信號是源自熒光團的光子，則所述熒光團是光子的直接來源，且因此是信號元件。如果信號是由rls顆粒散射的光子，則所述rls顆粒是信號元件?；蛘?，如果信號是從辣根過氧化物酶的發(fā)色沉淀產(chǎn)物透射或散射的光，則所述發(fā)色產(chǎn)物是信號元件。

信號元件的一個特征是，這樣的元件不可分成部分，使得每個部分產(chǎn)生與整體相當(按照特征，不一定按照強度)的信號。因而，2nm直徑量子點是信號元件，因為分割它會改變得到的納米晶體的特征(發(fā)射譜)。用諸如熒光素等熒光染料浸漬的5μm顆粒不是信號發(fā)射元件，因為它可以分成部分，使得每個部分具有與完整顆粒相當?shù)男盘柊l(fā)射特征。相反，分子熒光素是信號發(fā)射元件。信號產(chǎn)生酶(例如，螢光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)的可檢測產(chǎn)物也被視作信號元件。這樣的信號元件(或它們的前體，當存在前體向信號元件的化學(xué)轉(zhuǎn)化時)可以是可擴散物質(zhì)、不溶產(chǎn)物和/或不穩(wěn)定中間體。例如，酶堿性磷酸酶將化學(xué)發(fā)光底物cdp-star(nen;目錄號nel-601)轉(zhuǎn)化成活化產(chǎn)物，它是發(fā)射光子的信號元件。

“信號發(fā)射部分”是指這樣的分子、顆?；蛭镔|(zhì)，其包括或產(chǎn)生(在酶的情況下)一個或更多個信號元件，且是或可以穩(wěn)定地連接到種類-結(jié)合分子上。信號發(fā)射部分可以共價地或非共價地、直接地或間接地(例如，通過一個或更多個連接物或“化學(xué)連接物”部分，或通過綴合到相同顆粒上的兩個部分)結(jié)合到種類-結(jié)合分子上。信號發(fā)射部分的實例包括羧基化的量子點；修飾成結(jié)合核酸探針或抗體探針的熒光團（諸如德克薩斯紅）；抗生蛋白鏈菌素-包被的熒光聚苯乙烯顆粒(其可以綴合到生物素化的種類特異性的結(jié)合蛋白上)；含有重復(fù)核酸序列的滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物，每個所述序列可以雜交幾個寡核苷酸，所述寡核苷酸以熒光修飾的核苷酸為尾巴，且在5'末端含有種類特異性的結(jié)合寡核苷酸。信號發(fā)射部分可以包括物理上不同的元件。例如，在某些情況下，所述信號發(fā)射部分是綴合到種類-結(jié)合分子(例如抗體)上的酶(例如，堿性磷酸酶)。當堿性磷酸酶的底物(例如，cdp-star或bm紫，分別來自nen和roche)被轉(zhuǎn)化成信號元件產(chǎn)物(例如，發(fā)射光子的不穩(wěn)定中間體，或可沉淀的發(fā)色產(chǎn)物)時，產(chǎn)生信號。對于種類-結(jié)合分子、酶促信號發(fā)射部分和在不同時間應(yīng)用于反應(yīng)中的底物，它不是罕見的。

“顆?！笔侵赋叽缧∮?0微米的基質(zhì)。一群或一批顆粒的尺寸被定義為顆粒樣品的最長正交維數(shù)對的平均測量。最長正交維數(shù)對是這樣的顆粒正交維數(shù)對，其長度總和是該顆粒的所有這種總和的最大值。如果2個顆粒的樣品分別具有1微米×2微米和2微米×3微米的最長正交維數(shù)對，最長正交維數(shù)對的平均測量是2微米[(1+2+2+3)/4=2微米]。顆粒樣品的最長正交維數(shù)對的平均測量是，例如，小于50微米、小于20微米或小于5微米。

許多顆粒具有一些固體特征。但是，可能不是剛性的分子支架或絡(luò)合物也被定義為顆粒。例如，樹枝狀聚合物或其它分支分子結(jié)構(gòu)被視作顆粒。類似地，脂質(zhì)體是另一類顆粒。顆粒可以結(jié)合或綴合到信號元件上。經(jīng)常用反映它們的尺度或幾何形狀的術(shù)語，表示顆粒。例如，術(shù)語納米球、納米顆粒或納米珠用于表示沿著任意給定軸測量小于1微米的顆粒。類似地，術(shù)語微球、微?；蛭⒅橛糜诒硎狙刂我饨o定軸測量小于1毫米的顆粒。顆粒的實例包括膠乳顆粒、聚丙烯酰胺顆粒、磁體微粒、鐵磁流體(磁性納米顆粒)、量子點等。

“標記顆粒”是指可以特異性地結(jié)合靶物并產(chǎn)生信號的顆粒。標記顆粒綴合到信號發(fā)射部分和種類-結(jié)合分子上。

“靶物:標記顆粒絡(luò)合物”是指一種或更多種靶物特異性地結(jié)合的標記顆粒。

“標記比”是指在接觸步驟中靶物與標記顆粒之比。例如，如果使1×10⁷標記顆粒接觸含有1×10⁶靶物的樣品，則標記比是0.1。為了計算標記比的目的，僅考慮可以特異性地結(jié)合標記顆粒的靶物。例如，在計算中不包括物理上不可達到的靶物(例如，隔絕在細胞隔室中)。

信號元件或信號部分的“信號特征”(signalcharacter)是指由所述信號元件或信號發(fā)射部分產(chǎn)生的信號的一個或更多個方面，其可以用于與其它信號元件或信號發(fā)射部分區(qū)分開。例如，用熒光素和羅丹明標記的信號發(fā)射部分的信號特征是熒光。放射轉(zhuǎn)發(fā)器的特征是射頻。光子信號發(fā)射特征的實例是熒光、光散射、磷光、反射比、吸光度、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光。所有（除了最后2個實例以外）光子信號發(fā)射特征依賴于外部輻照(例如白光源、激光源、或日光)。相反，化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光是獨立于外部光源的信號發(fā)射特征。

“信號標志”(signalsignature)是指結(jié)合實驗靶物種類的信號發(fā)射部分的組合的特征性信號發(fā)射特性。結(jié)合4類抗體（其中之一綴合到熒光素分子上，其中3類用羅丹明分子綴合）的靶物具有用熒光素和羅丹明的組合的加權(quán)的吸光度和發(fā)射譜描述的信號標志。

“選擇力”是指用于捕獲、分離、移動或隔絕靶物的力。選擇力的實例包括重力、磁力、電勢、離心力、向心力、浮力密度和壓力。通過單獨作用于靶物上的選擇力，可以移動靶物。或者，可以使選擇力特異性地作用于與選擇部分結(jié)合的靶物上(參見下文定義)。

施加選擇力來移動靶物的實例包括：靶物的離心；結(jié)合到磁性顆粒上的靶物的磁性選擇；用金屬顆粒標記的靶物的重力沉降；和通過真空過濾將靶物沉積在多孔膜上。在下面的實施例中包括了選擇力的應(yīng)用的其它實例。

“選擇部分”是指這樣的原子、分子、顆粒或其它實體，其可以綴合到種類-結(jié)合分子上，并給種類-結(jié)合分子賦予通過選擇力被選擇性地捕獲、分離、移動或隔絕的能力。當種類-結(jié)合分子:選擇部分絡(luò)合物特異性地結(jié)合靶物時，所述靶物通常還可以通過選擇力被選擇性地捕獲、分離、移動或隔絕?！斑x擇性的”表示選擇力對選擇部分和結(jié)合的實體的移動的優(yōu)先賦予易感性超過選擇部分未結(jié)合的實體。

順磁顆粒和鐵蛋白是選擇部分的實例。在溶液中下沉的致密的二氧化硅顆粒是另一類選擇部分。當被種類-結(jié)合分子包被且結(jié)合微生物靶物時，這樣的顆粒會造成靶物在水溶液中下沉，由此將結(jié)合的靶物與其它樣品未結(jié)合的組分分離。

“選擇特征”是指可用于捕獲、選擇或移動選擇部分的選擇部分的一個或復(fù)數(shù)個方面。例如，順磁顆粒的選擇特征是磁性。在水溶液中快速下沉的二氧化硅顆粒的選擇特征是密度。

“大致平面的”表面或基底是指這樣的表面，其可以平行地對齊假想平面，使得當從該表面上的任何1mm×1mm正方形中的點向假想平面上的最近點測量距離時，平均距離的絕對值小于50微米。

“檢測表面”是指，在本發(fā)明的某些實施方案中，在其上面沉積靶物的大致平面基底的表面。在使用光子信號發(fā)射特征的實施方案中，如果所述檢測表面是透光的，通過檢測表面的任一面，可以實現(xiàn)檢測。如果所述檢測表面是不透光的，通過沉積靶物的檢測表面的一面，可以實現(xiàn)檢測。

“檢測區(qū)”是指通過本發(fā)明同時分析的檢測表面區(qū)域或檢測帶。檢測區(qū)的最長線性尺寸通常大于1mm，例如，大于5mm、10mm或15mm。例如，通過包括集合透鏡和ccd芯片的光學(xué)裝置同時成像的載玻片部分可以測量0.8cm×0.5cm。則檢測區(qū)是0.4cm²。

“檢測帶”是指可以在其中檢測靶物的體積。檢測帶具有與檢測區(qū)相同的尺度，但是具有與可以在其中檢測和鑒別標記顆粒的深度相對應(yīng)的深度。檢測帶的深度因此依賴于用于評分陽性信號的閾值標準。當使用光學(xué)檢測時，檢測帶的深度依賴于場的光學(xué)深度。

檢測區(qū)的“最長尺度”是指在檢測區(qū)周邊上的2個點之間可以繪制的最大長度線。例如，如果檢測區(qū)是測量為0.3cm×0.4cm的矩形，檢測區(qū)的最長尺度是對角線0.5cm。如果檢測區(qū)是半長徑長度為7mm且半短徑長度為2.5mm的橢圓形，檢測區(qū)的最長尺度是14mm。

檢測區(qū)的“最短尺度”是指在檢測區(qū)周邊上的2個點之間可以繪制的最小長度線。例如，如果檢測區(qū)是測量為0.3cm×0.4cm的矩形，檢測區(qū)的最短尺度是對角線0.3cm。如果檢測區(qū)是半長徑長度為7mm且半短徑長度為2.5mm的橢圓形，檢測區(qū)的最短尺度是5mm。

“大面積檢測”或“大面積成像”是指用于檢測微型靶物的方法，其中檢測區(qū)(通過檢測裝置同時分析的區(qū)域)遠遠大于靶物。用于大面積檢測的檢測區(qū)具有≥1mm的線性尺度。相反，微型靶物實質(zhì)上更小，通常在至少2個正交維數(shù)測量小于50μm。大面積檢測的實例包括：用ccd照相機對9mm直徑檢測區(qū)成像；通過用具有1cm長尺寸的ccd線性掃描器掃描，對2cm×1cm矩形成像；使用直接暴露于照相膠片，對含有微生物靶物的4cm×4cm濾光片成像；和在快速側(cè)向流試驗紙檢驗中，目檢與1cm×3cm實驗區(qū)上的微型靶物相對應(yīng)的色斑。

“綴合”或“穩(wěn)定結(jié)合”是指2個實體之間的物理結(jié)合，其中結(jié)合的平均半衰期是在pbs中在4℃至少1天。

在檢測區(qū)部分中“同時檢測”靶物是指在一個步驟中檢測來自大致平面的檢測表面部分的信號。使用ccd芯片、目檢或基于光電二極管的信號整合對檢測區(qū)的靶物進行大面積成像，是同時檢測的實例。

“樣品”是指通過本發(fā)明掃描靶物的存在的物質(zhì)。

“直接目檢”是指在沒有除了可佩戴式矯正透鏡以外的其它儀器的輔助下的目檢。例如，直接目檢可以用于在某些快速側(cè)向流試驗中檢測納米金顆粒的淡紅色的反射信號。

“光電檢測器”是指將光子信號轉(zhuǎn)換成電信號的人造裝置或儀器。光電檢測器的實例包括ccd檢測器、光電倍增管檢測器和光電二極管檢測器、例如，雪崩光電二極管。

“輻照”是指用電磁輻射照射。不同波長的電磁輻射可以用于輻照。它包括，例如，用在x-射線、紫外線、可見光或紅外線光譜區(qū)域中的波長輻照。應(yīng)當指出，輻照不一定在可視區(qū)。

具有“光子信號發(fā)射特征”的信號元件或信號發(fā)射部分是指這樣的信號元件或信號發(fā)射部分，其可以通過光子的發(fā)射、反射、散射、折射、吸收、捕獲或重定向或光子行為的任意其它調(diào)節(jié)或組合來檢測。具有光子信號發(fā)射特征的信號元件或信號發(fā)射部分的某些實例包括：熒光團德克薩斯紅(熒光信號發(fā)射特征);cdp-star(化學(xué)發(fā)光信號發(fā)射特征);螢光素酶(生物發(fā)光信號發(fā)射特征);共振光散射顆粒(光散射信號發(fā)射特征);bm紫(光吸收或發(fā)色信號發(fā)射特征);和上轉(zhuǎn)化磷光體(吸收2個長波長光子，并發(fā)射1個更短波長光子)。

pbs是磷酸鹽緩沖鹽水溶液，其含有:120mmnacl、2.7mmkcl和10mm磷酸鹽緩沖液(鈉鹽)ph7.4。

pbs-tbp是磷酸鹽緩沖鹽水溶液，其含有:120mmnacl、2.7mmkcl和10mm磷酸鹽緩沖液(鈉鹽)ph7.4，所述磷酸鹽緩沖液含有2mg/mlbsa、0.05%吐溫20和0.05%v/vproclin?300。

tris-tbp是20mmtrishclph7.4，其含有2mg/mlbsa、0.05%吐溫20和0.05%v/vproclin?300。

edac是(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺。

bsa是牛血清白蛋白。

ccd是電荷耦合器件。

cfu是集落形成單位(與存活細菌細胞的數(shù)目相對應(yīng)的細菌濃度的度量)。

hbv是乙型肝炎病毒。

hcv是丙型肝炎病毒。

hiv是人免疫缺陷病毒。

tsh是促甲狀腺激素。

除非另外指出，在本說明書中描述的微生物菌株從維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)得到。

附圖說明

圖1.特異性的和非特異性的標記的比較。

圖2.用于使樣品接觸其它反應(yīng)組分的方法。

圖3.捕獲靶物的不同方法。

圖4.用發(fā)熒光的dna染色劑標記金黃色葡萄球菌——金黃色葡萄球菌dna的syto-13?染色的相對對數(shù)熒光強度。

圖5.用綴合到熒光納米顆粒上的雞抗-蛋白a抗體標記金黃色葡萄球菌細胞。被抗體包被的熒光顆粒染色的金黃色葡萄球菌細胞的相對對數(shù)熒光強度。

圖6.通過流式細胞術(shù)測定金黃色葡萄球菌特異性的熒光顆粒的結(jié)合效率。

圖7.測試被抗-金黃色葡萄球菌抗體包被的磁性顆粒。生物試驗顯示了在磁性選擇后金黃色葡萄球菌磁性捕獲百分比與磁性顆粒的數(shù)目的關(guān)系。

圖8.鉻變素2r染料吸收在與成像儀使用的激發(fā)和發(fā)射濾光器透過的光相對應(yīng)的波長的光。

圖9.染料可以用于減弱來自熒光顆粒的信號。

圖10.使用磁性捕獲和染料測定人血清中的人促甲狀腺激素(htsh)。

圖11.證實使用人促甲狀腺激素試驗試劑對染料和墊子的影響的染料-墊子試劑的實驗。

圖12.證實使用tsh試驗試劑對染料和墊子的影響的染料墊子試劑的實驗。htsh的磁性選擇實驗。

圖13.當樣品是全血時，形成雙層系統(tǒng)所需的密度試劑的濃度。

圖14.通過計算經(jīng)染料墊子選擇后的單個熒光微粒，對全血中htsh的靈敏檢測。

圖15.使用磁性捕獲、墊子染料試劑、載體磁體，檢測人全血中的人促甲狀腺激素(htsh)(實施例8)。

圖16.使用分散的磁性捕獲和墊子染料試劑，測定人血漿中的人促甲狀腺激素(htsh)(實施例9)。

圖17.使用分散的磁性捕獲和墊子染料試劑，測定人血漿中的人促甲狀腺激素(htsh)(實施例9)。

圖18.使用磁性捕獲和墊子染料試劑，檢測人血漿中的細菌炭疽芽孢桿菌致死因子(lf)(實施例10)。

圖19.使用磁性捕獲和墊子染料試劑，檢測人血漿中的細菌炭疽芽孢桿菌致死因子(lf)(實施例10)。

圖20.使用磁性捕獲和墊子染料試劑，檢測人血漿中的細菌炭疽芽孢桿菌保護抗原(pa)(實施例11)。

圖21.使用磁性捕獲和墊子染料試劑，檢測人血漿中的細菌炭疽芽孢桿菌保護抗原(pa)(實施例11)。

圖22.檢測人尿中的細菌炭疽芽孢桿菌聚-d-γ-谷氨酸(pdga)莢膜多肽(實施例12)。

圖23.檢測人尿中的細菌炭疽芽孢桿菌聚-d-γ-谷氨酸(pdga)莢膜多肽(實施例12)。

圖24.通過自動化分析，檢測人全血中的細菌炭疽芽孢桿菌致死因子(實施例13)。

圖25.用于檢測細菌蛋白炭疽芽孢桿菌聚-d-γ-谷氨酸莢膜多肽的競爭免疫測定(實施例14)。

圖26.用于人tsh和細菌炭疽芽孢桿菌pa和pdga的陽性和陰性內(nèi)部試驗對照(實施例15)。

圖27.在通過染料墊子進行磁性選擇后，計算被dna染色劑標記的單個金黃色葡萄球菌細胞(實施例16)。

圖28.使用dna染色劑和特異性的磁體的非特異性標記的金黃色葡萄球菌染料墊子試驗的特異性(實施例16)。

圖29.通過使用非特異性的sybrgreendna染色進行檢測，并使用染料墊子試劑進行磁性選擇，檢測金黃色葡萄球菌(實施例16)。

圖30.用綴合到熒光納米顆粒上的雞抗-蛋白a抗體標記金黃色葡萄球菌細胞(實施例17)。

圖31.使用特異性標記（綴合到熒光納米顆粒上的雞抗-蛋白a抗體）的金黃色葡萄球菌試驗的特異性(實施例17)。

圖32.通過使用綴合到熒光顆粒上的雞抗-蛋白a抗體進行檢測，并使用染料墊子試劑進行磁性選擇，檢測金黃色葡萄球菌細胞(實施例17)。

圖33.通過細胞的選擇性生長和免疫檢測，檢測甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)的方法(實施例18)。

圖34.通過細胞的選擇性生長和免疫檢測，檢測甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)(實施例18)。

圖35.人促甲狀腺激素試劑的試劑-低壓凍干的穩(wěn)定化(實施例19)。

圖36.使用低壓凍干的試劑的人促甲狀腺激素試驗(實施例19)。

圖37.甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌試劑的試劑-低壓凍干的穩(wěn)定化(實施例20)。

圖38.使用低壓凍干的試劑的金黃色葡萄球菌試驗(實施例20)。

圖39.通過選擇的絡(luò)合物的移動，特異性地檢測生物素(實施例21)。

圖40.在使用光漂白的試驗中，特異性地檢測金黃色葡萄球菌(實施例22)。

圖41.光漂白用于鑒別圖像中的碎片（debris）的應(yīng)用，其中所述標記是對光漂白敏感的(實施例23)。

圖42：自動化分析儀的筒的照片。

圖43：自動化分析儀的照片。

圖44：自動化分析儀的示意圖。

圖45：自動化分析儀的成像光學(xué)系統(tǒng)的示意圖。

圖46：磁體組合裝置的示意圖。

圖47：單個標記的金黃色葡萄球菌細胞的檢測的一系列圖像。

具體實施方式

本發(fā)明的概述。本發(fā)明測試樣品中微型靶物(細胞、病毒、分子(例如，大分子諸如蛋白、dna、rna或碳水化合物，和小分子，諸如化學(xué)治療藥、脂質(zhì)、糖、氨基酸、核苷酸)或分子絡(luò)合物)的存在，其中使用靈敏的大面積來計數(shù)單個標記的靶物和不需要洗滌步驟的方法。本發(fā)明的這些屬性允許準確的、靈敏的、特異性的、快速的、容易地使用的、和節(jié)省成本的測試，同時簡化儀器化工程，并使用戶步驟最少化。所述方法可以使用在本文中和在2009年9月24日提交的標題為“imaginganalyzerfortestinganalytes”的國際申請?zhí)朹_________（其通過引用并入本文）中所述的成像分析儀來實現(xiàn)，和/或用在本文中和在2009年9月24日提交的標題為“kitsanddevicesfordetectinganalytes”的國際申請?zhí)朹_________（其通過引用并入本文）中所述的試劑盒或裝置來實現(xiàn)。

在下面的部分中描述了所述方法的一些關(guān)鍵功能和屬性：

1.樣品

2.靶物

3.樣品處理

4.實驗裝置

5.標記

6.選擇

7.試驗形式

8.接觸

9.沉積

10.區(qū)分標記的靶物

11.檢測

12.分析

13.組合裝置

1.樣品

可能含有靶物且可以通過本發(fā)明測試的樣品可以是液體、固體、氣體或所有3種的組合。樣品類型包括臨床樣品(例如，血液或尿)、生產(chǎn)樣品(例如，食品或藥物)和環(huán)境樣品(例如，空氣、表面或水)。樣品可以是基本上均勻的，例如含有溶質(zhì)和少數(shù)微粒的液體，或樣品可以是非均勻的，諸如泥土或來自環(huán)境樣品（諸如土壤）的其它顆粒的懸浮液。樣品可以含有一類或更多類靶物，且所述靶物可以是天然的或合成的靶物，或天然的和合成的靶物的混合物，例如血液可以含有激素(天然物質(zhì))和合成的藥物。

使用本發(fā)明可以測試的樣品來源可以包括人類、動物、植物，且樣品類型可以包括尿、血液、膽汁、滑膜關(guān)節(jié)液、血清、血漿、脊髓液、羊水、汗水、鼻和呼吸道液體、陰道分泌物、精液、傷口滲出物、痰和支氣管肺泡灌洗液、來自節(jié)肢動物或軟體動物的血淋巴、或從植物獲得的流體（諸如細胞液）。樣品還可以包括來自人類或其它生物體的固體，和可能具有液體或固體特性的樣品（諸如糞便），它們可以從澄明液體至堅硬固體等，諸如骨，毛發(fā)，干燥的細胞，皮膚樣品，新鮮的、冷凍的或固定的病理樣品，和從鼻、鼻咽、咽喉、腋窩、會陰或直腸部位采取的拭子。其它生物樣品包括來自生物來源的氣體，諸如屁，或從口腔或鼻腔收集的氣體。

樣品包括來自天然的、工業(yè)的或商業(yè)來源的材料，包括原料、生產(chǎn)中的、制造好的或完成的產(chǎn)品，諸如食物、飲料、動物飼料、化妝品、藥品或獸醫(yī)產(chǎn)品、肥料、聚合物、塑料、橡膠、木材或紙產(chǎn)品、編織物、和用于人類或動物的局部或內(nèi)部應(yīng)用的產(chǎn)品、或上述任一種的中間體。其它類型的樣品包括來自研究或測試實驗室的材料，諸如細胞培養(yǎng)上清液、體外培養(yǎng)的細胞、來自用于研究或測試的動物（諸如小鼠或豚鼠）的樣品、或用于測試目的而培養(yǎng)或采集的植物樣品。樣品可以包括來自天然來源的液體、固體或氣體，諸如用于監(jiān)測細菌或化學(xué)物質(zhì)的湖或河水樣品，要測試化學(xué)物質(zhì)、毒素或微生物的土壤。

