本實(shí)用新型涉及避免準(zhǔn)確性受測(cè)試過程中濕氣影響的測(cè)試卡，屬于免疫層析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

免疫層析是80年代初開始興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗原或抗體先固定于硝酸纖維素膜(NC膜)的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端加入樣品(如尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗體或抗原即與該抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。常用的免疫層析技術(shù)使特定區(qū)帶顯色或帶有熒光，再通過顏色深淺或熒光強(qiáng)弱判斷待測(cè)樣品濃度。免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、快速、結(jié)果判讀容易(肉眼觀測(cè)或簡單儀器測(cè)量)，越來越廣泛地應(yīng)用于臨場(chǎng)快檢或即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)領(lǐng)域。

目前大部分免疫層析產(chǎn)品主要基于膠體金技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)，其主要制備工藝是先在硝酸纖維素膜膜上制作檢測(cè)帶(T帶)和質(zhì)控帶(C帶)，再用顯色或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記可以與待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的單抗，并固定于單抗墊上，然后與樣品墊、吸水紙組裝成試條，最后將試條放入卡盒進(jìn)行組裝，形成測(cè)試卡。上述測(cè)試卡在使用時(shí)環(huán)境濕度有較嚴(yán)格的要求，一般使用濕度為20％～60％，盡管部分測(cè)試卡可以在相對(duì)濕度<80％的環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)，但這類測(cè)試卡在原材料選擇上相對(duì)比較嚴(yán)格，需要挑選濕度穩(wěn)定性、一致性好的NC膜，不具備普遍性，且對(duì)于特殊高濕環(huán)境(例如島礁、熱帶雨林或其他高濕度封閉環(huán)境)適應(yīng)性差。本領(lǐng)域技術(shù)人員長期想獲得適用于寬范圍及特殊高濕環(huán)境的測(cè)試卡，但目前國內(nèi)外還未出現(xiàn)這種明顯具有市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)的測(cè)試卡。

另一方面，在檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的選擇上，人們也提出了更多需求。隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快，工作壓力的增大，個(gè)人健康相關(guān)的POCT監(jiān)測(cè)越來越受到重視。其中對(duì)高壓力人群以及特殊工作環(huán)境下人群情緒的監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)新興的關(guān)注重點(diǎn)，相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)為硝基酪氨酸。

硝基酪氨酸指標(biāo)與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。機(jī)體在受到有害刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)上酪氨酸的硝基化，生成3-硝基酪氨酸。在生理pH條件下，蛋白質(zhì)上的硝基酪氨酸會(huì)引起周圍化學(xué)環(huán)境改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等，最終導(dǎo)致病理損傷。另有研究表明，II型糖尿病患者胰島分泌胰島素功能與硝基酪氨酸水平關(guān)系密切。蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化不僅會(huì)引起胰島β細(xì)胞損傷，還能引起胰島素空間結(jié)構(gòu)變化而影響其功能。同時(shí)，硝基酪氨酸也可以為評(píng)價(jià)特殊環(huán)境工作者機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)提供客觀依據(jù)。由此可見，對(duì)硝基酪氨酸的檢測(cè)具有重要意義。

目前針對(duì)硝基酪氨酸的檢測(cè)產(chǎn)品種類有限，方法主要基于ELISA試劑盒，由于其原理所限，存在如下明顯不足：

(1)檢測(cè)時(shí)間長，檢測(cè)過程包括包板、孵育、洗滌、顯色等一系列過程，全過程所需時(shí)間要數(shù)小時(shí)，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及快速檢測(cè)的要求。

(2)所需配套儀器繁瑣，檢測(cè)過程中需要恒溫設(shè)備、酶標(biāo)板清洗設(shè)備以及熒光讀取設(shè)備以及相關(guān)配套耗材，如酶標(biāo)板、八連排樣品管等，整體設(shè)備和耗材消耗量較大。

現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)上述缺點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)，嘗試用免疫層析平臺(tái)檢驗(yàn)硝基酪氨酸。如CN104198699A公開了一種基于上轉(zhuǎn)換熒光材料的硝基酪氨酸定量試紙條，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)硝基酪氨酸的定量快速檢測(cè)，但是上述上轉(zhuǎn)換熒光顆粒對(duì)于檢測(cè)設(shè)備要求相對(duì)較高，需要配套的遠(yuǎn)紅外激發(fā)光源，試條的適用性較窄，且該案公布的試條在使用時(shí)同樣對(duì)環(huán)境濕度有較嚴(yán)格的要求，在一些特殊環(huán)境(如高濕度)下適應(yīng)性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本實(shí)用新型的主要目的在于提供避免準(zhǔn)確性受測(cè)試過程中濕氣影響的測(cè)試卡。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型提供避免準(zhǔn)確性受測(cè)試過程中濕氣影響的測(cè)試卡，所述測(cè)試卡包括試條及卡盒，所述卡盒設(shè)置檢查窗口，其中：在所述的檢測(cè)窗口上方覆蓋有用于隔絕環(huán)境濕氣的防潮薄層；所述防潮薄層為不透光材料薄層或透光材料薄層。

本實(shí)用新型未從本領(lǐng)域技術(shù)人員易想到的從試條材料的選擇等角度出發(fā)來解決測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性易受測(cè)試過程中環(huán)境的影響的技術(shù)問題，而是另辟途徑，采用簡單的在檢測(cè)窗口上方覆蓋防潮薄層的技術(shù)手段，有效避免了測(cè)試卡測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性受測(cè)試過程中濕氣的影響。本實(shí)用新型所述的測(cè)試卡，試條位于卡盒內(nèi)部，與環(huán)境只通過進(jìn)樣口連通，形成相對(duì)封閉的體系。本實(shí)用新型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所述測(cè)試卡可應(yīng)用于濕度高達(dá)90％的高濕環(huán)境中，與不在所述的檢測(cè)窗口上方覆蓋有用于隔絕環(huán)境濕氣的防水薄層的測(cè)試卡相比，定量測(cè)試偏差大大減小，可應(yīng)用特殊的高濕度環(huán)境，例如島礁、熱帶雨林、或其他高濕度封閉環(huán)境。當(dāng)所述防水薄層為不透光材料時(shí)，移去所述防水薄層進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)所述防水薄層為透光材料時(shí)，帶有所述防水薄層直接進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，所述不透光材料薄層包括防水織物薄層、防水膠帶薄層、塑料片薄層或金屬片薄層。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，所述透光材料薄層包括透明塑料片薄層或防水光學(xué)薄膜。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，優(yōu)選地，所述防潮薄膜為防水光學(xué)薄膜。所述防水光學(xué)薄膜非常薄，透光性好，使檢測(cè)時(shí)激發(fā)光和發(fā)射光因折射或吸收產(chǎn)生的損失較??；此外，光學(xué)膜有一定柔性，與卡盒貼合緊密，密封性好。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，所述不透光材料薄層或所述透光材料薄層一面為帶膠面，帶膠面直接粘黏在所述檢測(cè)窗口上方。采用帶膠材料的薄層可直接將其粘貼在卡盒上即可，操作簡單，而無膠材料需要采取其他方式與卡盒連接。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，所述不透光材料薄層或所述透光材料薄層的厚度為0.1mm～4mm。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，所述測(cè)試卡的寬度為3～5cm。

根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式，所述不透光材料薄層或透光材料薄層的形狀為矩形(長方形)、圓形、橢圓形、菱形或三角形。優(yōu)選地，所述不透光材料薄層或透