使用本發(fā)明，還可以測試生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測樣品，諸如從工業(yè)或醫(yī)學(xué)設(shè)備得到的樣品（對于環(huán)境或化學(xué)監(jiān)測而言）。例如，通過拭或抹用于生產(chǎn)或儲存食物或飲料的裝置的表面，可以得到樣品。

樣品可以含有活微生物，例如象在發(fā)酵液中，在來自具有血液感染的人的血樣中，或在某些食物產(chǎn)品中。

樣品體積可以從數(shù)升至納升。例如，在測試飲用水中污染物的存在時，樣品可以是數(shù)升水；可以處理樣品，以濃縮可能存在的任意靶物。相反，如果研究人員希望針對毒素或藥物對活小鼠的作用進行長期研究，且樣品是從小鼠得到的全血，則希望限制樣品體積。

2.靶物

靶物是在樣品中可能存在的細胞、病毒、分子(例如，大分子諸如蛋白、dna、rna或碳水化合物，和小分子，諸如化學(xué)治療藥、脂質(zhì)、糖、氨基酸、核苷酸)或分子絡(luò)合物，且其存在可以通過本發(fā)明來測試。使用本發(fā)明，可以檢測和/或定量許多不同類型的靶物。靈敏地檢測許多不同類型的靶物的能力，是本發(fā)明的優(yōu)點。

靶物的大小可以變化。諸如人卵細胞或巨核細胞等靶物的直徑可以是100微米或更大；循環(huán)的腫瘤細胞可以是幾微米；細菌的直徑可以是1微米；而蛋白或核酸靶物的大小可以是幾至數(shù)百納米。更小的靶物（諸如抗生素、毒素和殺蟲劑）的尺寸可以是10納米或更小。

靶物的豐度可以變化。例如，血樣中存在的細菌或病毒的濃度可以是從小于1個細胞或cfu或病毒/10ml至大于1x10⁶cfu或病毒顆粒/ml；類似地，諸如促甲狀腺激素、人絨毛膜促性腺激素或前列腺特異性的抗原等蛋白的濃度可以變動巨大。例如，血清中人絨毛膜促性腺激素的濃度可以變動超過4個數(shù)量級，從小于5至大于150,000miu/ml。

靶物可以是來自多細胞生物的細胞或細胞碎片。細胞靶物的實例可以包括細胞，諸如精子、花粉、真菌或植物孢子、和從血液或其它生物流體得到的細胞。例如，在血液中可以發(fā)現(xiàn)cd4+細胞和循環(huán)的腫瘤細胞；前者被用于hiv檢測，后者可以用于癌癥診斷。細胞碎片的實例包括血小板、人血液的正常組分、和亞細胞級分諸如細胞核、線粒體、溶酶體、或過氧化物酶，它們可以從樣品處理產(chǎn)生。

靶物可以是微生物或微生物的一部分，諸如細胞壁的片段，或2個或更多個微生物的聚集體。微生物可以包括病毒、細菌、細菌孢子、古細菌、真菌、原生生物或多細胞微生物諸如線蟲類、橈足類或輪蟲類。在許多樣品（如環(huán)境土壤樣品，或來自人類消化系統(tǒng)的樣品）中，微生物可能結(jié)合到微粒上，或可能作為混合菌群的一部分存在。

靶物可以是生物或人工聚合物，包括核酸、蛋白和肽、多糖和在不同類型的聚合物之間或在不同類型的聚合物和非聚合化合物之間的共價或非共價絡(luò)合物，諸如被輔基共價修飾的酶。靶物還可以包括已經(jīng)被破壞的生物聚合物，諸如已經(jīng)被紫外線輻射破壞的dna分子。聚合的靶物還可以包括合成的聚合物和生物聚合物的合成類似物，其已經(jīng)被修飾成包含合成的化合物，諸如合成的寡核苷酸，其可以包括在自然界中通常不存在的部分。肽和肽類似物（諸如逆-反肽（retro-reversopeptide））是可以作為靶物的另一類化合物。

靶物可以是天然的分子或合成的分子。天然化合物的實例包括維生素、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、脂類、氨基酸、糖類、次級代謝物、毒素和信息素。合成的分子的實例包括殺蟲劑、化學(xué)中間體、單體、成形劑、表面活性劑和其它工業(yè)產(chǎn)品。靶物還可以是藥物化合物，例如，藥物。

使用本發(fā)明可以檢測或定量蛋白。蛋白包括，例如，細胞因子、激素、酶、結(jié)構(gòu)蛋白、受體等。蛋白靶物還可以經(jīng)歷修飾，這種修飾的存在可能是令人感興趣的，諸如血液中糖基化的血紅蛋白的量，這是在糖尿病的診斷和治療中使用的標志物。蛋白可以與其它蛋白或其它分子（諸如核酸或低分子量分子諸如fad）一起存在于不同的絡(luò)合物中。

在酶的情況下，檢測酶(主要靶物)或酶的產(chǎn)物(次級靶物)可能是有用的。例如，通過提供內(nèi)酰胺抗生素諸如芐青霉素，并檢測芐基青霉噻唑酸，可以檢測內(nèi)酰胺酶。

3.樣品處理

根據(jù)待測樣品和試驗，可以以不同的方式將樣品呈遞給試驗。這些包括、但不限于：在運輸介質(zhì)中的拭子或從取樣部位得到的拭子；全血、血清或血漿的試管；使用刺指針后在指尖處呈現(xiàn)的全血滴，或在耳垂或其它表面（諸如前臂）上呈現(xiàn)的全血滴；存在于容器中的成形的或未成形的大便；諸如印跡到運輸介質(zhì)（諸如濾紙或膜）上的全血等樣品；在皮膚或其它體表上呈現(xiàn)的淚滴或汗滴。

根據(jù)樣品的性質(zhì)和實驗要求，樣品處理可能具有幾個功能，但是通常用于提高靶物用于測試的可用性。理想地，樣品處理需要用戶端的微量工作。樣品處理可以發(fā)生于不同時間和不同地點。樣品處理可以發(fā)生于樣品到達測試地之前，在收集地或運輸中的某點，或樣品處理可以作為測試過程的一部分而發(fā)生，或樣品處理可以發(fā)生于測試地，但不是作為測試過程的一部分。樣品處理可以發(fā)生于2個或更多個分散的階段或步驟，例如可以存在加工，以在收集地保存靶物，并在測試地進一步加工，以使靶物適用于試驗。

樣品處理可以作為樣品收集的一部分而發(fā)生。例如，如果血液收集管含有edta，可以在收集過程中防止血液凝固；用戶除了選擇正確的收集管以外，不需要做任何其它工作。

有些樣品處理操作包括從固體、半固體或液體基質(zhì)或從收集裝置提取靶物。例如，檢測骨樣品中的靶物的實驗可能包括下述步驟：機械破碎，并進行液體提取，以將靶物溶解到液相中，使得它們適用于試驗，并濃縮靶物，從而提高試驗的靈敏度。其它過程（包括過濾或離心樣品）可以用于從可溶性樣品去除微粒，以允許測試均勻的液體。這可能包括，加工血液以生成血漿或血清，或在測試艱難梭菌毒素之前從糞便樣品去除固體。樣品處理方法可以包括下述步驟：諸如純化，從諸如拭子或過濾器等取樣裝置洗脫，以批式或連續(xù)模式離心，電泳或滲析（diaphoresis），色譜法，用水性或有機稀釋劑或溶劑萃取或混合，使用聚合物或鹽的兩相分配，用于勻漿化或破碎的超聲處理，加壓，例如使用弗氏細胞壓碎器來破碎微生物。機械樣品處理包括用篩子篩分；機械破碎，諸如切、砍、壓制或壓榨和研磨。

其它加工操作包括稀釋或濃縮樣品或以其它方式調(diào)制樣品，以便測試。例如，檢測在大水樣品中存在的低濃度微生物的實驗可能包括過濾和濃縮步驟?？梢院喜⒒蚪M合樣品，以減少總數(shù)或需要的實驗。還可以使用樣品處理來提高實驗結(jié)果的質(zhì)量。在某些情況下，樣品可能不經(jīng)樣品處理就適用于測試，但是加工會提高結(jié)果的質(zhì)量。例如，不經(jīng)樣品處理就檢測血液或血漿中的蛋白靶物是可能的，但是通過諸如離心等步驟，可以提高試驗的靈敏度。因而，樣品處理的量和類型由下述因素決定：樣品的性質(zhì)，靶物的性質(zhì)，和用戶對速度、容易使用、節(jié)省成本、再現(xiàn)性、不受干擾、分辨率和靈敏度的要求。

樣品處理可以包括，加入不同的化學(xué)試劑。例如，通過加入酸或堿來調(diào)節(jié)樣品的ph，或通過加入nacl來調(diào)節(jié)鹽濃度，或加入試劑來造成靶物或其它物質(zhì)沉淀，可能是必要的?；瘜W(xué)試劑的加入可以造成幾個步驟同時發(fā)生，例如，聚合物的加入可以造成樣品形成兩相系統(tǒng)，其中靶物被富集在一個相中，而干擾物質(zhì)被富集在另一個相中。可以加入化學(xué)試劑來使樣品著色，例如，顏料的添加可以輔助用戶鑒別樣品?？梢约尤肴ノ蹌﹣韺崿F(xiàn)細胞的裂解(例如，可以加入皂苷來裂解哺乳動物細胞，而不裂解細菌細胞)，溶解組分，或改善樣品在諸如過濾等其它步驟過程中的潤濕或流動?；瘜W(xué)試劑可以在其它步驟之前加入，作為預(yù)處理，例如，在過濾之前，可以加入去污劑，以溶解樣品。

為了不同的原因，可以加入酶，作為樣品處理步驟的一部分。組織的解聚可能是必要的，以使細胞適用于測試。另外，眾所周知，某些酶（諸如溶菌酶或溶葡萄球菌酶）會降解細菌的細胞壁；這些酶的加入，可以用于將靶物從細菌細胞內(nèi)釋放出來。在樣品處理過程中可以加入核酸酶，例如，為了降低處理后生物樣品的粘度。也可以使用酶來將底物轉(zhuǎn)化成靶物。

可以使用樣品處理來保持靶物免于降解或修飾，例如，在收集時，可以將蛋白酶抑制劑加入樣品中，以確保蛋白靶物不被蛋白酶降解和變得不可檢測。還可以在任意時刻加入諸如proclin?或疊氮化鈉等防腐劑，以防止生物生長；例如，眾所周知，許多微生物會分泌蛋白酶和核酸酶，這些酶可能降解目標靶物。樣品處理可能包括加熱或冷卻樣品的步驟。例如，可以冷凍樣品，以抑制在樣品收集和測試之間的微生物的生長；可以使用冷凍來防止不穩(wěn)定靶物的降解。

當樣品含有微生物時，在允許生物生長或選擇性生長的條件下處理樣品，可能是有用的。例如，在測定血液中是否存在細菌的實驗中，獲知單個細菌是否存在于幾毫升體積的樣品中，可能是有用的。在該情況下，在細菌生長培養(yǎng)基中進行或不進行稀釋地溫育樣品，將允許細菌分裂和生長。在某些情況下，諸如檢測在可能含有其它微生物的樣品中的一種特定微生物，可能有用的是，處理樣品，使得僅目標生物存活，或使樣品處于揭示生物的特定生長性能的生長條件。例如，為了檢測甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌在血液中的存在，可能有用的是，混合樣品和含有抗生素的生長培養(yǎng)基，使得甲氧西林抗性的生物生長，而甲氧西林敏感的生物不生長。

可以組合樣品處理方法。例如，可能必要的是，離心或過濾器樣品，以去除微粒，然后去除干擾物質(zhì)，并通過色譜法濃縮和純化靶物?？梢允止さ鼗蛲ㄟ^自動化裝置完成加工步驟。

4.實驗裝置

本發(fā)明可以在許多結(jié)構(gòu)的實驗裝置中實現(xiàn)。為了實現(xiàn)本發(fā)明的步驟，所述裝置通常包含：允許樣品和其它組件彼此接觸的反應(yīng)孔，和包含檢測表面的成像孔，所述檢測表面允許由檢測器對單個標記的靶物絡(luò)合物成像。所述檢測表面允許來自檢測帶的信號向檢測器發(fā)射。所述成像孔也可以用作反應(yīng)孔?；蛘?，實驗裝置可能包含單獨的反應(yīng)孔和成像孔。或者，可以使用含有兩類孔的單獨裝置。可以手工地或自動地將實驗反應(yīng)從反應(yīng)孔移動到成像孔。

反應(yīng)孔和成像孔也可以執(zhí)行其它功能。例如，在成像孔的檢測表面中或附近，可以存在框標，以輔助聚焦，或允許在分析過程中對準圖像，或所述容器可以設(shè)計成容納生物危害的樣品。實驗裝置的孔可以生產(chǎn)成含有實驗組件，減少以后的試劑添加步驟。所述實驗裝置可以是一次用棄的(也就是說，使用一次就拋棄)，或可以清潔并再次使用。

基于實驗裝置的功能要求、成本和生產(chǎn)復(fù)雜性，選擇用于實驗裝置的材料和生產(chǎn)方法。例如，通常使用透明的低熒光塑料來構(gòu)建成像孔。通過使用商品塑料和高容積生產(chǎn)方法，可以使成本最小化。一類有用的容器是由低成本材料（諸如聚苯乙烯）制成，通過高容積方法形成，諸如注射模塑，其產(chǎn)生非常可再現(xiàn)的部件，每個部件具有低成本。

5.標記

為了檢測靶物在反應(yīng)中的存在，使靶物接觸并絡(luò)合信號發(fā)射部分。當對它們成像時，檢測帶內(nèi)的標記的靶物會產(chǎn)生可檢測的信號。

可用于靶物標記過程中的信號發(fā)射部分可以具有許多信號發(fā)射特征，包括熒光、光散射、拉曼散射、磷光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和顏色。

許多類型的信號發(fā)射部分可以與試驗一起使用，正如在下面的實施例中所證實的。這些包括、但不限于，單個熒光團，包括熒光染料如熒光素、羅丹明、cy?染料系列(gehealthcare)和alexa?系列(invitrogen)，它們可以被修飾，用于化學(xué)偶聯(lián)到蛋白或核酸上；熒光核酸染料如碘化丙啶或sybr?和syto?染色劑(invitrogen)，它們當與核酸絡(luò)合時會發(fā)熒光；與綠熒光蛋白或藻膽蛋白類似的熒光蛋白；和量子點。通過將多個熒光團摻入信號發(fā)射部分中，可以產(chǎn)生更高強度的信號。例如，熒光地標記的聚合物和熒光微?？梢詳y帶多個熒光團，并產(chǎn)生高-強度信號。當與適當?shù)孜镆黄饻赜龝r會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或發(fā)色信號的酶，在有它們的底物存在下，也可以構(gòu)成信號發(fā)射部分。一般而言，考慮待測樣品的性質(zhì)(例如固有的熒光)和檢測方法(例如基于ccd的成像，其通過特定的濾光片集合)，選擇信號發(fā)射部分。

在本發(fā)明的某些實施方案中，使用特異性的標記來選擇性地標記靶物。特異性的標記包括與一個或更多個上述信號發(fā)射部分綴合或穩(wěn)定結(jié)合的一類或更多類結(jié)合分子。種類結(jié)合分子的實例包括：抗體(如果靶物是抗原)；抗原(如果靶物是抗體)；凝集素(如果靶物含有適當?shù)奶遣糠?；與目標靶序列互補的核酸探針；受體(如果靶物是受體配體)；和配體(如果靶物是受體)。

基于在要連接的兩個部分上可利用的化學(xué)基團，選擇用于將種類結(jié)合分子共價連接到信號發(fā)射部分上的方法。諸如hemanson(gregt.hermanson的bioconjugatetechniques，和shans.wong的chemistryofproteinconjugationandcross-linking)等參考文獻，允許本領(lǐng)域技術(shù)人員使用許多綴合方法。在一種常用的方法中，在適合綴合分子的反應(yīng)條件下，將化學(xué)活化的信號發(fā)射部分(例如，用n-羥基琥珀酰亞胺修飾的熒光顆?；蛉玖戏肿?綴合到特定結(jié)合部分(例如，抗體)的游離氨基上。在另一種常見方法中，在合成探針時，將熒光地標記的核苷酸摻入寡核苷酸探針中。

通過信號發(fā)射部分和種類結(jié)合分子之間的非共價結(jié)合，可以形成某些信號發(fā)射部分絡(luò)合物。例如，在熒光聚苯乙烯微粒的情況下，通過將特異性的結(jié)合部分吸附到微粒表面上，可以生產(chǎn)穩(wěn)定地結(jié)合的標記的特異性的結(jié)合部分。

也可以使用共價連接和非共價穩(wěn)定結(jié)合的組合來生產(chǎn)信號發(fā)射部分絡(luò)合物。例如，可以將種類結(jié)合分子化學(xué)綴合到生物素上，且可以將信號發(fā)射部分化學(xué)綴合到抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白上。當接觸這些組分時，形成特異性的標記。這類特異性的標記可以形成在進行實驗之前，或可以將組分分別加入反應(yīng)中，從而在反應(yīng)過程中生成特異性的標記。

本發(fā)明的某些實施方案使用未與種類結(jié)合分子絡(luò)合的標記。這些非特異性的標記通常通過結(jié)合樣品中的分子的化學(xué)類別或功能類別或與其反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號。圖1解釋了特異性的和非特異性的標記之間的差異。一類非特異性的標記可以化學(xué)地修飾在樣品中普遍存在的化學(xué)基團，包括靶物。例如，n-羥基琥珀酰亞胺-活化的熒光染料可以偶聯(lián)在樣品中到處存在的游離胺，如果靶物存在于樣品中且含有游離胺，它會被熒光地標記?；蛘?，n-羥基琥珀酰亞胺-活化的生物素可以用于將生物素偶聯(lián)到在樣品中到處存在的游離胺上。在該情況下，通過加入與生物素或抗生蛋白鏈菌素絡(luò)合的信號發(fā)射部分，可以標記靶物和其它含有胺的樣品組分。核酸標記劑(實例包括碘化丙啶和syto和sybr染料系列，購自invitrogen)可以用于標記樣品中的所有可接近的核酸，包括含有核酸的靶物。非特異性標記的另一個實例是，當靶物是活細胞時，標記樣品中的所有有代謝活性的細胞。這可以如下實現(xiàn)：通過使用活細胞染料或代謝染色劑如醋酸熒光素，它們被活細胞代謝，生成信號發(fā)射部分。

6.選擇

本發(fā)明通常使用選擇來沉積檢測帶中的標記的靶物用于成像，并分離或區(qū)分結(jié)合的和游離的信號發(fā)射部分。

在本發(fā)明中可以采用許多選擇特征，每個特征與特定選擇部分集合有關(guān)。選擇特征包括、但不限于，磁性選擇、基于浮力密度的選擇、通過重力或離心、電泳、介電電泳、過濾、和簡單的捕獲到固相上。

選擇的選擇部分應(yīng)當與選擇特征的對應(yīng)選擇力相容。對于磁性選擇，相容的選擇部分包括超順磁顆粒、鐵磁流體和鐵蛋白。對于基于密度的選擇，相容的選擇部分的密度大于反應(yīng)物整體，包括諸如二氧化硅顆粒、三聚氰胺顆粒、聚苯乙烯顆?；蚱渌旅茴w粒等部分。當可以通過它的大小或通過它的結(jié)合特定類型的過濾器的能力來選擇標記的靶物時，可以使用過濾作為選擇模式。捕獲選擇模式包括，通過固定化在表面上的捕獲分子，特異性地或非特異性地捕獲標記的靶物絡(luò)合物。當結(jié)合劑被固定化在檢測帶處或附近時，捕獲選擇在本發(fā)明中是最有用的，使得標記的靶物絡(luò)合物的捕獲會固定化檢測帶內(nèi)的絡(luò)合物用于成像。

在本發(fā)明的許多實施方案中，例如在磁性選擇的情況下，通過選擇部分與標記的靶物結(jié)合，生成可選擇的絡(luò)合物，實現(xiàn)選擇過程。在其它情況下，標記的靶物的選擇特征允許在沒有預(yù)先形成可選擇的絡(luò)合物的情況下進行選擇。例如，特異性地標記的細菌的過濾，在選擇過程中使用靶物的尺寸來選擇所有細菌（包括標記的靶物）到過濾器上，其中成像會鑒別出標記的靶物。

選擇部分可以特異性地或非特異性地結(jié)合靶物。靶物特異性的選擇部分絡(luò)合物具有連接到一個或更多個種類特異性的結(jié)合部分上的選擇部分。抗-tsh抗體-綴合的磁性顆粒是靶物特異性的選擇部分絡(luò)合物的實例。種類特異性的選擇部分絡(luò)合物會結(jié)合靶物，但是不結(jié)合樣品中存在的其它組分。也可以生產(chǎn)非特異性的選擇部分絡(luò)合物，其結(jié)合樣品中的寬組分類別，包括靶物。非特異性的選擇部分絡(luò)合物的一個實例是綴合到聚陽離子上的磁性顆粒，所述聚陽離子會結(jié)合樣品中的所有聚陰離子組分，包括聚陰離子靶物。

生產(chǎn)靶物特異性的和非特異性的選擇部分絡(luò)合物。用于生產(chǎn)靶物特異性的和非特異性的選擇部分的方法，可以與上面關(guān)于生產(chǎn)標記部分的特異性標記所述的那些方法相同。將特異性的或非特異性的結(jié)合部分共價地或非共價地連接到選擇部分上，形成組分之間的穩(wěn)定結(jié)合。在某些情況下，選擇部分的結(jié)合特征是選擇部分所固有的。例如，如果需要聚陽離子選擇劑，其本身是聚陽離子的顆?？梢圆唤?jīng)進一步修飾地使用。

也可以使用共價連接和非共價穩(wěn)定結(jié)合的組合，生產(chǎn)靶物特異性的選擇部分。例如，可以將種類結(jié)合分子化學(xué)綴合到生物素上，且可以將選擇部分化學(xué)綴合到抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白上。這類靶物特異性的信號發(fā)射部分可以形成在進行實驗之前，或可以將組分分別加入反應(yīng)中，從而在反應(yīng)過程中生成靶物特異性的信號發(fā)射部分。

7.試驗形式

本發(fā)明可以檢測寬范圍的靶物。許多實施方案以“夾心”形式進行，其靶物被標記，以允許通過成像方法檢測到，且額外地與選擇部分絡(luò)合，以允許在檢測帶內(nèi)沉積標記的靶物，使它們可以被成像。標記和選擇方法的精確選擇取決于樣品的性質(zhì)、要使用的檢測方法、和靶物自身的性質(zhì)。

針對它們與特異性的結(jié)合部分的反應(yīng)，將靶物分成3類：小分子靶物、沒有重復(fù)決定簇的大分子靶物、和多價靶物。

小分子(半抗原)通常可以僅被單個特異性的結(jié)合部分結(jié)合。這不允許它們被連接到信號發(fā)射和選擇部分上的種類結(jié)合部分同時結(jié)合。在本發(fā)明中，小分子的檢測可以通過競爭形式來實現(xiàn)，其中靶物的加入會抑制在檢測帶內(nèi)的信號發(fā)射部分的捕獲。小分子的檢測存在3種基礎(chǔ)競爭形式的本發(fā)明實施方案。在一個競爭測定實施方案中，用于信號發(fā)射和用于選擇的種類結(jié)合分子彼此互補，其中一個種類結(jié)合分子是靶物競爭物，另一個是結(jié)合靶物或靶物競爭物的種類結(jié)合分子。在樣品中沒有靶物的情況下，信號發(fā)射部分和選擇部分直接彼此結(jié)合，所以當進行本發(fā)明的沉積步驟時，可測量的信號可以沉積在檢測帶中，并成像。如果靶分子存在于樣品中，會抑制信號發(fā)射和選擇部分之間的絡(luò)合物形成，所以沉積在檢測帶中的信號的量與加入反應(yīng)中的靶物的量成反函數(shù)。在第二個競爭測定實施方案中，信號發(fā)射部分和選擇部分都綴合到靶物競爭物上。通過在反應(yīng)中供給的至少二價的種類特異性的分子(例如抗體)，實現(xiàn)信號發(fā)射部分和捕獲部分的交聯(lián)。加入的靶物與二價的種類特異性的結(jié)合分子的結(jié)合，會抑制交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致當靶物存在于反應(yīng)中時，信號的量減少。在第三個競爭實施方案(c)中，信號發(fā)射和選擇部分各自綴合到種類-結(jié)合分子上，后者可以結(jié)合靶物。至少二價的靶物競爭物綴合物的加入會誘導(dǎo)選擇性的信號-選擇部分絡(luò)合物的形成。另外，靶物的加入會減少信號發(fā)射部分和選擇部分之間的交聯(lián)絡(luò)合物的形成。

大分子靶物通常大到足以接納獨立的種類特異性的結(jié)合部分(包括大多數(shù)沒有多個相同亞基的蛋白和沒有重復(fù)序列的核酸序列)的至少2個無重疊的結(jié)合位點。可以如下檢測沒有重復(fù)序列或決定簇的大分子靶物：通過使用結(jié)合靶物上的無重疊區(qū)域的結(jié)合分子（包括種類特異性的結(jié)合分子），允許信號發(fā)射部分和選擇部分都與靶物絡(luò)合，而不彼此干擾。具有氨基酸或核苷酸重復(fù)序列的大分子、具有至少2個相同亞基的多聚體蛋白、和具有特異性結(jié)合決定簇的多個拷貝的病毒或細胞，可以接納單個靶物上的超過一個種類特異性的結(jié)合劑的結(jié)合，允許、但不要求使用與信號發(fā)射部分和選擇部分二者綴合的單個種類特異性的結(jié)合部分。

8.接觸

接觸步驟允許形成與選擇部分絡(luò)合的標記的靶物。標記的靶物的形成和與選擇部分絡(luò)合的靶物的形成可以以任意次序先后發(fā)生，或可以同時發(fā)生。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可以加入額外組分來提高反應(yīng)的速率、再現(xiàn)性、穩(wěn)定性或質(zhì)量。這些額外組分可以包括：用于控制反應(yīng)的ph的緩沖液，以及稀釋劑、去污劑和其它添加劑，用于減少組分之間的非特異性結(jié)合、增加反應(yīng)中靶物的可用性、提高絡(luò)合物形成的效率、或用于其它目的。在諸如christopherprice&davidnewman,principlesandpracticeofimmunoassay等參考文獻中，討論了額外組分的選擇原理。

反應(yīng)的組分（包括靶物、標記、選擇部分和額外組分）可以以多種物理結(jié)構(gòu)和預(yù)裝配程度和以多種次序加入反應(yīng)中。如果希望先后反應(yīng)，可以溫育第一組組分(例如靶物、添加劑和標記的混合物)，然后加入(例如，選擇部分和任選的額外添加劑)。所有組分可以以液體形式加入，每種組分分別加入反應(yīng)孔中。或者，可以預(yù)混合液體組分，以實現(xiàn)更少的液體加入步驟。另外，一些或所有供應(yīng)的反應(yīng)組分(例如除了樣品以外的所有組分)可以在加入反應(yīng)之前凍干或干燥，且干燥可以對每種組分或組合混合物分別進行。干燥可以以多種形式進行，包括在反應(yīng)孔中以餅的形式干燥試劑，干燥散裝（inbulk）試劑并分配干粉，或凍干單位劑量試劑球并將球分配進反應(yīng)孔中。通過加入單獨的樣品，或加入樣品和稀釋劑，可以重配干燥的試劑。圖2解釋了向反應(yīng)中加入組分的一些實施方案。

樣品和試劑組分的加入可以由操作人員手工地實現(xiàn)，通過使用儀器或筒控制液體流動來自動化，或通過自動化和手工方法的組合來實現(xiàn)。試劑可以散裝地供給操作人員或自動化儀器，并在反應(yīng)時分配，或可以在一次性使用的反應(yīng)孔或筒內(nèi)預(yù)分配裝載（onboard）。

混合方法可以任選地施加于反應(yīng)，以使反應(yīng)均勻和/或增加反應(yīng)速率?；旌峡梢酝ㄟ^下述方法實現(xiàn)，包括：攪拌，在樣品中包含機械混合器(例如，螺旋槳)，或通過外部施加的超聲或壓電混合裝置。

提供溫育階段，以允許發(fā)生接觸反應(yīng)，優(yōu)選地至結(jié)束，或任選地達到足夠的反應(yīng)程度，使得最小量的靶物可以被檢測出，可檢測量的標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物可以沉積在檢測帶中并被檢測器成像。

進行本發(fā)明的接觸步驟后，反應(yīng)混合物含有眾多反應(yīng)產(chǎn)物，包括標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物、沒有結(jié)合選擇部分的標記的靶物、沒有結(jié)合標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物、以及未反應(yīng)的靶物、標記和選擇劑。這些反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物通常以均勻形式分散在混合物中。

9.沉積

本發(fā)明的一個實施方案包括，將標記的靶物沉積在檢測帶內(nèi)用于成像。作為一個替代方案，本發(fā)明的一個方法可以包括，檢測在檢測帶內(nèi)的靶物競爭物(所述靶物競爭物可以沉積或未沉積在檢測表面上)，作為靶物在樣品中存在的指標。使用的沉積模式隨采用的選擇部分的類型而變化。選擇模式的實例如圖3所示。

在直接捕獲的情況下，選擇部分由種類特異性的或非特異性結(jié)合部分組成，所述結(jié)合部分包被或綴合在檢測帶內(nèi)，例如，直接綴合在成像窗口的內(nèi)表面上，或綴合在連接物或間隔聚合物（其綴合到成像窗口上）上。在該情況下，在單個步驟中，使靶物接觸選擇部分，并進行絡(luò)合物的沉積。

在過濾是將標記的可過濾的絡(luò)合物沉積在檢測帶中的模式的情況下，標記的靶物或標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物的尺寸或其它性質(zhì)導(dǎo)致標記的靶物或標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物沉積在過濾器上，所述過濾器放在檢測帶內(nèi)。

其它沉積模式需要向選擇部分（包括與標記的靶物絡(luò)合的選擇部分的集合）施加力，造成它們沉積在檢測帶內(nèi)。在磁性選擇的情況下，通過施加磁力，將磁性響應(yīng)的選擇部分沉積在檢測帶內(nèi)。如果施加的力是基本上均勻的，且具有垂直于檢測表面的力向量，例如通過將成像孔放在具有適當結(jié)構(gòu)的永磁體陣列上面，標記的絡(luò)合物的沉積可以在檢測窗口中基本上是均勻的。標記的靶物在檢測區(qū)中的均勻沉積可以用于計算反應(yīng)物中的靶物，因為它們分開排列，允許計算標記的物體。當磁力在成像窗口平面中不均勻時，標記的絡(luò)合物可以在檢測帶內(nèi)沉積成圖案(圖3)。例如，使用比成像窗口尺寸更小的強磁體，可以導(dǎo)致磁性響應(yīng)的選擇部分（包括與標記的靶物絡(luò)合的那些）在成像窗口邊界內(nèi)沉積成點或堆。這種標記的靶物以非均勻圖案的沉積可以用于數(shù)據(jù)分析，因為在沉積帶內(nèi)檢測到的多個標記是標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物的組分。

密度分離。如果在試驗中使用的選擇部分的密度大于反應(yīng)液體，且如果檢測帶是在反應(yīng)孔底部，可以將重力用作沉積力。在該情況下，沉積可以如下實現(xiàn)：允許選擇部分（與它們結(jié)合的任意標記的靶物一起）沉降到檢測帶，它們可以在這里成像?；蛘?，可以將離心力施加于致密選擇部分，以加速它們向檢測帶的沉積?？梢允褂梅磻?yīng)孔的形狀來控制密度-介導(dǎo)的選擇過程中的沉積模式。在孔底部的平面成像區(qū)會導(dǎo)致致密選擇部分和它們結(jié)合的標記的靶物的均勻沉積，使得計算得到的圖像中的物體更容易?？梢栽O(shè)計非平面的表面，以導(dǎo)致絡(luò)合物沉積在反應(yīng)孔的最低點，允許在結(jié)合到選擇部分上的標記的靶物和在反應(yīng)混合物中的未結(jié)合的標記之間進行幾何區(qū)分(圖3)。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并非總是要求沉積，尤其是，如果在其中進行反應(yīng)的容器的尺寸允許反應(yīng)中的所有標記都落入檢測帶內(nèi)。在該情況下，使用其它方法來區(qū)分標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物和未結(jié)合的標記。

10.區(qū)分標記的靶物

本發(fā)明提供了改進的用于區(qū)分在檢測帶中沉積的信號發(fā)射部分（作為結(jié)合靶物的結(jié)果）和未結(jié)合選擇的靶物的標記的方法。當存在的標記超過靶物很多時（當本發(fā)明的試驗被設(shè)計成具有高靈敏度和短溫育時間時，需要如此），區(qū)分結(jié)合的標記和游離的標記是一個特殊問題。提高結(jié)合的和游離的標記之間的區(qū)分，會通過降低背景信號(不是由于標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物而在圖像中檢測到的信號)，提高本發(fā)明試驗的靈敏度和特異性。通過上述沉積步驟，在檢測帶中物理地濃縮絡(luò)合物；但是，在檢測帶內(nèi)的未結(jié)合的標記和在檢測帶外的未結(jié)合的標記都可以為圖像提供可檢測的光信號。

作為成像的光學(xué)篩選劑的染料。本發(fā)明區(qū)分結(jié)合的標記和游離的標記，無需使用洗滌步驟，從而增加了本發(fā)明的使用容易性。適當染料在本發(fā)明試驗中的整合，可以用作光學(xué)分離裝置，以增加在檢測帶中的標記與未在檢測帶中的標記的區(qū)分。當將光學(xué)檢測用于成像、且反應(yīng)介質(zhì)可基本上透過激發(fā)光或其它輻照光（像對產(chǎn)生成像信號的反射光或發(fā)射光一樣），可以理解，在檢測帶外的未結(jié)合的標記可以為圖像提供大非特異性光信號。這在圖9和11的左圖中予以解釋。在成像之前將染料包含進反應(yīng)中，可以用于減小由存在于檢測帶之外的未結(jié)合的標記產(chǎn)生的信號。在適當濃度的染料允許檢測在檢測表面處或附近的檢測帶中的熒光，同時掩蔽來自剩余溶液中的未結(jié)合的標記的信號發(fā)射貢獻。在信號發(fā)射部分是熒光的情況下，使用的染料可以具有與熒光信號發(fā)射部分的激發(fā)或發(fā)射波長重疊的光吸收，或可以吸收激發(fā)光和發(fā)射光。圖8顯示了一種這樣的染料鉻變素2r的吸收波譜，其與用于invitrogen黃綠fluospheres?的成像檢測的激發(fā)和發(fā)射濾光器的透射波譜重疊，所述fluospheres?在該實施例中用作信號發(fā)射部分。圖9表明，向孔中加入鉻變素2r染料會屏蔽檢測帶中由檢測帶以外的標記產(chǎn)生的信號。令人驚奇地，在該圖中可以看出，染料的加入仍然允許辨別檢測帶內(nèi)的熒光顆粒。

可以操作加入反應(yīng)中的染料的濃度，以控制檢測帶的深度。在優(yōu)選的染料濃度，可以辨別在檢測表面的大約50-100微米內(nèi)的信號發(fā)射部分，同時使距離檢測表面超過大約100微米的信號發(fā)射部分的貢獻最小化。由染料提供的光學(xué)屏蔽的有效性，與染料吸收光的能力以及穿過樣品的光所遇到的染料分子的數(shù)目(光程長度)有關(guān)。如果染料濃度太低，來自大多數(shù)重疊的未結(jié)合的信號發(fā)射部分的信號會被檢測到，而如果染料濃度太高，來自在成像表面附近的標記的靶物的信號會被減小。實際上，無論成像系統(tǒng)的場深度，在反應(yīng)中使用的染料的濃度可以用于在光學(xué)上定義檢測帶。

可以在反應(yīng)序列中的任意時間，將染料加入反應(yīng)中。有些實施方案可以摻入染料作為反應(yīng)的添加劑。在其它實施方案中，在完成接觸步驟后，加入染料。染料也可以是下述的墊子實施方案的組分。

本發(fā)明的染料可以是單一染料或染料混合物，用于吸收適當波長的光；適當染料的選擇隨使用的信號發(fā)射部分和要應(yīng)用的光學(xué)成像系統(tǒng)而變化。例如，對于具有515nm發(fā)射最大值的和505nm激發(fā)最大值的黃綠熒光fluospheres?，使用具有激發(fā)帶通濾光器475+/-29.5nm和發(fā)射濾光器535+/-25nm的成像系統(tǒng)，鉻變素2r或酸性紅1染料是用于產(chǎn)生光學(xué)屏蔽效應(yīng)的適當染料的2個實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠找到適用于該目的的其它染料。諸如floydgreen的thesigma-aldrichhandbookofstains,dyesandindicators(aldrichchemicalcompany,inc.1990)等參考文獻列出了許多可能用于本發(fā)明的染料。

可以預(yù)見到可用于信號發(fā)射的光學(xué)屏蔽的其它類型的染料。當通過它的顏色區(qū)分信號發(fā)射部分時，可以預(yù)期吸收與待測顏色互補的波長的光的染料作為本發(fā)明實施方案的光學(xué)屏蔽。光散射顆粒也可以用作顏色反應(yīng)的光學(xué)屏蔽的“染料”。黑色顆粒（包括黑印度墨汁）會吸收許多波長的光，且也可以提供光學(xué)屏蔽。

在使用含有鐵的磁性顆粒作為選擇部分的情況下，大量磁性顆粒在反應(yīng)中的使用可以在檢測帶中沉積不透光的顆粒層。經(jīng)過該層的光穿過被封閉，僅停留在磁性顆粒層和成像表面之間的信號發(fā)射部分被成像。

使用墊子來從檢測帶排除未結(jié)合的信號發(fā)射部分。除了由在檢測帶之外的未結(jié)合的信號發(fā)射部分發(fā)出的信號（這可以通過加入染料來解決）以外，也可以在檢測帶內(nèi)發(fā)現(xiàn)未結(jié)合的標記，其隨著它在反應(yīng)體積中的隨機分布而變化。該標記在光學(xué)上與在圖像中的特異性地沉積的信號發(fā)射部分不可區(qū)分，并減少檢測的靈敏度。

在本發(fā)明的方法中，通過從檢測帶排除反應(yīng)的未選擇的組分，可以使在檢測帶內(nèi)的未結(jié)合的信號最小化。這可以如下實現(xiàn)：在開始將選擇部分沉積在檢測帶中的過程之前，在主體反應(yīng)物和成像表面之間放置一個液體層，其密度高于主體反應(yīng)物，且至少象檢測帶一樣深。在反應(yīng)混合物和成像窗口之間的致密層或“墊子”的使用，可以以幾種方式整合進本發(fā)明的試驗中。優(yōu)選地，但不要求，主體反應(yīng)物不與成像表面直接接觸?？梢詫⒅旅軐踊颉皦|子”放入成像孔中，然后將反應(yīng)混合物鋪在它上面。這是一個優(yōu)選的方案，因為它會避免反應(yīng)混合物和檢測表面之間的接觸，使得信號發(fā)射部分僅通過沉積進入檢測帶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，將生成致密墊子所需的組分預(yù)分配在成像孔中，并干燥，從而在上面的接觸步驟中在反應(yīng)溫育期間，重配干燥的物質(zhì)，并形成致密的底層，其至少填充檢測帶體積。在一個次優(yōu)選的替代方案中，可以將致密墊子鋪在成像孔的主體反應(yīng)物下面，以占據(jù)檢測帶，然后開始選擇部分的沉積。

在每種情況下，選擇部分（與它們結(jié)合的任意標記的靶物一起）的沉積，造成選擇部分運輸?shù)街鞣磻?yīng)混合物之外，并進入停留在檢測帶內(nèi)的致密墊子層中。該過程會使在檢測帶內(nèi)發(fā)現(xiàn)的未結(jié)合的標記的量最小化，由此通過成像可檢測到。

許多致密材料可以用于構(gòu)成檢測帶內(nèi)的致密層。密度大于水且與水不混溶的液體是一個替代方案。含有高溶質(zhì)濃度（如濃度為7.5%w/v至35%w/v的蔗糖）的溶液、碘克沙醇（商品名optiprep?，濃度為10%或更高，更優(yōu)選15%或更高，最優(yōu)選15-30%）、泛影葡胺或percoll?可以用于生成致密底層。

可以溶解來生產(chǎn)高密度溶液的其它溶質(zhì)包括nacl、mgcl、ficoll、cscl、甲泛葡胺或白蛋白。優(yōu)選地，下面的溶液的密度充分不同于主體反應(yīng)物，使2個層之間的混合最小化，且反應(yīng)物中的微粒組分不會自發(fā)地穿過墊子沉淀。例如，下面的溶液(致密層或墊子)可以具有這樣的密度，它比覆蓋層大至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、12.0、15.0或20.0kg/l或更多。還優(yōu)選地，致密溶液的粘度較低，以避免阻礙標記的選擇部分絡(luò)合物在檢測帶內(nèi)的沉積。在圖8中解釋了致密層的維持疊加主體反應(yīng)物和成像表面之間的分離的能力，其中鋪在致密墊子層上面的全血不會沉降到成像孔底部。

當檢測器被構(gòu)造成僅檢測帶受到激發(fā)源輻照時，致密底層可以足以允許信號發(fā)射部分在檢測帶中的選擇性成像。這可以如下實現(xiàn)：提供其光束與檢測窗口平面平行的激發(fā)光，并通過檢測窗口檢測熒光信號。該方案使主體反應(yīng)物中的疊加信號部分的光學(xué)貢獻最小化。

染料墊子層。致密墊子層與加入的染料的組合會有效地減少由反應(yīng)物中未結(jié)合的信號發(fā)射部分產(chǎn)生的背景信號。墊子防止未結(jié)合的信號發(fā)射部分出現(xiàn)在檢測帶中，而染料防止檢測由疊加主體反應(yīng)物中的未結(jié)合的信號產(chǎn)生的信號，由此分離與沉積在檢測帶內(nèi)的選擇部分絡(luò)合的標記的靶物的信號發(fā)射貢獻。上述的墊子實施方案可以與本發(fā)明的染料相組合，用于本發(fā)明的染色的墊子實施方案。在圖11中解釋了向墊子試劑加入染料的一個直接的實例。在下面的實施例8-13和15-20中，解釋了染色的墊子的應(yīng)用實施例。它們證實了該形式在許多樣品類型（包括人全血、血清、血漿和尿，它們具有許多靶物，包括人促甲狀腺激素、炭疽芽孢桿菌的蛋白和多肽抗原）中的應(yīng)用，和在檢測金黃色葡萄球菌和甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)細胞中的應(yīng)用。在實施例中使用了3種不同的信號發(fā)射部分，包括0.5μm熒光顆粒、0.2μm熒光顆粒和sybr核酸染色。

占據(jù)的體積至少等于檢測帶體積的染色的致密層可以放入成像孔中，并將反應(yīng)混合物鋪在它上面，然后進行本發(fā)明的沉積步驟?；蛘撸诔上駧?nèi)形成染色的致密層所需的材料可以以下述方式干燥在成像孔中，所述方式使得在溫育混合物期間，反應(yīng)混合物重配染色的致密層，以允許形成標記的靶物-信號發(fā)射部分絡(luò)合物。盡管可能將染色的致密墊子層鋪在反應(yīng)混合物和成像表面之間，優(yōu)選地，反應(yīng)混合物的未結(jié)合的標記在反應(yīng)期間不直接接觸成像表面。

光漂白的檢測帶。不需要洗滌的本發(fā)明的另一個實施方案使用染料在反應(yīng)中的添加，其中通過暴露于熒光部分的激發(fā)波長的光，光漂白熒光信號發(fā)射部分。所述反應(yīng)可以在成像孔中進行。在接觸步驟過程中，或在反應(yīng)的接觸步驟以后，將染料摻入反應(yīng)物中。以光漂白存在于檢測帶中的信號發(fā)射部分、而不光漂白疊加信號發(fā)射部分的方式，將光施加于檢測帶。進行沉積步驟，將標記的靶物-選擇部分沉積在檢測帶中，在所述檢測帶中，已經(jīng)事先光漂白了其它熒光素。當對檢測帶成像時，檢測的信號來源于標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物，允許靈敏地檢測來自結(jié)合的標記級分的信號，而排除來自單個反應(yīng)混合物中的未結(jié)合的標記的信號，無需物理地操作反應(yīng)液體。

本發(fā)明的另一個實施方案可用于計算樣品中的微生物細胞。該實施方案使用光漂白來區(qū)分由靶細胞導(dǎo)致的標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物級分和由與反應(yīng)物中的可溶性靶物的反應(yīng)導(dǎo)致的級分。一個實例是這樣的反應(yīng)，其通過用對光漂白不敏感的熒光顆粒標記細菌細胞壁上的蛋白a，檢測金黃色葡萄球菌細胞。通過可與超順磁微粒上的蛋白a反應(yīng)的抗體，實現(xiàn)選擇。含有金黃色葡萄球菌的樣品也可以含有游離的蛋白a，其可以造成該形式的標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物的形成。如果希望知道在圖像中檢測到的哪個信號是由反應(yīng)物中的細胞產(chǎn)生、哪個是由可溶性的物質(zhì)產(chǎn)生，可以額外地用核酸染色劑來標記細胞，所述核酸染色劑可通過與信號發(fā)射顆粒相同的濾光片集合檢測到，但是對光漂白敏感。通過染色的墊子將標記的靶物-信號發(fā)射部分絡(luò)合物沉積到檢測帶中以后，對檢測帶成像，從而檢測標記的細胞和絡(luò)合的信號發(fā)射顆粒。然后對檢測帶施加足夠的光，以造成標記的細胞的光漂白，并獲取另一個圖像。第一個圖像和第二個圖像之間的差異，會確定由細胞形成的絡(luò)合物。

通過跟蹤移動來區(qū)分標記的靶物:選擇部分絡(luò)合物。在另一個實施方案中，結(jié)合的和游離的標記的分離可以使用下述事實來實現(xiàn)：結(jié)合的標記呈現(xiàn)（takeon）它結(jié)合的選擇部分的選擇性質(zhì)。例如，被靶物絡(luò)合到磁性顆粒上的熒光標記顆粒獲得磁場指導(dǎo)的運動性質(zhì)。如果將反應(yīng)構(gòu)造成可以對單個結(jié)合的和未結(jié)合的標記成像，則當在與成像表面基本上平行的方向用力向量施加磁場時，與磁性顆粒絡(luò)合的標記會在磁力方向移動，而未結(jié)合的標記隨機移動。如果使用長曝光進行成像，每個移動的標記可以在圖像上顯示為劃線或“彗星”。在實施例21中解釋了該實施方案?；蛘?，在磁場指導(dǎo)運動的時間段中，可以得到一系列圖像，并可以通過運動的視頻記錄來追蹤標記的運動。

該試驗實施方案的一個優(yōu)點是，它是非破壞性的，因此可以用于測定結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)。在靶物、標記和選擇部分之間的反應(yīng)的最初階段期間，觀察到小量的標記的靶物響應(yīng)于選擇力的施加而移動。隨著反應(yīng)進展，逐漸增多量的標記變得對選擇力有響應(yīng)。另外，可以改變力向量的方向，同時保持該力基本上平行于檢測表面的平面，從而證實在觀察下的信號發(fā)射部分的磁性響應(yīng)性。

使用致密顆粒作為選擇部分，也可以構(gòu)建該試驗實施方案。使用在反應(yīng)室中心的檢測窗口，可以構(gòu)建反應(yīng)孔。設(shè)計成可以對單個結(jié)合的和未結(jié)合的標記成像的室，當在垂直位置定向檢測窗口時，允許由重力導(dǎo)致致密顆粒沉降，由此流過垂直定向的檢測窗口。獲取圖像，以測定攜帶結(jié)合的標記的致密顆粒的分數(shù)，或平行于檢測窗口平面、在重力方向移動的結(jié)合的標記的頻率。這些圖像可以是具有長曝光的單個圖像形式，允許進行分析，以通過在圖像或視頻序列上的力向量的方向定向的劃線或“彗星”的生成，跟蹤信號發(fā)射部分的運動。可以象時漏一樣反轉(zhuǎn)筒，從而提供對變成重力響應(yīng)性的信號發(fā)射部分的數(shù)目進行系列觀察的可能性，和由致密顆粒的沉降導(dǎo)致的反應(yīng)的連續(xù)混合。

11.檢測

在本發(fā)明的方法中，使用數(shù)字成像，檢測沉積在檢測帶中的標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物。必須提供適用于檢測信號發(fā)射部分的數(shù)字成像儀。如果信號發(fā)射部分是熒光的或發(fā)磷光的，還提供適當?shù)募ぐl(fā)光來源和激發(fā)和發(fā)射濾光器。如果信號發(fā)射部分是化學(xué)發(fā)光的或生物發(fā)光的或產(chǎn)色的，致密墊子還含有適當?shù)牡孜锖洼o因子，用于生成信號。

用于本發(fā)明中的檢測器包括這樣的任意檢測器，當供給適當透鏡、濾光器和輻照源時，其可以產(chǎn)生存在于檢測帶中的標記的數(shù)字圖像。檢測器可以包括ccd照相機、cmos照相機、行掃描照相機、cmos雪崩光電二極管(apd’s)、光電二極管陣列、光電倍增管陣列或其它類型的數(shù)字成像檢測器。

使用檢測器來產(chǎn)生檢測帶的一個或更多個數(shù)字圖像。它們可以包括一個或一系列的單個圖像或一組連續(xù)圖像(例如視頻)。

成像可以在單個成像條件集合下實現(xiàn)，或成像條件可以在圖像之間變化。例如，多色熒光成像可以用于檢測多路試驗，其中分開的和光學(xué)上可區(qū)分的信號發(fā)射部分各自用于檢測不同的靶物。為了對多種熒光素成像，可以改變激發(fā)光的波長和發(fā)射光的濾光片集合，以對相同反應(yīng)孔中的一系列不同的信號發(fā)射部分成像。

在某些情況下，連續(xù)圖像可以用于區(qū)分碎片。在信號發(fā)射部分對光漂白敏感的情況下，可以獲取最初的圖像，其檢測由信號發(fā)射部分產(chǎn)生的信號，但是其也含有通過固有的熒光或光散射可檢測到的碎片。提供足夠的激發(fā)光來光漂白信號發(fā)射部分以后，可以得到第二個圖像。第二個圖像中的熒光信號由碎片產(chǎn)生，且可以從特異性的靶物捕獲的分析中消除。實施例23提供了進行碎片檢測的該方案的一個例證。

12.分析

數(shù)字成像的使用可以擴展本發(fā)明的試驗的動態(tài)范圍。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在成像時，沉積在檢測帶中的每個捕獲的靶物可以導(dǎo)致數(shù)字圖像中可檢測的對象的產(chǎn)生。當在圖像中存在要檢測的單獨的明亮的物體的足夠少的對象時，可以將單個對象鑒別為圖像中的團跡，并計算。該方案允許準確地計數(shù)小量信號部分，甚至當檢測到的總信號僅占圖像的總像素的小比例時。如果在圖像中整合圖像中的每個像素的總信號，特定信號會因取它與數(shù)目多很多的具有背景范圍內(nèi)的強度的像素的噪音的平均值而丟失。隨著檢測到的對象的數(shù)目的增加，來自這些對象的信號開始合并，簡單的對象計數(shù)變得不準確。在該情況下，可以整合信號的總強度，從而允許準確定量和使用成像裝置的整個動態(tài)范圍。

標準曲線可以用于將從含有未知量的靶物的樣品的數(shù)字圖像分析衍生出的信號與用已知水平的靶物產(chǎn)生的信號相關(guān)聯(lián)。在非競爭測定實施方案的情況下，特定信號隨著樣品中存在的靶物的數(shù)目而增加。在競爭測定的情況下，信號隨著樣品中存在的靶物的量的增加而降低。

通過包含平行的內(nèi)部對照來檢測樣品干擾。眾所周知，某些樣品可能干擾靶物的檢測，甚至在最佳分析條件下。該干擾可以是陽性的，造成在沒有靶物存在下的高信號，或是陰性的，造成試驗不能檢測出陽性樣品。在實際的樣品基質(zhì)中加入與實驗樣品平行運行的內(nèi)部對照，可以區(qū)分真實的和假的實驗結(jié)果。在圖26中圖解了該對照方案的表示。當將對照加入實驗樣品中時，預(yù)見到陽性對照(例如，向?qū)嶒灅悠分屑尤腩A(yù)定量的靶物)會增加可確定的增加信號。如果陽性對照未被檢測出，樣品可以視作具有陰性干擾，并適當?shù)亟忉尅ｎ愃频?，用于抑制由樣品中的靶物產(chǎn)生的信號(例如，通過加入大量種類特異性的結(jié)合部分，其用于將標記結(jié)合到靶物上)的陰性對照，會導(dǎo)致由陽性樣品產(chǎn)生的信號的減小。在陰性對照孔中沒有表現(xiàn)出減小的信號的陽性樣品要么是假陽性，要么是非常高的真陽性。通過樣品的稀釋，可以區(qū)分這些替代方案?；蛘?，陰性對照可以含有不與靶物反應(yīng)的無關(guān)物(信號發(fā)射部分-特異性的捕獲部分絡(luò)合物)。實施例16解釋了使用平行的內(nèi)部陽性和陰性對照進行的試驗。

13.組合裝置

本發(fā)明的反應(yīng)可以以多種方式呈現(xiàn)給用戶。一般而言，根據(jù)本發(fā)明檢測靶物所需的每種組分都要提供給用戶，所述用戶供給待測樣品，用于檢測靶物的存在。這些組分包括:

接觸反應(yīng)的組分:

●反應(yīng)孔，其與成像孔分離或組合

●與結(jié)合部分綴合的信號發(fā)射部分，根據(jù)靶物檢測的需要

●與結(jié)合部分綴合的選擇部分，根據(jù)靶物檢測的需要

●反應(yīng)的最佳性能所需的添加劑

●染料、墊子和/或染色的墊子，用于光學(xué)地和/或物理地分離主體反應(yīng)物與檢測帶

在一個實施方案集合中，將反應(yīng)組分與反應(yīng)孔中的樣品相組合。在所有反應(yīng)物都已經(jīng)與樣品混合后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至成像孔，然后將選擇部分沉積進檢測帶中，并成像?？梢詫⒚糠N液體組分作為單個添加物加入到反應(yīng)孔中。在實施例13的高處理量沖擊波試驗儀器中，體現(xiàn)了該裝配方法?；蛘?，可以組合液體，并作為一個或兩個添加物加入到反應(yīng)中，從而減少實現(xiàn)本發(fā)明所需的分配步驟的數(shù)目。染料、墊子或染色的墊子可以作為液體分配進成像孔中，將反應(yīng)混合物疊加在墊子上面，如在實施例13中所例證的，或可以在成像孔中干燥，并通過加入反應(yīng)混合物進行再水合?；蛘撸梢詫⒎磻?yīng)組分以干燥的或低壓凍干的形式預(yù)分配到反應(yīng)孔中，通過加入樣品或稀釋劑+樣品進行再水合，然后轉(zhuǎn)移至成像孔中的染料、墊子或染色的墊子。干燥可以以多種形式進行，包括在反應(yīng)孔中以餅的形式干燥試劑，干燥散裝（inbulk）試劑并分配干粉，或凍干單位劑量試劑球并將球分配進反應(yīng)孔中。

當包括染色的墊子在內(nèi)的所有組分都在單個反應(yīng)/成像孔中預(yù)分配和干燥時，會極大地簡化本發(fā)明的實踐。染色的墊子可以干燥在檢測表面附近，使它在反應(yīng)過程中再水合，并保護成像表面免于反應(yīng)物?？梢砸韵率鲂问教峁└稍锏姆磻?yīng)組分：其在加入樣品、稀釋劑或樣品+稀釋劑后立即再水合，并在再水合的染料墊子上面形成單獨的層。反應(yīng)組分可以以餅的形式直接鋪在干燥的墊子上面，如在實施例20中所例證的，或可以分別干燥成單元劑量試劑球(實施例19)或作為塊試劑，分配在反應(yīng)孔中，在干燥的染色的墊子上面。在該實施方案中，單個液體加入足以實現(xiàn)本發(fā)明的所有步驟，不需要將試劑從一個容器轉(zhuǎn)移到另一個容器。該形式適合手工地、通過自動化儀器、或通過在自含筒內(nèi)的流體轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)。

樣品和試劑組分的加入可以由操作人員手工地實現(xiàn)，通過使用儀器或筒控制液體流動來自動化，或通過自動化和手工方法的組合來實現(xiàn)。試劑可以散裝地供給操作人員或自動化儀器，并在反應(yīng)時分配，或可以在一次性使用的反應(yīng)孔或筒內(nèi)預(yù)分配裝載（onboard）。

實施例

關(guān)于下述非限制性實施方案，進一步描述了本發(fā)明。除非另外指出，在實施例中特別描述的方法的任意要素通?？梢砸话愕赜糜诒景l(fā)明的方法中。關(guān)于用于實現(xiàn)所述方法的成像分析儀、軟件和裝置的其它細節(jié)，也描述在2009年9月24日提交的標題為“imaginganalyzerfortestinganalytes”的國際申請?zhí)朹_________中，和2009年9月24日提交的標題為“kitsanddevicesfordetectinganalytes”的國際申請?zhí)朹_________中，它們二者通過引用并入本文。

實施例1.用發(fā)熒光的dna染色劑標記金黃色葡萄球菌

本實施例描述了使用發(fā)熒光的dna染色劑標記金黃色葡萄球菌細菌細胞，它證實了標記細菌靶物進行成像檢測的方法。標記細菌靶物在許多分析情況中是重要的，如應(yīng)用于臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的分析。用發(fā)熒光的染料標記細菌，在本發(fā)明的背景下具有普遍用途，因為可以產(chǎn)生的巨大信號允許使用未放大的成像來容易地計算細菌。

方法。如下用syto-13?標記金黃色葡萄球菌。在35℃在胰蛋白酶處理過的大豆湯(acumedia,目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期。在zeiss顯微鏡上的計數(shù)室中，計數(shù)細胞數(shù)目，并在pbs-tbp溶液(10mm磷酸鹽，140mm氯化鈉，3mm氯化鉀(calbiochem，目錄號524650)，0.05%w/v吐溫20(acros，目錄號2333600010)，2mg/ml牛血清白蛋白(sigma-aldrich，目錄號a3059)和0.05%v/vproclin^tm300(supelco目錄號48912-u)（調(diào)至ph7.4）中稀釋至1.67x10⁸細胞/ml。用鹽水溶液(0.9%w/v氯化鈉，jtbaker，目錄號3629-07)將syto-13?(invitrogen/molecularprobes，目錄號s7575)1：20稀釋。標記反應(yīng)混合物含有6μl稀釋的金黃色葡萄球菌細胞溶液、10μl稀釋的syto-13?溶液和984μlpbs-tbp。將反應(yīng)混合物溫育2min。然后在parteccyflow流式細胞計上分析樣品，所述流式細胞計設(shè)定為，在520nm的發(fā)射波長的綠熒光觸發(fā)，增益設(shè)定在300。

結(jié)果。圖4顯示了未被syto-13?標記的金黃色葡萄球菌細胞(左圖)相對于被syto-13?標記的細胞(右圖)的對數(shù)熒光強度?？梢钥闯觯瑯擞浀募毎?20nm的熒光容易地檢測出。

結(jié)論。實施例1的結(jié)果證實，細菌細胞靶物可以被高強度地?zé)晒獾貥擞洝?/p>

替代實施方案。以后的實施例將證實，用核酸染色劑（如syto-13?）標記的細菌可通過未放大的成像技術(shù)檢測出。其它核酸染色劑可以以類似的方式用于熒光地標記細菌細胞，具有在許多波長的熒光激發(fā)和發(fā)射；這些染色劑包括syto?染色劑家族(invitrogen)的其它成員、和sybr?核酸染色劑家族的成員、碘化丙啶或碘化己啶（hexidiumiodide）。這類染色方法會標記樣品中所有含有核酸的細胞。從下面的實施例可以看出，通過組合基于核酸的細胞標記法和種類特異性選擇方法，可以增強試驗對特定種類的靶物的特異性。這允許，例如，從標記的細胞的混合物中檢測一個特定種類的細胞，產(chǎn)生靶物特異性的試驗，例如檢測來自傷口的混合細菌培養(yǎng)物中的金黃色葡萄球菌。在下面描述了許多選擇方法，作為實施例4中的替代實施方案(例如，可以用syto-13?標記金黃色葡萄球菌，并通過染料-墊子試劑，用與抗金黃色葡萄球菌抗體綴合的磁性顆粒進行選擇，參見下面的實施例18)。通過該方案可以標記其它類型的化學(xué)類別，并通過特異性選擇進行檢測，然后成像；一個實施例是用尼羅紅標記在人血清脂蛋白中的脂類，然后用與抗-人載脂蛋白b抗體綴合的磁性顆粒特異性地選擇低-密度脂蛋白。這允許測定樣品中的低密度脂蛋白絡(luò)合物的脂質(zhì)含量?？梢匀菀椎仡A(yù)見到許多類似的實施方案。

可以使用具有不同的信號特征(例如熒光、化學(xué)發(fā)光、光吸收、光散射、磷光、酶反應(yīng)性和拉曼散射)的標記。也可以使用不同的信號發(fā)射部分(具有不同的信號發(fā)射特征)例如，二醋酸熒光素(熒光酯酶底物)、sybr?綠?(熒光dna染色劑)、蘇丹黑(脂質(zhì)染色)、產(chǎn)生不溶產(chǎn)物的酶底物、聚苯乙烯顆粒、含有熒光染料的聚苯乙烯顆粒、膠體金等。

所述方法可以用于靶物的標記法中，所述靶物可以包括、但不限于：細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

還可以在標記之前加工樣品，例如可以用甲醇固定細胞?？梢蕴崛『图兓痙na。

實施例2.與雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體綴合的熒光顆粒的生產(chǎn)

本實施例描述了與雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體綴合的熒光顆粒的生產(chǎn)。這些顆粒用作金黃色葡萄球菌的特異性標記，因為它們包含與種類結(jié)合部分絡(luò)合的信號發(fā)射部分，因此特異性地結(jié)合靶物。靶物特異性的熒光顆粒在本發(fā)明的背景下具有普遍用途，因為這些顆粒發(fā)射巨大信號，并可以使用未放大的成像來容易地計算。

所述顆?？梢杂糜跈z測和計算許多樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物的方法中，所述樣品包括臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品。所述方法也可以用于提高復(fù)雜基質(zhì)中的信號穩(wěn)定性(例如熒光顆粒的應(yīng)用可以減少樣品中非靶物組分的猝滅)。

方法。洗滌具有200nm直徑的羧基化的黃綠熒光顆粒(fluospheres)(invitrogen,目錄號8811)，并重新懸浮于調(diào)節(jié)至ph5.5的1%w/v的50mm2-嗎啉代乙磺酸(aldrich,目錄號69889)中。然后如下活化微粒：先后加入磺基-n-羥基琥珀酰亞胺(thermopierce,目錄號24510)和1-乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺(thermopierce,目錄號22980)，各自在2mg/ml的終濃度，并溫育30分鐘。洗滌顆粒，并緩慢地加入雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體(meridianoem,目錄號c5b01-296)，至2.0mg/ml的終濃度；將該混合物在攪拌下在室溫溫育16小時。然后將該混合物與50mg/ml牛血清白蛋白溶液(sigma-aldrich,目錄號a3059)1:1混合，并溫育2小時。溫育后，加入調(diào)節(jié)至ph8.0的1m乙醇胺溶液(sigma-aldrich,目錄號e9508)，使得乙醇胺的終濃度是100mm，并將該混合物溫育1小時。然后洗滌抗體衍生化的熒光微粒，并重新懸浮于20mmtris溶液（(jtbaker目錄號4109-02)，0.05%w/v吐溫20(acros目錄號2333600010)，2mg/ml牛血清白蛋白(sigma-aldrich，目錄號a3059)，0.05%w/vproclin300(supelco，目錄號48912-u)，調(diào)節(jié)至ph7.8）并簡單地聲處理，以確保顆粒是單體，這通過parteccyflow流式細胞計來確認。

替代實施方案。存在多種用于生產(chǎn)信號發(fā)射部分絡(luò)合物的方法。通過非共價或共價化學(xué)連接，可以被動地吸附或連接種類結(jié)合部分(例如抗體可以被動地吸附到聚苯乙烯顆粒上，通過非共價的生物素-抗生蛋白鏈菌素連接進行連接，或經(jīng)由碳二亞胺化學(xué)方法通過蛋白氨基基團和羧化的顆粒上的顆粒羧化物基團之間的共價鍵進行連接)。許多有用的綴合方法是已知的(bioconjugatetechniqueshermanson1996academicpress)。

可以使用不同的種類標記部分，包括、但不限于：抗體(包括不同的免疫球蛋白類型)和其它蛋白(例如凝集素、激素受體等)、寡核苷酸和它們的合成類似物(例如肽核酸、適體等)、寡糖(例如肝素等)、有機聚合物(例如硫酸葡聚糖等)和小分子(例如藥物、非肽激素、生物素、染料等)。

可以生產(chǎn)具有許多特異性的特異性標記。通過選擇綴合到顆粒表面上的種類結(jié)合分子，控制使用熒光顆粒作為信號發(fā)射部分的試驗的特異性。例如，抗-tsh抗體的應(yīng)用會產(chǎn)生這樣的熒光顆粒，它會標記tsh，并允許通過成像檢測它。

所述的方法可以用于靶物的標記法中，所述靶物可以包括、但不限于：細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

通過組合靶物的標記法和靶物特異性的選擇方法，可以增強試驗對靶物的特異性(如在實施例1中所討論的，和在實施例6、9-19、21-24中所描述的)。

可以使用不同的信號特征，例如熒光、化學(xué)發(fā)光、光吸收、光散射、磷光、酶反應(yīng)性和拉曼散射。

不同的信號標志的顆?？梢跃Y合到不同的種類特異性的結(jié)合分子上，以允許在單個反應(yīng)中同時檢測多個靶物。也可以使用不同的信號發(fā)射部分(具有不同的信號發(fā)射特征)例如，二醋酸熒光素(熒光酯酶底物)、sybr?綠(熒光dna染色劑)、蘇丹黑(脂質(zhì)染色)、產(chǎn)生不溶產(chǎn)物的酶底物、聚苯乙烯顆粒、含有熒光染料的聚苯乙烯顆粒、膠體金等。

實施例3.使用特異性地結(jié)合細胞表面上的蛋白a的熒光納米顆粒來標記金黃色葡萄球菌細胞

本實施例描述了使用靶物特異性的熒光顆粒來標記金黃色葡萄球菌細菌細胞的方法。靶物特異性的熒光顆粒的使用在本發(fā)明的背景下具有普遍用途，因為這些顆粒發(fā)射巨大信號，并可以使用未放大的成像來容易地計算。所述方法因而可以用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

本實施例證實了使用流式細胞術(shù)，可以用靶物特異性的熒光顆粒標記金黃色葡萄球菌。

方法。使用如實施例2所述生產(chǎn)的抗-蛋白a抗體包被的熒光顆粒來標記金黃色葡萄球菌細胞。在35℃在胰蛋白酶處理過的大豆湯(acumedia,目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。在zeiss顯微鏡上的血球計數(shù)器中，計數(shù)金黃色葡萄球菌細胞，并在pbs-tbp溶液中將細胞稀釋至1x10⁷細胞/ml。通過與1.5μl4.67mm碘化己啶一起在室溫溫育1ml稀釋的細胞10分鐘，用碘化己啶(molecularprobes,l-7005)對這些細胞染色。

構(gòu)建了一系列金黃色葡萄球菌標記反應(yīng)混合物，輸入抗體包被的熒光顆粒的數(shù)目在所述系列中變動。每個50μl混合物含有30μlpbs-tbp、10μl碘化己啶染色的金黃色葡萄球菌細胞(1x10⁷細胞/ml)和10μl來自實施例2的抗體-包被的熒光顆粒（濃度為0.5x10¹⁰至5x10¹⁰顆粒/ml）。在室溫溫育反應(yīng)物30min。溫育后，將反應(yīng)混合物稀釋至1mlpbs-tbp，并溫育另外2min。然后在parteccyflow流式細胞計上分析樣品，所述流式細胞計設(shè)定為，在590nm的發(fā)射波長的紅熒光觸發(fā)，增益設(shè)定在395。從單個顆粒的熒光的測量值，計算每個碘化己啶標記的細胞捕獲的熒光顆粒的數(shù)目。

結(jié)果。圖5顯示了使用1x10¹⁰抗體包被的熒光顆粒/ml來標記金黃色葡萄球菌細胞的結(jié)果。圖a顯示了僅具有金黃色葡萄球菌細胞的反應(yīng)的直方圖，圖b顯示了僅具有熒光顆粒的反應(yīng)的直方圖，圖c顯示了含有金黃色葡萄球菌細胞和熒光顆粒的反應(yīng)的直方圖。從數(shù)據(jù)顯而易見，當反應(yīng)混合物含有細胞和熒光顆粒時，僅觀察到在520nm的熒光信號(圖c)。單獨的細胞或單獨的熒光顆粒沒有產(chǎn)生超過背景的任何信號(圖a和b)。圖6顯示了熒光細胞標記對標記所使用的熒光顆粒的濃度的依賴性，通過每個細胞結(jié)合的顆粒的平均數(shù)目來指示。加入2x10¹⁰細胞/ml熒光顆粒時，標記幾乎被飽和。在使用的所有顆粒濃度，多個顆粒結(jié)合到每個金黃色葡萄球菌細胞上。

結(jié)論。該數(shù)據(jù)證實了抗體-包被的熒光顆粒用于特異性地標記細胞(例如金黃色葡萄球菌)的應(yīng)用。如在以后的實施例中所證實的，這里使用的標記方法在本發(fā)明的背景下可以與用于將標記的靶物和游離的信號發(fā)射部分和其它標記的實體區(qū)分開的方法相組合。結(jié)果顯示出巨大的標記，其可以使用所述方法得到，每個金黃色葡萄球菌細胞具有多達18個熒光顆粒。

替代實施方案。其它類型的可檢測的特異性標記可以用于本實施例中，包括不同直徑的熒光顆?；虿煌盘柊l(fā)射標志的熒光顆粒。其它信號發(fā)射部分可以用于生產(chǎn)特異性標記；例如，alexa?490熒光地標記的抗體可以用于金黃色葡萄球菌檢測。

可以使用不同的信號特征(例如熒光、化學(xué)發(fā)光、光吸收、光散射、磷光、酶反應(yīng)性和拉曼散射)的標記。

所述的方法可以用于靶物的檢測中，所述靶物可以包括、但不限于：細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂蛋白、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

與特異性選擇部分的應(yīng)用相組合的該標記方法可以用于金黃色葡萄球菌細胞的基于成像的檢測。

還可以在標記之前加工樣品，例如可以用甲醇固定細胞?？梢蕴崛『图兓痙na。

實施例4.用抗-蛋白a抗體綴合的磁性顆粒的生產(chǎn)

實施例4描述了用抗體綴合的磁性顆粒的生產(chǎn)，所述抗體針對金黃色葡萄球菌的蛋白a，所述蛋白a用作檢測金黃色葡萄球菌細胞的特異性選擇劑。本實施例描述了結(jié)合靶物的特異性選擇部分的生產(chǎn)和功能測試。

特異性選擇部分可以與標記組合使用，用于生產(chǎn)標記的靶物-選擇部分絡(luò)合物。當沉積在檢測帶中時，通過基于成像的檢測方法可以檢測這些絡(luò)合物。

所述方法可以用于從復(fù)雜樣品(例如生物流體如血液，和尿，或奶，廢水，工業(yè)產(chǎn)物等)中選擇和濃縮出靶物。

方法。下面描述了用于生產(chǎn)用雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體綴合的磁性顆粒的方法和它們的功能性測試。洗滌292nm直徑的羧基化的磁性顆粒(ademtech,目錄號0213)，并重新懸浮，以得到調(diào)節(jié)至ph5.5的在50mm2-嗎啉代乙磺酸(aldrich,目錄號69889)中的1%w/v懸浮液。然后如下活化微粒：先后加入磺基-n-羥基琥珀酰亞胺(thermopierce,目錄號24510)和1-乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺(thermopierce,目錄號22980)，各自在2mg/ml的終濃度，并溫育30分鐘。然后洗滌顆粒，并緩慢地加入雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體(meridianoem,目錄號c5b01-296)，達到0.5mg/ml的終濃度。將該混合物在攪拌下在室溫溫育16小時。溫育后，將該反應(yīng)混合物與等體積的50mg/ml牛血清白蛋白溶液(sigma-aldrich,目錄號a3059)混合，并進一步溫育2小時。溫育后，加入調(diào)節(jié)至ph8.0的1m乙醇胺溶液(sigma-aldrich,目錄號e9508)，使得乙醇胺的終濃度是100mm，并溫育1小時。然后洗滌抗體綴合的磁體微粒，并重新懸浮于pbs-tbp溶液中，并簡單地聲處理，以確保顆粒是單體。生產(chǎn)后，如下在生物試驗中使用金黃色葡萄球菌，測試抗體-包被的磁性顆粒的捕獲效率。在35℃在胰蛋白酶處理過的大豆湯(acumedia,目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期。在zeiss顯微鏡上的血球計數(shù)器中，計數(shù)細胞數(shù)目，并在pbs溶液(10mm磷酸鹽，140mm氯化鈉，3mm氯化鉀(calbiochem目錄號524650)，調(diào)至ph7.4)中稀釋至1.57x10⁵細胞/ml。在pbs中稀釋雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體磁性顆粒至0.625x10⁹至5x10⁹顆粒/ml的系列濃度。對于每個50μl反應(yīng)，混合10μl稀釋的金黃色葡萄球菌細胞(10,000細胞)、10μl磁性顆粒和30μlpbs，并溫育15min。溫育后，將20μl每種反應(yīng)混合物覆蓋于在96-孔半面積直徑清澈平板(greiner,目錄號675001)的孔中的70μl墊子溶液(由30%optiprep?組成，sigma目錄號d1556)的上面。使用磁棒儀器，磁性地選擇磁性顆粒和與它們結(jié)合的細胞4min。磁性選擇后，小心地取出含有未選擇的細胞的頂層，然后用pbs重配含有磁性地選擇的細胞的溶液部分(底層)。然后將兩種溶液的等分試樣涂布在胰蛋白酶處理過的大豆湯瓊脂平板上，并在32.5℃溫育過夜。次日，用眼睛計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)目，并使用下式，計算磁性地捕獲的金黃色葡萄球菌細胞(cfu)：磁性地捕獲的cfu的百分比=[磁性地捕獲的菌落數(shù)目/(磁性地捕獲的菌落數(shù)目+非磁性地捕獲的菌落數(shù)目)]x100。

結(jié)果。圖7顯示了金黃色葡萄球菌cfu的磁性捕獲與加入試驗中的磁性顆粒數(shù)目的關(guān)系。這些結(jié)果證實，使用抗-蛋白a抗體包被的磁性珠子，可以特異性地捕獲金黃色葡萄球菌細胞。

結(jié)論。結(jié)果證實了雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a抗體綴合的磁性顆粒用于選擇金黃色葡萄球菌細胞的應(yīng)用，其中使用獨立于細胞的標記的選擇過程的檢測方法。本實施例教導(dǎo)了用于生產(chǎn)本發(fā)明的選擇部分的方法?？梢匀菀椎仡A(yù)見到其它選擇部分和它們的生產(chǎn)。

替代實施方案。當與標記金黃色葡萄球菌靶細胞的適當方法組合時，該選擇方法可以用于通過基于成像的檢測方法，檢測樣品中金黃色葡萄球菌的存在?？梢允褂闷渌x擇模式，包括：密度(通過重力或離心的選擇)、過濾、捕獲在成像孔表面上、和電荷(電泳)。如果使用其它選擇模式，會將不同的選擇部分綴合到抗-蛋白a抗體上。在有些實施方案中，可以不使用儀器地進行選擇(例如重力選擇)。

可以將其它類型的選擇部分用于磁性選擇，包括不同直徑和組成的順磁顆粒(例如金屬，包括鐵、鎳、鈷等，鐵磁流體)。

可以使用不同的生產(chǎn)方法來將種類結(jié)合部分連接到選擇部分上(如在例如實施例2的替代實施方案中關(guān)于信號發(fā)射部分所述)。

可以使用不同的種類標記部分，包括、但不限于：抗體(包括不同的免疫球蛋白類型)和其它蛋白(例如凝集素、激素受體等)、寡核苷酸和它們的合成的類似物(例如肽核酸、適體等)、寡糖(例如肝素等)、有機聚合物(例如硫酸葡聚糖等)和小分子(例如藥物、非肽激素、生物素、染料等)。

通過在種類內(nèi)選擇特定靶物(例如從血液中選擇人促甲狀腺激素，或從鼻樣品選擇金黃色葡萄球菌細胞)，選擇可以是特異性的。通過選擇標記的靶物種類(例如從人血漿選擇脂蛋白)，試驗也可以是特異性的。

所述的方法可以用于許多靶物的選擇中，所述靶物可以包括、但不限于：細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

實施例5.人血清中人促甲狀腺激素的測定

本實施例證實了在不包括洗滌步驟的測定中，染料用于減小信號背景的應(yīng)用。它組合了使用抗體偶聯(lián)的熒光顆粒對靶物的特異性標記和使用抗體偶聯(lián)的磁性顆粒對靶物的特異性選擇。向反應(yīng)中加入染料，允許檢測檢測帶中的信號發(fā)射部分，同時消除由位于檢測帶之外的反應(yīng)中的未結(jié)合的顆粒造成的信號。在本實施例中，描述了在人血清中的人促甲狀腺激素(htsh)的測定，其使用小鼠單克隆抗-htsh抗體包被的熒光顆粒進行標記，并組合地用在染料存在下成像的小鼠單克隆抗-htsh抗體包被的磁性顆粒進行磁性選擇。

通過包含染料，增強了測定的特異性，所述染料吸收用作信號發(fā)射部分的熒光部分的激發(fā)和/或發(fā)射波長。該染料將成像信號發(fā)射靶物絡(luò)合物的能力限制在檢測帶中。在圖8中顯示了鉻變素2r的波譜。實線顯示了測得的染料鉻變素2r的吸收波譜。用括號指示在圖像儀中使用的激發(fā)和發(fā)射濾光器的透射特性，所述括號跨濾光器的fwhm規(guī)格（fwhmspecification）。

方法。在該實驗中，證實了染料會減少來自熒光微粒的信號。使用2mm直徑的粘性硅橡膠墊圈(grace)，在顯微鏡載玻片上形成孔。加入40μl熒光顆粒(invitrogen目錄號8813)的等分試樣，其含有或不含有5.5mg/ml鉻變素2r溶液(sigma-aldrichc3143)。然后在高流通量自動化圖像分析儀中對孔成像。該方法描述了不經(jīng)洗滌在有染料存在下使用磁性捕獲和熒光顆粒標記法對人血清中的htsh進行免疫測定的方法。如在實施例2中所述，制備抗-htsh包被的熒光顆粒，進行下述修改：使用500nm熒光顆粒(invitrogen目錄號8813)，且抗體是小鼠單克隆抗-htsh(meridianoem目錄號mat04-005)。如在實施例4中所述，制備抗-htsh包被的磁性顆粒，進行下述修改：抗體是小鼠單克隆抗-htsh(thermoseradyn目錄號mit-0409)。通過將已知量的重組htsh(cellsciences,目錄號crt505b)摻加到事先清除內(nèi)源性tsh的合并的人血清中，制備實驗樣品。在96孔微孔滴定板中進行反應(yīng)。反應(yīng)物(50μl)含有2μl用抗–htsh抗體包被的熒光顆粒(0.02%w/v)、2μl用抗-htsh包被的磁性顆粒(0.25%w/v)、21μl200mmepps緩沖液（含有400mm1,3二氨基丙烷，ph7.8）和25μl含有不同濃度的htsh的血清樣品?；旌戏磻?yīng)組分后，在環(huán)境溫度溫育反應(yīng)物10min，以允許形成htsh與熒光顆粒和磁性顆粒的‘夾心’免疫絡(luò)合物。溫育后，將50μl25mg/ml染料(鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)、0.5%w/v魚明膠(sigma-aldrich目錄號g7765)在pbs-tbp中的溶液加入孔中。然后將平板放在磁體陣列上，其中磁體位于每個孔的中央底部。磁性地選擇磁性顆粒-htsh-熒光顆粒絡(luò)合物10分鐘后，在自動化成像分析儀上對平板成像，曝光時間為0.1秒。然后使用成像軟件，計算單個熒光顆粒。另一個實驗取出上面的反應(yīng)混合物，并吸量等分試樣到墊子層上面，有和沒有鉻變素2r存在。

結(jié)果。圖9是如在上面的第二個實驗中所述有和沒有染料的孔的圖像，并證實了本發(fā)明的一個實施方案，其中使用染料來將選擇的靶物-信號發(fā)射部分絡(luò)合物的檢測限制在檢測帶。圖10中的數(shù)據(jù)顯示了htsh免疫測定的劑量響應(yīng)曲線，指示通過在有染料存在下進行未放大的成像，不經(jīng)整合洗滌步驟地進行免疫測定。

結(jié)論。該結(jié)果表明，作為本發(fā)明的一個實施方案，染料的使用允許用戶進行免疫測定，無需使用洗滌步驟來去除未反應(yīng)的信號發(fā)射部分。所述方法允許通過信號發(fā)射絡(luò)合物、選擇部分和染料的組合，檢測在復(fù)雜基質(zhì)中的低濃度靶物(圖10)，所述染料減少來自在檢測帶之外的游離的信號發(fā)射部分和未選擇的信號發(fā)射部分非靶物絡(luò)合物的背景。

替代實施方案。本實施例的方法可以用于檢測多種靶物，其中使用其它適當?shù)姆N類特異性的結(jié)合部分替換在本實施例中使用的抗-tsh抗體。在其它實施方案中，可以使用不同的信號特征，例如熒光、化學(xué)發(fā)光、光吸收、光散射、磷光、酶反應(yīng)性和拉曼散射，并選擇適當?shù)娜玖?。例如染料甲苯胺藍o可以與熒光標記德克薩斯紅(硫代羅丹明)一起使用。

實施例6.使用染料-墊子試劑減少試驗背景，所述試劑允許進行完整試驗，無需任何洗滌步驟來去除未反應(yīng)的測定反應(yīng)物，并進行未放大的成像。

在本實施例中，描述了可用于實踐本發(fā)明的染料-墊子試劑(例如，含有染料和密度試劑的混合物的試劑)。本實施例提供了制備說明，并證實了染料-墊子試劑屬性可以用于減少試驗背景和在一個容器中進行試驗，無需洗滌來分離測定反應(yīng)物。

存在于檢測帶之外的未結(jié)合的信號發(fā)射部分可以建立靶物的未放大成像的背景。通過加入將成像限制在檢測帶的染料，可以減少該背景(實施例5)。在該實施例中，我們使用染料與密度試劑的組合來進一步減少信號發(fā)射背景，其中通過從檢測帶排除未結(jié)合的信號發(fā)射部分，允許僅檢測由選擇過程導(dǎo)致沉積在檢測帶中的信號。

方法。使用2mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrich目錄號c3143)和60%wt/wt蔗糖(jtbaker,目錄號4097-04)在tris-tbp中的溶液，制備蔗糖染料-墊子試劑。使用2mg/ml鉻變素r2(sigma-aldrich目錄號c3143)和25%v/voptiprep?(sigma-aldrich,目錄號d1556)在tris-tbp中的溶液，制備optiprep?染料-墊子試劑。

在一個實驗中，反應(yīng)混合物(50μl)含有2μl用抗–htsh抗體包被的熒光顆粒(0.02%w/v)、2μl用抗-htsh包被的磁性顆粒(0.25%w/v)、21μl200mmepps緩沖液（含有400mm1,3二氨基丙烷，ph7.8）和25μl含有不同濃度的htsh的血清樣品?；旌戏磻?yīng)組分后，在環(huán)境溫度溫育反應(yīng)物10min，以允許形成htsh與熒光顆粒和磁性顆粒的‘夾心’免疫絡(luò)合物。溫育后，將25μl反應(yīng)混合物鋪在30μl墊子試劑上面，所述墊子試劑含有或沒有鉻變素r2染料組分，在具有清澈底部的黑色微量培養(yǎng)板(corning3881)中。在高流通量自動化成像分析儀上，對孔成像。

在單獨的實驗中，將上面的反應(yīng)混合物(25μl)鋪在染料墊子試劑(含有鉻變素r2染料)上面。然后在高流通量自動化成像分析儀上對孔成像。對孔成像后，使用磁棒儀器，對這些孔進行磁性選擇。5min磁性選擇步驟后，對相同孔重新成像。

結(jié)果。圖11表明，染料在染料-墊子試劑中的存在，徹底屏蔽了源自檢測帶之外的任何信號。圖12所示的結(jié)果證實，在有染料存在下，可以檢測通過熒光顆粒-tsh-磁性顆粒絡(luò)合物的磁性選擇而沉積在檢測帶中的信號發(fā)射部分。

結(jié)論。可以看出，染料-墊子的組合急劇減少了來自被密度層從檢測帶中分離的未反應(yīng)的試劑和非靶物絡(luò)合物的背景。本實施例證實了染料-墊子試劑對本發(fā)明的貢獻，并允許不經(jīng)過洗滌地通過未放大的成像來檢測靶物。在+靶物圖像中可以辨別單個熒光信號發(fā)射顆粒，并通過軟件直接計數(shù)。

替代實施方案。替代實施方案也可以結(jié)合其它密度試劑，包括其它常用的密度試劑，諸如碘克沙醇、泛影鈉、甲泛影鈉、甲泛葡胺、蔗糖和其它糖類、寡糖、合成聚合物(例如ficoll)和不同的鹽諸如氯化銫、溴化鉀等。

替代實施方案可以使用其它信號發(fā)射部分和其它染料，可以用于匹配使用的信號發(fā)射部分的信號發(fā)射特征。例如染料甲苯胺藍o可以與熒光標記德克薩斯紅(硫代羅丹明)一起使用。

實施例7.染料墊子試劑對紅血細胞懸浮液的視覺證實。

本實施例視覺地證實了墊子試劑的維持疊加反應(yīng)混合物（其可以包括固體如顆粒和細胞）與鄰近檢測表面的檢測帶之間的分離的能力。通過它的阻止全血樣品中的紅血細胞沉降到含有適當密度的墊子的孔的底部的能力，證實了墊子用于使覆蓋反應(yīng)物與檢測帶分離的用途。

方法。將optiprep?(sigma-aldrichd1556)的20μl10、15、20、25、30、35和40%v/v溶液的等分試樣吸量到nunc384孔澄明微孔滴定板的孔中。將牛全血(10μl)鋪在optiprep?溶液的上面，并溫育15分鐘。溫育后，視覺地檢查孔的任何混合，并使用數(shù)字照相機照相。

結(jié)果。顯示在圖13中的圖像證實，大于或等于25%v/v的optiprep?濃度能保持全血樣品與檢測帶(孔底)完全分離至少15min。

結(jié)論。可以看出，墊子的使用會維持疊加試劑混合物和檢測帶之間的分離。除了避免來自樣品的組分沉降到檢測帶中以外，在該密度范圍中的墊子會從檢測帶排除未結(jié)合的標記，因為標記顆粒的密度小于本實施例的紅血細胞。未結(jié)合的標記的排除，會增加特異性地選擇的標記的檢測的靈敏度。本實施例是證實染料墊子試劑的功能的本發(fā)明的實施方案。

替代實施方案。其它試劑可以用于生成本實施例的致密墊子。當使用它們來制備類似密度的墊子時，疊加反應(yīng)物與檢測帶的分離是類似的。

實施例8.人全血中人促甲狀腺激素的檢測

本實施例描述了通過不含任何洗滌步驟的未放大的成像測定人全血中的人促甲狀腺激素(htsh)。測定使用小鼠單克隆抗-htsh包被的熒光的且磁性的的顆粒來將信號發(fā)射部分和選擇部分結(jié)合到在人全血樣品中所含有的tsh分子上。使用磁性選擇，通過染料墊子，將熒光顆粒-tsh-磁性顆粒絡(luò)合物沉積到檢測帶中。在反應(yīng)孔中進行反應(yīng)，并將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到成像孔中的染色的墊子的上面，然后施加磁性選擇。

方法。在一個實驗中，20μl反應(yīng)混合物包括：10μl200mmepps(sigma-aldrich目錄號e9502)緩沖液（含有400mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)ph7.8），2μl被抗–htsh抗體包被的熒光顆粒(0.02%w/v)，2μl被抗-htsh包被的磁性顆粒(0.25%w/v)，1μl未包被的dynaldynabeads?‘載體’磁體(dynabeads(7.2mg/ml)在20mmtris-tbp溶液中預(yù)溫育15min，然后使用)，和5μl其中已經(jīng)事先摻加了htsh的全血樣品。將反應(yīng)混合物溫育10min(注：預(yù)期‘載體’磁體會加速磁性選擇步驟，但不是實踐本發(fā)明所必需的)。在一個單獨的384孔黑色孔聚苯乙烯平板中，將10μl染色的墊子試劑(含有2mg/ml鉻變素2r的30%w/voptiprep?)加入特定孔中。在溫育結(jié)束時，將每種反應(yīng)混合物的5μl等分試樣鋪在染料墊子層的上面，并將平板放在具有平行磁棒的板夾上。然后將平板和磁體裝置放入高流通量自動化成像分析儀中。然后在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用成像軟件，計算單個熒光顆粒。

結(jié)果。在圖14中的數(shù)據(jù)顯示了在沒有和有靶物存在下試驗孔的未放大的圖像的實施例。圖15顯示了通過使用自動化軟件分析圖像產(chǎn)生的全血中的tsh試驗的劑量響應(yīng)曲線數(shù)據(jù)。這2個結(jié)果顯示了使用不經(jīng)任何洗滌步驟的未放大的成像對來自復(fù)雜基質(zhì)（如全血）的htsh的特異性的且靈敏的檢測。

結(jié)論。實施例8證實，使用抗-tsh-綴合的熒光顆粒（用于信號發(fā)射）和抗-tsh-綴合的磁性顆粒（用于選擇）的試驗形式與染色的-墊子和未放大的成像的使用的組合，允許檢測復(fù)雜基質(zhì)（如人血液）中的tsh，無需洗滌步驟。

可以在+靶物圖像中辨別單個熒光信號發(fā)射顆粒，并通過軟件直接地計數(shù)。

通過染料-墊子試劑的包含，會增強試驗的特異性。染料會吸收用作標記的熒光部分的激發(fā)和/或發(fā)射波長。該染料將對信號發(fā)射靶物絡(luò)合物成像的能力限制在檢測帶。致密墊子的加入允許使選擇性的絡(luò)合物與非選擇性的絡(luò)合物分離，進一步減少背景。

替代實施方案。其它實施方案可以使用不同的信號發(fā)射部分、選擇部分和染料和墊子組分。

其它實施方案可以使用相同的試驗形式來檢測許多不同的靶物，包括細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

所述方法適用于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，包括全血、血漿、糞便、廢水、奶等。

也可以在選擇之前處理樣品，例如可以離心全血以去除細胞組分，可以用甲醇固定細胞，可以提取和純化dna，可以釋放通常發(fā)現(xiàn)結(jié)合到血清因子上的激素、蛋白和維生素，和通過其它過程。

盡管該試驗包括同時接觸抗-tsh熒光顆粒、抗-tsh磁性顆粒、和來自樣品的tsh，本發(fā)明的試驗可以連續(xù)進行。例如，可以用抗-tsh熒光顆粒預(yù)標記靶物，然后加入抗-tsh磁性顆粒。

實施例9.人血漿中人促甲狀腺激素的檢測。

本實施例描述了通過不含任何洗滌步驟的未放大的成像測定人血漿中的人促甲狀腺激素(htsh)。測定使用小鼠單克隆抗-htsh包被的熒光的且磁性的的顆粒來將信號發(fā)射部分和選擇部分結(jié)合到在人全血樣品中所含有的tsh分子上。使用磁性選擇，通過染料墊子，將熒光顆粒-tsh-磁性顆粒絡(luò)合物沉積到檢測帶中。在反應(yīng)孔中進行反應(yīng)，并將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到成像孔中的染色的墊子的上面，然后施加磁性選擇。

方法。在一個實驗中，反應(yīng)混合物(20μl)含有：10μl200mmepps(sigma-aldrich目錄號e9502)緩沖液（含有400mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)ph7.8），2μl被抗–htsh抗體包被的熒光顆粒(0.02%w/v)，2μl被抗-htsh包被的磁性顆粒(0.25%w/v)，和5μlhtsh(摻入人血漿中，所述人血漿事先使用在實施例5中生產(chǎn)的抗-htsh抗體包被的磁性顆粒去除htsh)。將反應(yīng)物溫育10min。在一個單獨的384孔黑色孔聚苯乙烯平板中，將10μl染色的墊子試劑(含有5mg/ml鉻變素2r的30%w/voptiprep?)加入特定孔中。在溫育結(jié)束時，將每種反應(yīng)混合物的5μl等分試樣鋪在單個孔的染料墊子層的上面，并將平板放在具有平行磁棒的板夾上。然后將平板和磁體裝置放入高流通量自動化成像分析儀中。然后在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用成像軟件，計算單個熒光顆粒。

結(jié)果。在圖16中的數(shù)據(jù)顯示了在沒有和有靶物存在下試驗孔的未放大的圖像的實施例。圖17顯示了通過使用自動化軟件分析圖像產(chǎn)生的劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)。這2個結(jié)果顯示了使用不經(jīng)任何洗滌步驟的未放大的成像對來自復(fù)雜基質(zhì)（如血漿）的htsh的特異性的且靈敏的檢測。

結(jié)論。實施例9證實，使用抗-tsh-綴合的熒光顆粒（用于信號發(fā)射）和抗-tsh-綴合的磁性顆粒（用于選擇）的試驗形式與染色的-墊子和未放大的成像的使用的組合，允許檢測復(fù)雜基質(zhì)（如人血漿）中的tsh，無需洗滌步驟。

可以在+靶物圖像中辨別單個熒光信號發(fā)射顆粒，并通過軟件直接地計數(shù)。

通過染料-墊子試劑的包含，會增強試驗的特異性。染料會吸收用作標記的熒光部分的激發(fā)和/或發(fā)射波長。該染料將對信號發(fā)射靶物絡(luò)合物成像的能力限制在檢測帶。致密墊子的加入允許使選擇性的絡(luò)合物與非選擇性的絡(luò)合物分離，進一步減少背景。

替代實施方案。其它實施方案可以使用不同的信號發(fā)射部分、選擇部分和染料和墊子組分。

其它實施方案可以使用相同的試驗形式來檢測許多不同的靶物，包括細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

所述方法適用于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，包括全血、血漿、糞便、廢水、奶等。

也可以在選擇之前處理樣品，例如可以離心全血以去除細胞組分，可以用甲醇固定細胞，可以提取和純化dna，可以釋放通常發(fā)現(xiàn)結(jié)合到血清因子上的激素、蛋白和維生素，和通過其它過程。

盡管該試驗包括同時接觸抗-tsh熒光顆粒、抗-tsh磁性顆粒、和來自樣品的tsh，本發(fā)明的試驗可以連續(xù)進行。例如，可以用抗-tsh熒光顆粒預(yù)標記靶物，然后加入抗-tsh磁性顆粒。

實施例10:人血漿中炭疽芽孢桿菌(anthrax)致死因子的檢測。

本實施例描述了人血漿中細菌毒素（炭疽芽孢桿菌致死因子）的測定。該測定使用小鼠單克隆抗-anthrax致死因子包被的熒光的且磁性的顆粒來將信號發(fā)射部分和選擇部分結(jié)合到在人血漿樣品中所含有的致死因子分子上。使用磁性選擇，通過染料墊子，將熒光顆粒-致死因子-磁性顆粒絡(luò)合物沉積到檢測帶中。在反應(yīng)孔中進行反應(yīng)，并將反應(yīng)混合物覆蓋到成像孔中的染色的墊子的上面，然后施加磁性選擇。

方法。反應(yīng)混合物(50μl)含有：10μl200mmepps(sigma-aldrich目錄號e9502)緩沖液（含有400mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)ph7.8），10μl被抗-anthrax致死因子抗體（作為包被抗體）包被的熒光顆粒(0.007%w/v)，10μl被抗-anthrax致死因子抗體(iqcorp.,目錄號lf-iq)(如實施例2所述制備，其中使用抗-anthrax致死因子抗體)包被的磁性顆粒(0.05%w/v)(如實施例4所述制備，進行下述修改:使用抗-anthrax致死因子單克隆抗體作為包被抗體)，10μl緩沖液（含有1mg/ml藻酸(sigma-aldrich目錄號a2158)、2.5%w/v聚乙烯吡咯烷酮(sigma-aldrich目錄號pvp40)、0.5mg/ml牛γ球蛋白(lampirelaboratories目錄號7400805)和1mg/ml小鼠γ球蛋白(jacksonimmunoresearch目錄號015-000-002)pbs溶液ph7.4），和10μl摻加了重組炭疽致死因子(listlaboratories目錄號172b)的人血漿樣品。將反應(yīng)物溫育10min。在一個單獨的具有清澈底部的96孔黑色孔聚苯乙烯平板中，將染料墊子試劑(含有2mg/ml鉻變素2r的15%optiprep?)加入特定孔中。在溫育結(jié)束時，將每種反應(yīng)混合物的40μl等分試樣鋪在染料墊子層的上面，并將平板放在磁棒上。然后將平板放入高流通量自動化成像分析儀中。在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光顆粒。

結(jié)果。圖18顯示了在沒有和有靶物存在下試驗孔的未放大的圖像的實施例。圖19顯示了通過使用自動化軟件分析圖像產(chǎn)生的劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)。這2個結(jié)果顯示了使用不經(jīng)任何洗滌步驟的未放大的成像對來自復(fù)雜基質(zhì)（如血漿）的炭疽致死因子的特異性的且靈敏的檢測。

結(jié)論。實施例10證實，使用抗-致死因子-綴合的熒光顆粒（用于信號發(fā)射）和抗-致死因子-綴合的磁性顆粒（用于選擇）的試驗形式與染色的-墊子和未放大的成像的使用的組合，允許檢測復(fù)雜基質(zhì)（如人血漿）中的炭疽致死因子，無需洗滌步驟。

在低靶物濃度，可以在+靶物圖像中辨別單個熒光信號發(fā)射顆粒，并通過軟件直接地計數(shù)。

通過染料-墊子試劑的包含，會增強試驗的特異性。染料會吸收用作標記的熒光部分的激發(fā)和/或發(fā)射波長。該染料將對信號發(fā)射靶物絡(luò)合物成像的能力限制在檢測帶。致密墊子的加入允許使選擇性的絡(luò)合物與非選擇性的絡(luò)合物分離，進一步減少背景。

替代實施方案。其它實施方案可以使用不同的信號發(fā)射部分、選擇部分和染料和墊子組分。

其它實施方案可以使用相同的試驗形式來檢測許多不同的靶物，包括細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

所述方法適用于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，包括全血、血漿、糞便、廢水、奶等。

也可以在選擇之前處理樣品，例如可以離心全血以去除細胞組分，可以用甲醇固定細胞，可以提取和純化dna，可以釋放通常發(fā)現(xiàn)結(jié)合到血清因子上的激素、蛋白和維生素，和通過其它過程。

盡管該試驗包括同時接觸抗-靶物熒光顆粒、抗-靶物磁性顆粒和來自樣品的靶物，本發(fā)明的試驗可以連續(xù)進行。例如，可以用抗-靶物熒光顆粒預(yù)標記靶物，然后加入抗-靶物磁性顆粒。

實施例11.人血漿中炭疽芽孢桿菌(anthrax)保護抗原的檢測。

本實施例描述了人血漿中細菌毒素組分（炭疽芽孢桿菌的anthrax保護抗原）的測定。該測定使用小鼠單克隆抗-anthrax保護抗原包被的熒光的且磁性的顆粒來將信號發(fā)射部分和選擇部分結(jié)合到在人血漿樣品中所含有的保護抗原分子上。使用磁性選擇，通過染料墊子，將熒光顆粒-保護抗原-磁性顆粒絡(luò)合物沉積到檢測帶中。在反應(yīng)孔中進行反應(yīng)，并將反應(yīng)混合物覆蓋到成像孔中的染色的墊子的上面，然后施加磁性選擇。

方法。反應(yīng)混合物(50μl)含有：20μlpbs-tbp+400mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)ph7.8，10μl被抗-anthrax保護抗原抗體[c3,meridianbiodesign,目錄號c86613m]包被的熒光顆粒(0.007%w/v)(如實施例2所述制備，其中使用抗-anthrax保護抗原抗體作為包被抗體)，10μl被抗-anthrax保護抗體[bap-0105meridianbiodesign,目錄號c86501m)包被的磁性顆粒(0.05%w/v)(如實施例4所述制備，進行下述修改:使用抗-anthrax保護抗原作為包被抗體)，和10μl摻加了重組炭疽保護抗原(listlaboratories,目錄號171a)的人血漿樣品。將反應(yīng)物溫育10min。在一個單獨的具有清澈底部的96孔黑色孔聚苯乙烯平板中，將90μl染色的墊子試劑(含有2mg/ml鉻變素2r的15%optiprep?)加入特定孔中。在溫育結(jié)束時，將反應(yīng)混合物的40μl等分試樣鋪在染料墊子層的上面，并將平板放在構(gòu)建的磁棒上。然后將平板放入高流通量自動化成像分析儀中。在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光顆粒。

結(jié)果。圖20顯示了在沒有和有靶物存在下試驗孔的未放大的圖像的實施例。圖21顯示了通過使用自動化軟件分析圖像產(chǎn)生的劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)。這2個結(jié)果顯示了使用不經(jīng)任何洗滌步驟的未放大的成像對來自復(fù)雜基質(zhì)（如血漿）的炭疽保護抗原的特異性的且靈敏的檢測。

結(jié)論。實施例11證實，使用抗-anthrax保護抗原-綴合的熒光顆粒（用于信號發(fā)射）和抗-anthrax保護抗原-綴合的磁性顆粒（用于選擇）的試驗形式與染色的-墊子和未放大的成像的使用的組合，允許檢測復(fù)雜基質(zhì)（如人血漿）中的炭疽保護抗原，無需洗滌步驟。

通過染料-墊子試劑的包含，會增強試驗的特異性。染料會吸收用作標記的熒光部分的激發(fā)和/或發(fā)射波長。該染料將對信號發(fā)射靶物絡(luò)合物成像的能力限制在檢測帶。致密墊子的加入允許使選擇性的絡(luò)合物與非選擇性的絡(luò)合物分離，進一步減少背景。

替代實施方案。其它實施方案可以使用不同的信號發(fā)射部分、選擇部分和染料和墊子組分。

其它實施方案可以使用相同的試驗形式來檢測許多不同的靶物，包括細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

所述方法適用于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，包括全血、血漿、糞便、廢水、奶等。

也可以在選擇之前處理樣品，例如可以離心全血以去除細胞組分，可以用甲醇固定細胞，可以提取和純化dna，可以釋放通常發(fā)現(xiàn)結(jié)合到血清因子上的激素、蛋白和維生素，和通過其它過程。

盡管該試驗包括同時接觸抗-靶物熒光顆粒、抗-靶物磁性顆粒和來自樣品的靶物，本發(fā)明的試驗可以連續(xù)進行。例如，可以用抗-靶物熒光顆粒預(yù)標記靶物，然后加入抗-靶物磁性顆粒。

實施例12.人尿中細菌炭疽芽孢桿菌聚-d-γ-谷氨酸莢膜多肽(pdga)的檢測。

本實施例描述了人尿中細菌莢膜多肽（炭疽芽孢桿菌的聚-d-γ-谷氨酸）的測定。該測定使用小鼠單克隆抗-pdga-包被的熒光的且磁性的顆粒來將信號發(fā)射部分和選擇部分結(jié)合到在人血漿樣品中所含有的pdga上。使用磁性選擇，通過染料墊子，將熒光顆粒-pdga-磁性顆粒絡(luò)合物沉積到檢測帶中。在反應(yīng)孔中進行反應(yīng)，并將反應(yīng)混合物覆蓋到成像孔中的染色的墊子的上面，然后施加磁性選擇。

方法。50μl反應(yīng)混合物由下列組成：20μlpbs-tbp，10μl被抗-anthraxpdga抗體包被的熒光顆粒(0.007%w/v)(如實施例2所述制備，其中使用抗-anthraxpdga抗體作為包被抗體)，10μl被抗-anthraxpdga抗體包被的磁性顆粒(0.025%w/v)(如實施例4所述制備，進行下述修改:抗-anthraxpdga作為包被抗體)和10μl摻加聚-d-γ-谷氨酸(合成的50-聚體,anaspec)的人尿樣品。將反應(yīng)物溫育5min。在一個單獨的具有清澈底部的96孔黑色孔聚苯乙烯平板中，將染料墊子試劑(含有2mg/ml鉻變素2r的15%optiprep?)加入特定孔中。在溫育結(jié)束時，將反應(yīng)混合物的40μl等分試樣鋪在染料墊子層的上面，并將平板放在針磁體陣列上7分鐘。在高流通量自動化成像分析儀中對平板成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光顆粒。

結(jié)果。圖22顯示了在沒有和有靶物存在下試驗孔的未放大的圖像的實施例。圖23顯示了通過使用自動化軟件分析圖像產(chǎn)生的劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)。這2個結(jié)果顯示了人尿中pdga的特異性的且靈敏的檢測，證實了可以用作本發(fā)明的樣品的基質(zhì)的多樣性。

結(jié)論。實施例12證實，使用抗-pdga-綴合的熒光顆粒（用于信號發(fā)射）和抗-pdga-綴合的磁性顆粒（用于選擇）的試驗形式與染色的-墊子和未放大的成像的使用的組合，允許檢測尿中的炭疽保護抗原，無需洗滌步驟。

替代實施方案。因為pdga是具有任意單個單克隆抗體的多個結(jié)合位點的重復(fù)聚合物，替代實施方案可以使用綴合到熒光的且磁性的顆粒上的單個抗體。

其它實施方案可以使用不同的信號發(fā)射部分、選擇部分和染料和墊子組分。

其它實施方案可以使用相同的試驗形式來檢測許多不同的靶物，包括細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

所述方法適用于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，包括全血、血漿、糞便、廢水、奶等。

也可以在選擇之前處理樣品，例如可以離心全血以去除細胞組分，可以用甲醇固定細胞，可以提取和純化dna，可以釋放通常發(fā)現(xiàn)結(jié)合到血清因子上的激素、蛋白和維生素，和通過其它過程。

盡管該試驗包括同時接觸抗-靶物熒光顆粒、抗-靶物磁性顆粒和來自樣品的靶物，本發(fā)明的試驗可以連續(xù)進行。例如，可以用抗-靶物熒光顆粒預(yù)標記靶物，然后加入抗-靶物磁性顆粒。

實施例13:通過自動化分析檢測人全血中的炭疽芽孢桿菌(anthrax)致死因子。

本實施例描述了完全自動化的高處理量沖擊波試驗儀器用于測定人全血中的細菌毒素（炭疽芽孢桿菌致死因子）的應(yīng)用。該測定使用小鼠單克隆抗-anthrax致死因子-包被的熒光的且磁性的顆粒來將信號發(fā)射部分和選擇部分結(jié)合到在人血漿樣品中所含有的致死因子分子上。使用磁性選擇，通過染料墊子，將熒光顆粒-致死因子-磁性顆粒絡(luò)合物沉積到檢測帶中。將樣品載體呈遞給儀器，所述樣品載體含有摻加了不同濃度的致死因子的全血樣品。裝配儀器，并溫育反應(yīng)孔中的反應(yīng)物，然后將每個反應(yīng)物覆蓋到成像孔中的染色的墊子的上面，并將孔運輸?shù)酱判赃x擇臺，自動地對孔成像。

方法。試驗組合物與在實施例10所述的組合物相同。將所有試劑裝載進高流通量沖擊波試驗儀器的試劑杯中。在計算機控制下，通過完全自動化的機器人移液器，進行下述的所有吸量步驟。首先，將10μl200mmepps(sigma-aldrich目錄號e9502)緩沖液（其含有400mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)ph7.8）加入反應(yīng)杯中，然后吸量10μl試劑（含有在pbs中的1mg/ml藻酸(sigma-aldrich目錄號a2158)、2.5%w/v聚乙烯吡咯烷酮(sigma-aldrich目錄號pvp40)、0.5mg/ml牛γ球蛋白(lampirelaboratories目錄號7400805)和1mg/ml小鼠γ球蛋白(jacksonimmunoresearch目錄號015-000-002)）。加入10μl摻加了炭疽致死因子((listlaboratories,目錄號172b)的人全血。隨后，加入10μl抗-anthrax致死因子熒光顆粒的0.007%w/v稀釋物(如實施例10所述制備)和抗-anthrax致死因子磁性顆粒的10μl0.05%w/v稀釋物(如實施例10所述制備)，通過裝載（onboard）混合器混合，并溫育6min。在溫育期間，自動地向單獨的成像杯中加入90μl染色的墊子試劑(含有10mg/ml鉻變素2r的30%optiprep?)。溫育后，將40μl反應(yīng)混合物鋪在分析儀成像孔中的染料-墊子層的上面。然后將成像杯自動地移動到分析儀內(nèi)的磁體上面，并進行磁性分離1min。將磁性顆粒沉積到檢測帶中以后，將成像杯自動地移動到成像臺上，然后在分析儀上成像，曝光時間為0.1秒。然后計算單個熒光顆粒，并使用分析儀上的軟件，以自動化的方式分析樣品結(jié)果。

結(jié)果。在圖24中顯示了使用完全自動化的沖擊波試驗儀器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。該圖顯示了使用軟件自動化分析獲取的圖像所產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線。這些結(jié)果證實了使用不具有任何洗滌步驟的未放大的成像對來自復(fù)雜基質(zhì)（如人血液）的炭疽芽孢桿菌致死因子的完全自動化的、特異性的、且靈敏的檢測。

結(jié)論。實施例13證實，本發(fā)明的試驗可以在高處理量系統(tǒng)中完全自動化。

實施例14-炭疽芽孢桿菌(anthrax)莢膜肽-聚-γ-d-谷氨酸(pdga)的測定–競爭形式。

實施例15描述了使用放大成像，使用競爭測定形式測定anthrax聚-γ-d-谷氨酸(pdga)，無需洗滌步驟。小分子(半抗原)通常僅可以被單個特異性的結(jié)合部分結(jié)合。這不允許它們被連接到信號發(fā)射和選擇部分上的種類結(jié)合部分同時結(jié)合。通過使用‘競爭’形式，通過本發(fā)明的方法，仍然可以分析這樣的靶物。許多不同形式的‘競爭’結(jié)合試驗是本領(lǐng)域眾所周知的。

在本實施例中使用的‘競爭’形式使用多個靶物，所述靶物綴合到選擇部分上，形成靶物競爭物。在樣品中沒有靶物的情況下，綴合到靶物特異性的種類結(jié)合部分上的熒光顆粒會結(jié)合靶物競爭物，并在試驗中被選擇和檢測。當存在靶物時，它與靶物競爭物競爭結(jié)合熒光顆粒，由此減少在試驗中檢測到的信號的量。該減少與存在的靶物的量成比例。

方法。在實施例13中描述了抗-pdga抗體包被的熒光顆粒的制備。如實施例4所述，生產(chǎn)抗生蛋白鏈菌素包被的磁性顆粒，經(jīng)過下述修改：其中將抗生蛋白鏈菌素(prozymesa10)綴合到磁性顆粒（而不是抗體）上。將過量的生物素化的合成的pdga9-聚體肽(由anaspec生產(chǎn))加給抗生蛋白鏈菌素-包被的磁性顆粒，并溫育1小時。然后在pbs-tbp、ph7.4中充分洗滌pdga磁性顆粒。將2μl抗-pdga抗體包被的熒光顆粒與25μl含有不同濃度的pdga9-甲狀腺球蛋白綴合物的樣品相混合，然后與2μlpdga-磁性顆粒相混合。在搖動下，將反應(yīng)物溫育5分鐘。稀釋反應(yīng)物，并放在磁體上，以分離結(jié)合的和未結(jié)合的熒光顆粒。去除上清液，并通過在victor2熒光計中讀數(shù)，檢測捕獲的熒光。大量抗體-包被的熒光顆粒被抗原-包被的磁性顆粒捕獲。信號抑制(競爭)的程度與樣品中的細菌莢膜肽的量相對應(yīng)。

結(jié)果。在圖25中顯示的結(jié)果表明，使用磁性捕獲的競爭免疫測定形式可以用于檢測靶物(來自炭疽芽孢桿菌的pdga)是否存在。數(shù)據(jù)證實了使用‘競爭’形式的結(jié)合試驗特有的抑制試驗曲線。

結(jié)論。實施例14顯示了可以與本發(fā)明的某些實施方案一起使用的替代試驗形式(競爭)，用于檢測來自不同樣品的靶物，且可以容易地整合進本發(fā)明的試驗中。

替代實施方案。如上所述，與含有不同量的pdga9肽的樣品一起，混合抗-pdga熒光顆粒和pdga-競爭物-偶聯(lián)的磁性顆粒。接觸步驟后，將反應(yīng)混合物鋪在染色的墊子上面，進行磁性選擇，并在高流通量自動化成像分析儀中成像，曝光時間為0.1秒。在樣品中沒有pdga9的情況下，大量顆粒被捕獲在檢測帶中。隨著樣品中pdga的量增加，捕獲的顆粒的數(shù)目減少。

存在多種可以用于本發(fā)明中的本領(lǐng)域眾所周知的‘競爭’結(jié)合試驗形式。在另一個競爭測定實施方案中，信號發(fā)射部分和選擇部分都綴合到靶物競爭物上。通過在反應(yīng)物中供給的至少二價的種類特異性的分子(例如抗體)，實現(xiàn)信號發(fā)射部分和捕獲部分的交聯(lián)。通過加入的靶物與二價的種類特異性的結(jié)合部分的結(jié)合，抑制交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致信號的量減少（當靶物存在于反應(yīng)物中時）。在第三個競爭實施方案中，信號發(fā)射和選擇部分各自綴合到可以結(jié)合靶物的種類特異性的結(jié)合部分上。至少二價的靶物競爭物綴合物的加入，會誘導(dǎo)選擇信號-選擇部分絡(luò)合物的形成。另外，靶物的加入，會減少信號發(fā)射部分和選擇部分之間的交聯(lián)絡(luò)合物的形成。

其它實施方案可以使用這些競爭測定形式中的任一種的不同的信號發(fā)射部分、選擇部分和染料和墊子組分。

實施例15.陽性和陰性內(nèi)部對照用于確保測定準確度的應(yīng)用

本實施例描述了實驗樣品的平行的內(nèi)部陽性對照和內(nèi)部陰性對照運行在本發(fā)明的某些實施方案中的整合，以測試實驗結(jié)果上的基質(zhì)效應(yīng)。在實驗基質(zhì)中的內(nèi)部對照運行的整合，會確保實驗結(jié)果的準確度，減少假結(jié)果和對再檢驗的需求。

當將對照加入實驗樣品中時，預(yù)見到陽性對照(例如，將預(yù)定量的靶物加入實驗樣品中)會增加可確定的增加信號。如果陽性對照未被檢測出，樣品可以視作具有陰性干擾，并適當?shù)亟忉?。類似地，用于抑制由樣品中的靶物產(chǎn)生的信號(例如，通過加入大量種類特異性的結(jié)合部分，其用于將標記結(jié)合到靶物上)的陰性對照，會導(dǎo)致由陽性樣品產(chǎn)生的信號的減小。在陰性對照孔中沒有表現(xiàn)出減小的信號的陽性樣品要么是假陽性，要么是非常高的真陽性。通過樣品的稀釋，可以區(qū)分這些替代方案。

方法。該實驗使用抗-靶物抗體包被的熒光的且磁性的顆粒，用于檢測如實施例5、11和12所述的不同的對應(yīng)靶物htsh、炭疽保護抗原(pa)和炭疽莢膜聚-d-γ-谷氨酸(pdga)。將含有和沒有靶物的樣品(各100pg/ml)的單獨反應(yīng)混合物加入3個孔中的每一個中，每個試驗使用下述的反應(yīng)混合物，具有下述添加：對于樣品定量，pbs-tbp,ph7.4；對于陽性內(nèi)部對照，在pbs-tbp中的100pg/ml靶物；對于陰性內(nèi)部對照，在pbs-tbp中的大量過量(1μg/ml)的游離的靶物特異性的抗體(在抗體包被的熒光顆粒上的相同抗體)(細節(jié)參見實施例5、11和12)。將樣品溫育10min。在一個單獨的具有清澈底部的96孔黑色孔聚苯乙烯平板中，將染料墊子試劑(90μl)加入特定孔中。在溫育結(jié)束時，將反應(yīng)混合物的40μl等分試樣鋪在染料墊子層的上面，并將平板放在磁棒陣列上，以進行選擇步驟。將平板放入高流通量自動化成像分析儀中，對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光顆粒。

結(jié)果。圖26顯示了在含有和沒有靶物的實驗樣品中的實驗性的、陽性的和陰性的內(nèi)部對照運行的每個試驗(htsh、anthraxpa和anthraxpdga)的圖像。從該圖可以看出，該方法允許為假陰性和假陽性反應(yīng)校正試驗結(jié)果。

結(jié)論。該實驗證實了在本發(fā)明中提出的實施方案之一，它是關(guān)于對照，即本發(fā)明的內(nèi)部對照工作，且可以用于確保結(jié)果的準確性。結(jié)果顯示了在含有和沒有靶物的孔中的預(yù)期的信號和無信號(+和-)。如預(yù)期的，陽性內(nèi)部對照孔在所有孔中顯示出陽性信號，如預(yù)期的，陰性內(nèi)部對照沒有顯示出信號。

替代實施方案。在本發(fā)明的某些實施方案中，陰性或陽性內(nèi)部對照可以單獨使用。替代陰性對照包括與無關(guān)的種類-結(jié)合分子綴合的信號發(fā)射部分的使用。

在本發(fā)明的其它實施方案中，可以使用陰性和陽性內(nèi)部對照來驗證使用的試劑的性能，包括在筒內(nèi)或在孔中干燥的那些。

陽性和陰性內(nèi)部對照可以用于具體實施方案中，諸如樣品中抗藥細菌或癌細胞的檢測。在這些實施方案中，可以使用對照來證實，生長步驟適當?shù)匕l(fā)生，并區(qū)分抗藥的和藥物敏感的細胞群體。

實施例16.通過非特異性的sybr?綠i染色和使用特異性地結(jié)合細胞表面抗原蛋白a的磁性納米顆粒來特異性檢測金黃色葡萄球菌細胞。

本實施例描述了使用非特異性染色劑染色金黃色葡萄球菌細菌細胞、隨后使用靶物特異性的磁性顆粒來檢測特定靶物的方法。靶物特異性的磁性顆粒與非特異性染色的組合使用，在本發(fā)明的背景下具有普遍用途，因為染色和靶物的捕獲允許使用未放大的成像來容易地計算靶物。

本實施例使用未放大的成像證實了，使用sybr?綠1染料可以容易地標記金黃色葡萄球菌，并使用靶物特異性的磁性顆粒特異性地捕獲。

所述方法因而可以用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法。在圖27中顯示了使用sybr?綠1和抗-蛋白a抗體包被的磁性顆粒的金黃色葡萄球菌試驗的示意圖。使用sybr?綠1和如實施例4所述生產(chǎn)的抗-蛋白a抗體包被的磁性顆粒，標記金黃色葡萄球菌細胞。在35℃在生長培養(yǎng)基tsb(胰蛋白酶處理過的大豆湯,acumedia目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。使用在zeiss顯微鏡上的petroff-hausser計數(shù)池，計數(shù)金黃色葡萄球菌細胞，并在新鮮的tsb中稀釋細胞至2x10⁵細胞/ml。在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)中進行反應(yīng)。反應(yīng)混合物(50μl)含有25μl金黃色葡萄球菌細胞(5,000細胞)、20μlsybr?綠1染料(在鹽水中1:2000x稀釋)和5μl懸浮于pbs-tbp溶液(10mm磷酸鹽,140mmnacl,3mmkcl(calbiochem目錄號524650)、0.05%w/v吐溫20(acros目錄號2333600010)、2mg/mlbsa(sigma-aldrich)、0.05%w/vproclin300(supelco)，調(diào)至ph7.4)中的抗-蛋白a包被的磁性顆粒(2x10¹⁰顆粒/ml)。通過抽吸，將測定反應(yīng)物混合均勻，并在環(huán)境溫度在黑暗中溫育15min。溫育后，將40μl反應(yīng)混合物覆蓋在70μl染色的墊子溶液(含有5mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)的15%optiprep?(sigma目錄號d1556))上，所述墊子溶液預(yù)等分在96-孔半面積直徑澄明底黑色平板(grainer,目錄號675096)中。為了選擇在孔底部處的細胞-顆粒絡(luò)合物，然后通過將它放在磁體上4min，對平板施加磁力。然后從磁體取下平板，并放入高流通量自動化成像分析儀中。然后在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光細胞。

結(jié)果。圖28顯示了使用sybr?綠1標記金黃色葡萄球菌細胞和使用抗體包被的磁性顆粒的特異性捕獲的試驗結(jié)果的圖像。圖a顯示了含有不具有金黃色葡萄球菌細胞的反應(yīng)物(陰性對照)的孔的圖像。圖b顯示了含有5000個金黃色葡萄球菌細胞的反應(yīng)物的孔的圖像，且圖c顯示了含有50,000個表皮葡萄球菌細胞的反應(yīng)物(作為特異性對照)的孔的圖像。從數(shù)據(jù)顯而易見，只有當反應(yīng)混合物含有金黃色葡萄球菌細胞時，才觀察到高熒光對象數(shù)目(圖b)。含有零細胞對照和表皮葡萄球菌的孔沒有產(chǎn)生超過背景的任何信號(圖a和c)。圖29證實了本文所述的方法能檢測和計算低濃度的單個細胞靶物。

結(jié)論。在本發(fā)明的背景下，該數(shù)據(jù)證實了抗體-包被的磁性顆粒可以用于特異性地捕獲標記的細胞(例如金黃色葡萄球菌)。此外，測定是高度特異性的，因為非金黃色葡萄球菌細菌(例如表皮葡萄球菌)沒有產(chǎn)生超過背景的信號，指示試驗特異性。如在以后的實施例中所證實的，本文使用的捕獲和標記方法在本發(fā)明的背景下可以與用于區(qū)分捕獲靶物和游離的信號發(fā)射部分和其它標記的實體的方法相組合。

在低靶細胞濃度，可以在+靶物圖像中辨別單個熒光細胞，并通過軟件直接地計數(shù)。

替代實施方案。可以使用其它核酸染色劑來標記細胞用于檢測，或可以采用其它類型的熒光細胞染色。可以采用靶物特異性的標記來進行細胞檢測；例如，綴合到抗-蛋白a抗體或alexa?490-標記的抗-蛋白a抗體上的熒光顆?？梢杂米鳂擞?。另外，可以將其它選擇模式用于該試驗中，包括使用致密顆粒的選擇。

實施例17.使用抗體-包被的熒光顆粒和特異性地結(jié)合細胞表面抗原蛋白a的磁性納米顆粒來特異性檢測金黃色葡萄球菌細胞

本實施例描述了使用抗-蛋白a抗體包被的熒光顆粒(實施例2)特異性地標記金黃色葡萄球菌細菌細胞、和使用磁性顆粒(實施例4)來檢測特定靶物的特異性捕獲的方法。靶物特異性的熒光的且磁性的顆粒與染料-墊子的組合使用，在本發(fā)明的背景下具有普遍用途，因為染色和靶物的捕獲允許使用未放大的成像來容易地計算靶物，無需任何洗滌步驟。

所述方法因而可以用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法。在圖30中顯示了使用抗-蛋白a抗體包被的熒光顆粒和抗-蛋白a抗體包被的磁性顆粒的金黃色葡萄球菌試驗的示意圖。在35℃在生長培養(yǎng)基tsb(胰蛋白酶處理過的大豆湯,acumedia目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。使用在zeiss顯微鏡上的petroff-hausser計數(shù)池，計數(shù)金黃色葡萄球菌細胞，并在新鮮的tsb中稀釋細胞至1x10⁶細胞/ml。在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)中進行反應(yīng)。反應(yīng)混合物(50μl)含有20μlpbs-tbp、10μl金黃色葡萄球菌細胞(10,000細胞)、10μl抗-蛋白a抗體包被的熒光顆粒(1.25x10¹⁰顆粒/ml)和10μl抗-蛋白a抗體包被的磁性顆粒(6.25x10⁹顆粒/ml)。通過抽吸，將測定反應(yīng)物混合均勻，并在環(huán)境溫度溫育30min。溫育后，將20μl反應(yīng)混合物覆蓋在70μl染色的-墊子溶液(含有5mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)的15%optiprep?(sigma目錄號d1556))上，所述墊子溶液預(yù)等分在96-孔半面積直徑澄明底黑色平板(grainer,目錄號675096)中。為了選擇在孔底部處的細胞-顆粒絡(luò)合物，然后通過將它放在磁體上，對平板施加磁力。然后從磁體取下平板，并放入高流通量自動化成像分析儀中。然后在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光細胞。我們已經(jīng)使用表皮葡萄球菌(attc菌株12228)作為特異性對照，其也以與上述類似的方式進行測定。

結(jié)果。圖31顯示了試驗結(jié)果的未放大的圖像，其中采用抗體包被的熒光顆粒（作為信號發(fā)射部分）和抗體包被的磁性顆粒（作為選擇部分）各自對金黃色葡萄球菌細胞的特異性標記和捕獲。圖a顯示了含有不具有金黃色葡萄球菌細胞的反應(yīng)物(陰性對照)的孔的圖像。圖b顯示了含有4000個金黃色葡萄球菌細胞的反應(yīng)物的孔的圖像，且圖c顯示了含有40,000個表皮葡萄球菌細胞的反應(yīng)物(作為特異性對照)的孔的圖像。從數(shù)據(jù)顯而易見，只有當反應(yīng)混合物含有金黃色葡萄球菌細胞時，才在圖像中看到高的單個熒光對象數(shù)目(圖b)。零細胞孔以及含有表皮葡萄球菌的孔沒有產(chǎn)生超過背景的任何信號(圖a和c)。圖32證實了本文所述的方法能檢測和計算低濃度的單個細胞靶物。

結(jié)論。在本發(fā)明的背景下，該數(shù)據(jù)證實了信號發(fā)射部分(抗體-包被的熒光顆粒)和選擇部分(磁性顆粒)在均勻試驗(無洗滌步驟)中用于特異性地標記和選擇金黃色葡萄球菌細胞并計算在低靶物濃度的細胞的應(yīng)用。此外，測定是高度特異性的，因為非金黃色葡萄球菌細菌(例如表皮葡萄球菌)沒有產(chǎn)生超過背景的信號，指示試驗特異性。如在以后的實施例中所證實的，本文使用的捕獲和標記方法在本發(fā)明的背景下可以與用于區(qū)分捕獲靶物和游離的信號發(fā)射部分和其它標記的實體的方法相組合。

在低靶細胞濃度，可以在+靶物圖像中辨別單個熒光細胞，并通過軟件直接地計數(shù)。

替代實施方案。在其它實施方案中，可以使用核酸染色劑來標記細胞用于檢測，或可以采用其它類型的非特異性的熒光細胞染色。可以采用靶物特異性的標記來進行細胞檢測；例如，alexa?490-標記的抗-蛋白a抗體可以用作標記。另外，可以將其它選擇模式用于該試驗中，包括使用致密顆粒的選擇。

實施例18.通過選擇性生長、隨后非特異性sybr?綠i染色、并使用特異性地結(jié)合細胞表面抗原蛋白a的磁性納米顆粒，特異性地檢測甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)

在本實施例中，我們描述了基于生長期間的表型選擇對抗藥細菌的測定，用于快速地檢測甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)。本實施例描述了使用非特異性染色劑染色金黃色葡萄球菌細菌細胞、然后使用靶物特異性的磁性顆粒來檢測特定靶物的方法。選擇性生長然后使用靶物特異性的磁性顆粒和非特異性染色的組合，在本發(fā)明的背景下具有普遍用途，因為差別生長、隨后對靶物的染色和捕獲允許使用未放大的成像容易地計算靶物，并檢測細菌的差別特征(諸如抗藥性)。

本實施例使用差別生長和未放大的成像證實，使用sybr?綠1染料染色，并使用靶物特異性的磁性顆粒的特異性捕獲，可以容易地檢測抗藥細菌。

所述方法因而可以用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

本實施例使用未放大的成像證實，使用sybr?綠1染料可以容易地標記金黃色葡萄球菌，且使用靶物特異性的磁性顆粒可以特異性地捕獲。

方法。在圖33中顯示了使用選擇性生長、隨后用未放大的成像快速檢測甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)的示意圖。通過計數(shù)在3個不同的生長條件(無生長，沒有抗生素的生長，和有抗生素存在的生長)下溫育樣品的等分試樣產(chǎn)生的細胞的數(shù)目，可以檢測mrsa。存在3種可能的細胞類型：非金黃色葡萄球菌，甲氧西林-敏感的金黃色葡萄球菌(mssa)、和甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)。將給定樣品中的細胞接種進上述3種培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)幾個倍增時間，用于對mrsa細胞進行可靠檢測，隨后是金黃色葡萄球菌的特異性檢測。

選擇性生長。對于該實驗，我們已經(jīng)使用了甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(mssa:atcc菌株29213)、甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa:atcc菌株43300)和表皮葡萄球菌(表皮葡萄球菌attc菌株12228)。在35℃、在沒有任何抗生素的生長培養(yǎng)基tsb(胰蛋白酶處理過的大豆湯,acumedia目錄號7164a)中培養(yǎng)這些細胞2-3小時，以達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。使用在zeiss顯微鏡上的petroff-hausser計數(shù)室，計數(shù)金黃色葡萄球菌/表皮葡萄球菌細胞，并在新鮮的tsb中稀釋細胞至1x10⁴細胞/ml。將每份細胞(100μl)接種進100μl新鮮的tsb培養(yǎng)基中，所述tsb培養(yǎng)基分別含有0.1%w/vproclin300(supelco)、僅tsb、和含有6μg/ml頭孢西丁(sigma,目錄號c4786)的tsb。在35℃在24-孔微孔滴定板(corning目錄號25820)中培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，如下測定這些樣品。

測定。在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)中進行測定反應(yīng)。反應(yīng)混合物(50μl)含有25μl來自每個生長樣品的培養(yǎng)基、20μlsybr?綠1染料(在0.9%氯化鈉溶液中1:2000x稀釋)和5μl抗-蛋白a包被的磁性顆粒（懸浮于pbs-tbpph7.4中）(2x10¹⁰顆粒/ml)。通過抽吸，將測定反應(yīng)物混合均勻，并在環(huán)境溫度在黑暗中溫育15min。溫育后，將40μl反應(yīng)混合物覆蓋在70μl染色的墊子溶液(含有5mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)的15%optiprep?(sigma目錄號d1556))上，所述墊子溶液預(yù)等分在96-孔半面積直徑澄明底黑色平板(grainer,目錄號675096)中。為了選擇在孔底部處的細胞-顆粒絡(luò)合物，然后通過將它放在磁體上4min，對平板施加磁力。然后從磁體取下平板，并放入高流通量自動化成像分析儀中。然后在上述的分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光細胞。

結(jié)果。圖34顯示了使用sybr?綠1的mrsa試驗和使用抗體包被的磁性顆粒的特異性捕獲的試驗結(jié)果。上圖(mssa)顯示了含有甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(mssa)的孔的圖像，中圖(mssa)顯示了含有甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(mrsa)的孔的圖像，下圖顯示了含有表皮葡萄球菌(陰性對照)的孔的圖像。從數(shù)據(jù)顯而易見，mssa顯示出在僅一個孔中的生長(沒有抗生素的生長)，而mrsa顯示出在沒有和有抗生素(6μg/ml頭孢西丁)存在下的生長。相反，當使用表皮葡萄球菌時，沒有檢測到細菌，這指示msra試驗的特異性。

結(jié)論。該數(shù)據(jù)證實，選擇性生長與使用抗體-包被的磁性顆粒標記和特異性捕獲細菌細胞的組合，可以用于區(qū)分抗生素敏感的細胞和抗生素抗性的細胞。如在以前的實施例中所證實的，本文使用的捕獲和標記方法在本發(fā)明的背景下可以與用于區(qū)分捕獲靶物和游離的信號發(fā)射部分和其它標記的實體的方法相組合。

在低靶細胞濃度，可以在+靶物圖像中辨別單個熒光細胞，并通過軟件直接地計數(shù)。

實施例19.通過低壓凍干促甲狀腺激素(htsh)試劑來穩(wěn)定化單個試劑

本實施例描述了通過低壓凍干來穩(wěn)定化用于檢測人促甲狀腺激素(htsh)的單個試劑。在本實施例中描述的方法普遍適用于在本發(fā)明的其它實施方案中使用的試劑。

試驗試劑的穩(wěn)定化會延長在本發(fā)明中描述的試驗試劑的貯存期限和性能。

干燥試劑的長期儲存對于試劑的用戶而言具有經(jīng)濟價值，且當應(yīng)用于不定期需要試劑、但是其需要突然增加（諸如生物恐怖事件或流行病爆發(fā)）的情況時，是特別重要的。

低壓凍干的試劑也可以用于生產(chǎn)單元化的（unitized）試劑，諸如一次性使用的藥筒。

所述的方法可以與生產(chǎn)的試劑一起用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法。在一個實驗中，如下進行htsh試驗組分(熒光的/磁性顆粒和染色的-墊子)的單個低壓凍干。將dura-stop冷凍干燥器預(yù)冷卻至-45℃。在黑壁384-孔微孔滴定板(costar,目錄號3544)的特定孔的底部，低壓凍干染料-墊子試劑10μl(如實施例7所述制備，進行下述修改:在試劑中包含5%w/v海藻糖(sigma-aldrich目錄號t9449))。加入后，在dura-stop冷凍干燥器中，在-45℃、在大氣壓下冷凍平板1小時，并施加真空。將平板低壓凍干16小時；使冷凍干燥器達到-5℃4小時，然后在25℃1小時。釋放壓力，并取出平板，用pcr平板膜密封，在室溫在干燥器中儲存?zhèn)溆?。如下進行htsh顆粒試劑的低壓凍干。制備5μl160mmepps(sigma-aldrich目錄號e9502)緩沖液ph7.6（其含有320mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)）、5%w/v海藻糖(sigma-aldrich目錄號t9449)、抗-htsh抗體包被的熒光顆粒的0.003%w/v稀釋物、和抗-htsh抗體包被的磁性顆粒(如實施例6所述制備顆粒試劑)的0.08%w/v稀釋物的混合物的低壓凍干球，這通過將5μl混合物滴準確地泵入裝有液氮的絕緣燒杯中來實現(xiàn)。然后立即將冷凍的球放入預(yù)冷卻至-45℃的dura-stop冷凍干燥器中。立即施加真空，將球低壓凍干16小時，使冷凍干燥器達到-5℃4小時，然后在25℃1小時，在室溫在干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

通過對比使用新鮮的液體試劑和低壓凍干的試劑的htsh試驗，測定低壓凍干的試劑的性能。通過將重組htsh(cellsciences,目錄號crt505b)加入pbs-tbp中，制備2個不同的靶物(htsh)溶液(62.5和250pg/ml)。將熒光的且磁性的抗-htsh抗體包被的顆粒的低壓凍干球(如上生產(chǎn))放在裝有低壓凍干的染料-墊子試劑的特定孔的上面(圖35顯示了試驗示意圖)。在一個單獨的384孔黑壁清澈底部微孔滴定板(costar)中，將10μl染料墊子試劑(如實施例7所述，進行下述修改:包含5%w/v海藻糖(sigma-aldrich目錄號t9449))吸量到特定孔中。溫育后，將250pg/mltsh溶液的5μl等分試樣加入5μl160mmepps(sigma-aldrich目錄號e9502)緩沖液（其含有320mm1,3二氨基丙烷(sigma-aldrich目錄號d230807)）、5%w/v海藻糖(sigma-aldrich目錄號t9449)、抗-htsh熒光顆粒的0.003%w/v稀釋物、和抗-htsh磁性顆粒的0.08%w/v稀釋物的混合物中，并在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)的特定孔中溫育10min。溫育后，將7.5μl該混合物鋪在液體染料-墊子孔的上面。在溫育液體試劑的過程中，將20μl62.5pg/mlhtsh溶液小心地吸量到低壓凍干的試劑的特定孔的上面。然后通過將平板放在磁棒上5min，對平板施加磁力。然后將平板放入高流通量分析自動化分析儀中。然后在分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。

結(jié)果。圖36(上圖)顯示的條形圖指示了與液體試劑孔(液體試劑被指定為100%回收率)相比，低壓凍干的試劑孔中的htsh的回收率。圖36(下圖)顯示了當使用液體試劑和低壓凍干的試劑進行測定時，代表性的孔的未放大的圖像。使用低壓凍干的試劑對htsh的回收率類似于液體試劑（具有測定實驗誤差），這指示類似的性能。

結(jié)論：數(shù)據(jù)證實，低壓凍干的試劑可以用于測定htsh，且表現(xiàn)得象液體試劑一樣好。使用低壓凍干的試劑可以實踐本發(fā)明，所述試劑延長了本發(fā)明的有用性。

實施例20.單個試劑的穩(wěn)定化——一起低壓凍干用于檢測層中金黃色葡萄球菌的試劑

本實施例描述了通過一起低壓凍干來穩(wěn)定化用于檢測層中金黃色葡萄球菌的試劑。在本實施例中描述的方法普遍適用于在本發(fā)明的其它實施方案中使用的試劑。

試驗試劑的穩(wěn)定化會延長在本發(fā)明中描述的試驗試劑的貯存期限和性能。

干燥試劑的長期儲存對于試劑的用戶而言具有經(jīng)濟價值，且當應(yīng)用于不定期需要試劑、但是其需要突然增加（諸如生物恐怖事件或流行病爆發(fā)）的情況時，是特別重要的。

低壓凍干的試劑也可以用于生產(chǎn)單元化的（unitized）試劑，諸如一次性使用的藥筒。

所述的方法可以與生產(chǎn)的試劑一起用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法。本實施例證實了通過一起低壓凍干層中的試劑來穩(wěn)定化試劑的另一種方法(圖37)。在本實施例中，在層中低壓凍干用于檢測金黃色葡萄球菌細菌細胞的試劑。將dura-stop冷凍干燥器預(yù)冷卻至-45℃。將染色的-墊子試劑的等分試樣(65μl)(10%v/voptiprep?(sigma-aldrichd1556)，其含有2mg/ml鉻變素r2(sigma-aldrich目錄號c3143)和5%w/v海藻糖(sigma-aldrich,目錄號t9449))吸量到試驗孔中。將平板放入冷凍干燥器中，并將試劑層冷凍1小時。從冷凍干燥器取出試驗孔，將25μl完全試劑混合物小心地覆蓋到冷凍的染料墊子層的上面，所述完全試劑混合物含有1:2000稀釋的sybr?綠1(invitrogen目錄號s-7563)、0.9%氯化鈉、0.005%w/v雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a磁性顆粒(如實施例4所述生產(chǎn))（在tbs-tbpph7.4中）。立即將試驗孔返回冷凍干燥器，并冷凍1小時。施加真空，將孔在-45℃低壓凍干16小時。然后，將溫度設(shè)定在-5℃6小時，隨后在25℃2小時。結(jié)束后，關(guān)掉冷凍干燥器，并釋放真空。取出孔，并覆蓋pcr膜，在干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

通過對比使用新鮮的液體試劑和低壓凍干的試劑進行的金黃色葡萄球菌試驗，測定低壓凍干的試劑的性能。在生長培養(yǎng)基tsb(胰蛋白酶處理過的大豆湯,acumedia目錄號7164a)中在35℃培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。在zeiss顯微鏡上的petroff-hausser計數(shù)室中，計數(shù)金黃色葡萄球菌細胞，并在新鮮的tsb中將細胞稀釋至2x10⁵細胞/ml。在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)中進行反應(yīng)。反應(yīng)混合物(50μl)含有在pbs-tbp中的25μl金黃色葡萄球菌細胞(5,000細胞)(或無細胞作為陰性對照)、20μlsybr?綠1染料(在0.9%氯化鈉中1:2000x稀釋)和懸浮于pbs-tbpph7.4中的5μl雞抗-蛋白a抗體包被的磁性顆粒(2x10¹⁰顆粒/ml)。通過吸量，混合試驗反應(yīng)物，并在暗處在環(huán)境溫度溫育15分鐘。溫育后，將40μl反應(yīng)混合物覆蓋在70μl墊子溶液(由含有5mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)的15%optiprep?(sigma目錄號d1556)組成)上，所述墊子溶液預(yù)先等分在96-孔半面積直徑澄明底黑色平板(grainer,目錄號675096)中。對于干燥試劑試驗，將在120μlpbs-tbp中的金黃色葡萄球菌細胞(5,000細胞)(或無細胞作為陰性對照)加到含有低壓凍干試劑的特定孔的上面，并在暗處在環(huán)境溫度溫育孔15分鐘。為了選擇在孔底部的細胞-顆粒絡(luò)合物，然后通過把它放在磁體上4分鐘，對平板施加磁力。然后從磁體取下平板，并放在高流通量自動化成像分析儀中。然后在上述分析儀上對孔成像，曝光時間為0.1秒。然后使用軟件，計算單個熒光細胞。

結(jié)果。圖38(上圖)顯示的條形圖指示了與液體試劑孔相比，低壓凍干的試劑孔中的金黃色葡萄球菌計數(shù)。圖38(下圖)顯示了當使用低壓凍干的試劑進行測定時，代表性的孔(含有和沒有金黃色葡萄球菌細胞)的未放大的圖像。使用低壓凍干的試劑的金黃色葡萄球菌計數(shù)類似于液體試劑（具有測定實驗誤差），這指示類似的性能。

結(jié)論：結(jié)果證實，在層中一起低壓凍干的試劑可以表現(xiàn)得象液體試劑一樣好。使用低壓凍干的試劑可以實踐本發(fā)明，所述試劑延長了本發(fā)明的有用性。

替代實施方案?？梢哉{(diào)節(jié)低壓凍干條件諸如溫度和時間，且除了上面列出的那些以外，不同的試劑可以經(jīng)歷類似的處理?；蛘撸梢酝ㄟ^蒸發(fā)(實施例19和20)或通過氣態(tài)沉積，干燥試劑。例如，可以將如上混合的試劑放入處于高溫的烘箱中，或置于室溫或低于室溫，其中允許水分以蒸汽形式脫離（由于相對濕度差）?；蛘撸梢詫⒃噭┓旁诟稍锸抑?，以從試劑去除水分?？梢允褂靡后w和固體的組合。

實施例21.通過成像和選擇的靶物信號發(fā)射部分絡(luò)合物的移動的組合來特異性檢測生物素。

上面的實施例8-17描述了特異性地顯像和測定在低濃度或低靶物數(shù)目的靶物的方法，其中使用信號發(fā)射部分、選擇部分和染料-墊子試劑來減少來自游離的信號發(fā)射絡(luò)合物和結(jié)合到非靶物上的未選擇的信號發(fā)射絡(luò)合物的“背景’信號。

這些方法可以在一個容器中實現(xiàn)，無需洗滌步驟。本實施例描述了在選擇步驟后進一步減少背景的方法。在本實施例中，磁性選擇部分在與成像表面方向平行的方向移動，并連續(xù)成像。只有真實的信號發(fā)射部分-靶物-選擇部分絡(luò)合物會隨著選擇力的位置的改變而移動。通過使用以更長曝光采集的圖像或通過圖像序列，可以將真實的信號發(fā)射部分-靶物-選擇部分絡(luò)合物的移動視作劃線或“彗星”。在成像區(qū)中的游離的信號發(fā)射部分和未選擇的非靶物信號發(fā)射部分靶物絡(luò)合物會隨機移動，或根本不移動。只有表現(xiàn)出對移動的正確響應(yīng)的那些對象被圖像分析軟件計數(shù)為真實的信號對象。

所述的方法可以與生產(chǎn)的試劑一起用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法:使用在實施例4中所述的方法，進行下述修改，生產(chǎn)抗生蛋白鏈菌素磁性顆粒：綴合抗生蛋白鏈菌素(thermopierce目錄號21122)來替代抗體，并使用羧基化的400nm磁性顆粒(merckemd,目錄號m1030/40/7283)。在pbs-tbp溶液ph7.4中，以與抗生蛋白鏈菌素磁性顆粒的數(shù)倍比例，混合熒光生物素包被的(1μm)顆粒，并溫育15min。用pbs-tbp洗滌絡(luò)合物，并稀釋至400,000fluor絡(luò)合物/ml的終濃度。然后將該溶液與40mg/ml鉻變素2r溶液(sigma-aldrich,目錄號c3143)相混合，并裝載上kova塑料載玻片。在具有綠熒光濾光器的zeiss倒置顯微鏡上，對載玻片成像。釹磁體在載玻片下面移動，并以長曝光記錄圖像。

結(jié)果。在圖39中顯示了選擇的絡(luò)合物移動(即，‘彗星’)的圖像。它證實了選擇的信號發(fā)射-靶物-選擇部分絡(luò)合物的移動和未選擇的背景熒光的不移動。

結(jié)論。圖像證實了所述方法用于區(qū)分選擇的信號發(fā)射-靶物-選擇部分絡(luò)合物與未選擇的背景熒光對象的能力，這增加了測定特異性。本發(fā)明的該實施方案可以提高使用不經(jīng)洗滌的未放大的成像計算靶物的特異性。

替代實施方案。其它實施方案。選擇力的移動可以是在與成像表面平行的二維平面中的超過一個方向。

在其它實施方案中，可以使用不同的信號特征，例如熒光、化學(xué)發(fā)光、光吸收、光散射、磷光、酶反應(yīng)性和拉曼散射。

其它實施方案可以使用不同的信號發(fā)射部分(具有不同的信號發(fā)射特征)，例如，二醋酸熒光素(熒光酯酶底物)、sybr?綠?(熒光dna染色劑)、蘇丹黑(脂質(zhì)染色)、產(chǎn)生不溶產(chǎn)物的酶底物、聚苯乙烯顆粒、含有熒光染料的聚苯乙烯顆粒、膠體金等。

在這些其它實施方案中，其它染料可以用于匹配使用的不同的信號發(fā)射特征和部分。

可以使用不同的種類標記部分，包括、但不限于：抗體(包括不同的免疫球蛋白類型)和其它蛋白(例如凝集素、激素受體等)、寡核苷酸和它們的合成類似物(例如肽核酸、適體等)、寡糖(例如肝素等)、有機聚合物(例如硫酸葡聚糖等)和小分子(例如藥物、非肽激素、生物素、染料等)。

通過在種類內(nèi)選擇特定靶物(例如從血液中選擇htsh，或從鼻樣品選擇金黃色葡萄球菌細胞)，選擇可以是特異性的。通過選擇標記的靶物種類(例如從人血漿選擇脂蛋白)，試驗也可以是特異性的。

所述的方法可以用于選擇靶物，所述靶物可以包括、但不限于：細胞、病毒、細胞器、脂蛋白和分子，包括蛋白、寡核苷酸、脂類、寡糖和小有機和無機分子。

所述方法適用于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，包括全血、血漿、糞便、廢水、奶等。

也可以在選擇之前處理樣品，例如可以用甲醇固定細胞?？梢蕴崛『图兓痙na?？梢葬尫磐ǔ０l(fā)現(xiàn)結(jié)合到血清因子上的激素、蛋白和維生素，和通過其它過程。也可以在標記后選擇樣品，例如可以在選擇之前，用信號發(fā)射部分絡(luò)合物預(yù)標記靶物。

實施例22.使用sybr?綠標記的光漂白和雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a用于特異性檢測金黃色葡萄球菌細菌細胞的應(yīng)用。

在低濃度或數(shù)目的靶物的檢測需要特異性檢測信號發(fā)射部分-靶物-選擇部分絡(luò)合物。本實施例描述了使用sybr?綠的光漂白和雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a標記的金黃色葡萄球菌細菌細胞來增強金黃色葡萄球菌細胞的特異性檢測的方法。

所述方法利用來自熒光顆粒的熒光信號與發(fā)熒光的dna染色到光漂白的信號相比的相對穩(wěn)定性。

在圖40的簡圖中顯示了該方法的概要。使用2種不同的信號發(fā)射部分(它們對光漂白的敏感性存在差異)和磁性選擇部分標記靶物。磁性地選擇絡(luò)合物，并成像。將樣品暴露于光足夠的時間，使信號發(fā)射部分之一被光漂白。采集第二個圖像。儀器軟件然后進行圖像分析，其中僅在被光漂白的信號的像素附近的像素處的信號發(fā)射部分被計數(shù)為信號發(fā)射事件。

所述方法可以與在上述實施例中描述的本發(fā)明的其它實施方案一起用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法。在35℃在tsb生長培養(yǎng)基(胰蛋白酶處理過的大豆湯,acumedia目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)中進行反應(yīng)。反應(yīng)混合物(50μl)含有：25μl在pbs-tbp中的金黃色葡萄球菌細胞(5,000細胞)或僅pbs-tbp(無細胞)、20μl與0.005%w/v雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a熒光顆粒(如實施例3所述)混合的sybr?綠1染料(在鹽水中1:2000x稀釋)、和5μl懸浮于pbs-tbp溶液中的0.005%w/v雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a磁性顆粒(如實施例4所述生產(chǎn))。通過抽吸，將測定反應(yīng)物混合均勻，并在環(huán)境溫度在黑暗中溫育15min。溫育后，將40μl反應(yīng)混合物覆蓋在70μl墊子溶液(由15%optiprep?(sigma目錄號d1556)和5mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)組成，預(yù)等分在96-孔半面積直徑澄明底黑色平板(grainer,目錄號675096)中)上。為了選擇在孔底部處的細胞-顆粒絡(luò)合物，然后通過將它放在磁體上4min，對平板施加磁力。從磁體取下平板，并放入高流通量自動化成像分析儀中。對孔成像，光漂白，并在分析儀上再次成像。以0.1秒曝光時間，采集第一個圖像；輻照平板2次，每次1秒，以光漂白sybr?綠，然后再次成像，曝光時間為0.1秒。圖像分析軟件計算在被光漂白的信號部分附近的信號部分。在本實施例中，這僅包括在sybr?綠標記的金黃色葡萄球菌細胞附近的那些雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a熒光顆粒。

結(jié)論：本實施例證實了通過光漂白與圖像分析的組合，在試驗中檢測特異性的信號。光漂白與不經(jīng)洗滌的靶物的未放大的成像在本發(fā)明中的應(yīng)用，會減少試驗中來自干擾材料的干擾，并生成特異性的結(jié)果。

替代實施方案。本實施例的方法可以應(yīng)用于對光漂白的敏感性存在差異的任意熒光標記對。具體標記可以代表信號發(fā)射部分對中的光漂白抗性的或敏感的部分。

可以使用不同的種類標記部分，包括、但不限于：抗體(包括不同的免疫球蛋白類型)和其它蛋白(例如凝集素、激素受體等)、寡核苷酸和它們的合成類似物(例如肽核酸、適體等)、寡糖(例如肝素等)、有機聚合物(例如硫酸葡聚糖等)和小分子(例如藥物、非肽激素、生物素、染料等)。

實施例23.用sybr?綠標記光漂白用于特異性檢測金黃色葡萄球菌細菌細胞的應(yīng)用。

在低濃度或數(shù)目的靶物的檢測需要特異性檢測信號發(fā)射部分-靶物-選擇部分絡(luò)合物。本實施例描述了使用sybr?綠標記的金黃色葡萄球菌細菌細胞的光漂白來增強真實的信號發(fā)射部分-靶物-選擇部分絡(luò)合物相對于非特異性背景的特異性檢測的方法。

所述方法利用一些標記方法對光漂白的敏感性。通過計數(shù)用未放大的成像顯像的熒光信號發(fā)射部分進行的熒光檢測，可能具有由熒光碎片產(chǎn)生的背景。該方法允許通過使用特定信號的光漂白鑒別非特異性熒光信號，從而檢測熒光碎片。

在圖41的簡圖中顯示了該方法的概要。用信號發(fā)射部分和磁性選擇部分標記靶物。磁性地選擇絡(luò)合物，并成像。將樣品暴露于光足夠的時間，使信號發(fā)射部分被光漂白。采集第二個圖像。儀器軟件然后在第二個圖像中進行圖像分析，所述第二個圖像從第一個圖像中減去。然后將剩余的信號發(fā)射部分(它們被光漂白)計算為特異性的信號。

所述方法可以與在上述實施例中描述的本發(fā)明的其它實施方案一起用于檢測和計算臨床的、工業(yè)的和環(huán)境的樣品中的低濃度的單個細胞和分子靶物。

方法。在32.5℃在tsb生長培養(yǎng)基(胰蛋白酶處理過的大豆湯,acumedia目錄號7164a)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(atcc菌株29213)的培養(yǎng)物2小時，以達到對數(shù)生長期(od600=0.3)。在96孔聚碳酸酯pcr板(fisherscientific,目錄號14230237)中進行反應(yīng)。混合反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物(50μl)含有：25μl在pbs-tbp中的金黃色葡萄球菌細胞(5,000細胞)或僅pbs-tbp(無細胞)、20μlsybr?綠1染料(在鹽水中1:2000x稀釋)。5μl的0.005%w/v雞抗-金黃色葡萄球菌蛋白a磁性顆粒(如實施例4所述生產(chǎn))懸浮于pbs-tbp溶液中。通過抽吸，將測定反應(yīng)物混合均勻，并在環(huán)境溫度在黑暗中溫育15min。溫育后，將40μl反應(yīng)混合物覆蓋在70μl墊子溶液(由15%optiprep?(sigma目錄號d1556)和5mg/ml鉻變素2r(sigma-aldrichc3143)組成，預(yù)等分在96-孔半面積直徑澄明底黑色平板(grainer,目錄號675096)中)上。為了選擇在孔底部處的細胞-顆粒絡(luò)合物，然后通過將它放在磁體上，對平板進行磁性選擇。從磁體取下平板，并放入使用未放大的成像的高流通量自動化成像分析儀中。然后以0.1秒曝光時間對孔成像，通過輻照平板2次、每次1秒，進行光漂白，然后在分析儀上再次成像0.1秒。圖像分析軟件然后從第一個圖像減去第二個圖像。將剩余的信號部分計算為金黃色葡萄球菌細菌細胞。

結(jié)果:圖41中的圖像例證了該方法。第一個圖像是原始圖像，第二個圖像是光漂白以后的圖像，最后的圖像是軟件產(chǎn)生的從圖像1減去圖像2的圖像，并顯示了光漂白的特異性地標記的sybr?綠標記的金黃色葡萄球菌。圖像表明，從數(shù)據(jù)減去了大片熒光碎片。

結(jié)論：本實施例證實了通過光漂白與圖像分析的組合，在試驗中去除非特異性信號。光漂白與不經(jīng)洗滌的靶物的未放大的成像在本發(fā)明中的應(yīng)用，會減少試驗中來自干擾材料的干擾，并生成特異性的結(jié)果。

替代實施方案。本實施例的其它實施方案包括不同的事件次序。在選擇步驟之前，首先光漂白含有試劑的試驗孔，然后進行選擇和未放大的成像。該實施方案可以用于干擾材料可以被光漂白的情況。

實施例24.用于檢測靶物的自動化成像分析儀

概述。本實施例證實了本發(fā)明在自動化分析儀中的自動執(zhí)行(圖43,44)。所述分析儀接受含有成像孔的筒(圖42)，使用磁性選擇將標記的靶物選擇部分的絡(luò)合物沉積到成像孔的檢測表面上。所述分析儀包含用于對單個標記的靶物絡(luò)合物成像的cmos照相機，且具有用于樣品容器運輸、溫育、聚焦、圖像分析和結(jié)果報告的軟件和硬件。所述分析儀具有高達40個樣品/小時的處理量，這可用于高體積臨床實驗室檢驗用途。它也可以用于食物處理和獸醫(yī)檢驗用途。

描述。所述分析儀具有2個隊列，用于接受樣品容器的堆疊(圖43,44)。設(shè)計隊列來接受1-8個樣品容器的堆疊。當將堆疊放在任一個輸入隊列開口時，光電傳感器(omron光電逆反射傳感器e3t-sr21)被觸發(fā)，向控制軟件發(fā)出信號，以活化步進電機(arcusdmax-kdrv-23)，將堆疊移動進分析儀中進行處理。

當堆疊準備好在任一個隊列中處理時，分析儀首先處理堆疊中的頂部樣品容器。用安裝在臺架機器人上的光電傳感器(omron光電逆反射傳感器e3t-sr21)找到堆疊的頂部(圖44)。所述機器人用傳感器掃描每個隊列，以最大堆疊高度開始，并向下移動，直到樣品容器觸發(fā)傳感器。找到后，臺架機器人取下頂部樣品容器。

樣品容器在系統(tǒng)中的移動，由3個動力系統(tǒng)完成(圖43,44)。這些系統(tǒng)稱作輸入系統(tǒng)、主臺架系統(tǒng)和圖像儀臺架系統(tǒng)。每個系統(tǒng)在下面詳述。所述系統(tǒng)能夠獨立操作，特定操作偶爾需要同步化。

輸入系統(tǒng)由由上述的步進電機(arcusdmax-kdrv-23)提供動力的單個傳送帶(圖43,44)組成。該帶將樣品容器從起始進入點移動到為臺架機器人撿取指定的位置。當前一個樣品容器已經(jīng)在撿取位置時，所述帶移動新樣品容器，直到它接觸在它前面的樣品容器。在該點，所述帶在樣品容器下面滑動，所述樣品容器排成隊列等待撿取位置。

在臺架系統(tǒng)中存在3個步進電機(arcusdmax-kdrv-17)(圖44)。每個電機連接到不同長度的直線臺子(automationsolutions,dl20dw-xz)。最長的臺子控制臺架y(左和右)方向。該臺子錨定在基板上。y臺子平臺連接最短的臺子，后者控制臺架x(前和后)方向。x臺子平臺連接用于控制臺架z(上和下)方向的臺子。z臺子連接一對叉子。這些叉子含有這樣的部件，它們允許對準在樣品容器中模塑的部件(圖42)。z臺子平臺還連接光電傳感器(omron光電逆反射傳感器e3t-sr21)。所述傳感器用于測量堆疊高度，如上所述。

通過調(diào)節(jié)x和z臺子來使用叉子，臺架撿起樣品容器。一旦樣品容器被叉子抓住，x臺子向后移動，以給y臺子留出空間。在該位置，y臺子可以將樣品容器移動到任意位置進行處理，而不沖撞分析儀的結(jié)構(gòu)。

圖像儀臺架系統(tǒng)由2個步進電機(arcusdmax-kdrv-17)組成，它們連接到2個直線臺子(automationsolutions,dl20dw-xz)上。長臺子稱作圖像儀x臺子。該臺子控制圖像儀臺架的前和后運動。圖像儀x臺子連接圖像儀z臺子，后者控制圖像儀臺架的垂直運動。z臺子連接平臺，該平臺在它的表面上具有對準部件，它們與樣品容器上的類似對準部件重合(圖43,44)。

圖像儀z臺子與其它臺子的差別在于，具有細螺距螺絲機構(gòu)。它具有5微米的分辨率，不同于分析儀上的其它臺子的50微米分辨率。該差距允許精細焦距調(diào)節(jié)以及高度的精細控制，以開始反應(yīng)測定。在下面詳細討論這些部件。

主臺架機器人從輸入位置拾起樣品容器后，它被帶到條形碼讀取器(microscanms1)。在樣品容器上的1d條形碼編碼包括批號、實驗類型和實驗參數(shù)在內(nèi)的信息。當讀取時，控制程序?qū)⑿畔Υ嬖跀?shù)據(jù)結(jié)構(gòu)中，用于追蹤樣品容器和保留分析結(jié)果。

在該分析儀中發(fā)生兩類溫育。它們是用于樣品生長的恒溫溫育和用于測定反應(yīng)的環(huán)境溫度溫育。在掃描樣品容器條形碼后，樣品開始進入生長孔。主臺架機器人將樣品容器移動到圖像儀臺架平臺(圖44)。臺架將樣品容器放在平臺上以后，圖像儀臺架升高成像平臺，直到樣品容器上的柱塞帽(圖42)被圖像儀z臺子頂部的部件壓迫。通過下壓柱塞，液體樣品被迫從樣品輸入儲存器移動到生長室（生長試劑在這里被低壓凍干）。接著，樣品容器被主臺架機器人放入裝載的恒溫培養(yǎng)箱(圖43,44)。樣品容器被在35℃溫育4小時，以允許細菌細胞生長。

所述培養(yǎng)箱具有由機器制造部件構(gòu)成的架子(上側(cè)、下側(cè)、前側(cè)、后側(cè)、左側(cè)、右側(cè))。架子底含有這樣的部件，其與樣品容器底上的部件配合(圖43,44)。使用絕緣泡沫構(gòu)建培養(yǎng)箱壁，所述絕緣泡沫將培養(yǎng)箱分成4個室。培養(yǎng)箱的后壁的形狀適合在4個室前面的4個機器制造的門。使用致動器(firgellil12-50-100-12-i)，打開和關(guān)閉門。培養(yǎng)箱的加熱使用加熱條(omega,srfg-310/10-p)，它們從培養(yǎng)箱頂部和底部穿到外面。用絕緣泡沫覆蓋加熱條以及任意暴露的外表面，門除外。

生長溫育結(jié)束后，開始試驗。主臺架機器人從生長培養(yǎng)箱取下樣品容器，并把它移動到圖像儀臺架平臺(圖44)。臺架將樣品容器放在平臺上以后，通過升高平臺，直到樣品容器上的柱塞帽(圖42,44)被圖像儀z臺子頂部的部件完全壓迫，圖像儀臺架開始試驗。通過第二次下壓柱塞，液體樣品被迫從生長室移動進成像室（試驗試劑在這里被低壓凍干）。液體一旦進入成像室，試劑馬上被再水合，并開始測定反應(yīng)。圖像儀臺架返回撿取位置，且主臺架機器人將樣品容器移動到反應(yīng)溫育站。該溫育持續(xù)15分鐘，并在室溫發(fā)生。

所述反應(yīng)培養(yǎng)箱由15個架子的系統(tǒng)組成。單個架子具有這樣的部件，其與在樣品容器底上的部件配合，用于定位對準。

反應(yīng)結(jié)束后，通過磁性選擇選擇靶物。主臺架機器人將樣品容器從架子移動到磁體位置(圖43,44,46)。磁性選擇進行5分鐘，然后主臺架將樣品容器移動到成像平臺。如圖44所示，磁性捕獲站由2個相同的磁體組合裝置組成。所述組合裝置含有稀土固態(tài)型磁體(釹-鐵-硼n48ndfeb,22x22x100mm條)，如圖46所示。這允許2個樣品容器在重疊的時間段發(fā)生磁性選擇。

磁性選擇后，進行成像。成像子系統(tǒng)(圖45)設(shè)計成與熒光信號發(fā)射部分一起工作。通過以475納米波長為中心的帶通濾光器過濾的藍光，激發(fā)信號發(fā)射部分。在通過以約535納米波長為中心的帶通濾光器過濾光以后，收集發(fā)射光。輻照組件、檢測光學(xué)器件和照相機都位于成像組合裝置的樣品容器下面(圖44)。

磁性捕獲結(jié)束后，主臺架機器人將樣品容器從磁體站移動到圖像儀臺架機器人(圖44)。圖像儀臺架機器人將樣品容器移動到遠方傳感器(keyencelk-g37)。測量與每個成像孔的距離，并計算焦距。圖像儀臺架機器人定位到cmos照相機(mightexbcn-b013)上，其獲取每個孔的8位灰度圖像。對每個孔成像10次，并累加，以得到更高位灰度圖像進行分析。

使用裝載的軟件進行圖像分析。分析結(jié)束后，圖像儀臺架機器人將樣品容器移動到彈射系統(tǒng)。所述樣品容器然后離開平臺，并進入生物危害廢物容器(圖43)。分析數(shù)據(jù)后，結(jié)果以及彈筒信息被儲存在計算機上，打印出來(seiko,dpu-30)，并顯示在lcd觸摸屏監(jiān)視器(aei,alcdp7wvgats)上(圖43)。

所述系統(tǒng)設(shè)計成由單個運行ubuntulinux2.6的小板計算機(ampro,rb800r)控制。所有組件直接地或通過控制板連接至計算機。直接連接至計算機的組件包括電機控制器(galil,dmc-2183-dc24-din)、lcd監(jiān)視器(aei,alcdp7wvgats)、cmos照相機(mightex,bcn-b013)、距離傳感器(keyencelk-g37)和打印機(seiko,dpu-30)。通過電機控制器連接的組件包括光電傳感器(omron,e3t-sl22)、主臺架和圖像儀臺架的步進電機(arcus,dmax-kdrv-17)、輸入臺運輸器的步進電機(arcusdmax-kdrv-23),和led(lumileds,lxhl-pb09)。

結(jié)果。圖47顯示了使用實施例16的方法和本實施例的自動化成像分析儀(圖43,44)，檢測圖42所示的筒中的單個標記的金黃色葡萄球菌細胞。

結(jié)論。該分析儀可以自動處理樣品樣品容器，具有最少的用戶相互作用。所述樣品容器與分析儀相互作用，其支持根據(jù)需要處理，樣品生長、未放大的成像和集成的廢物處理。所述分析儀允許使用cmos照相機不經(jīng)放大地檢測已經(jīng)結(jié)合到信號發(fā)射和選擇部分上的單個靶物。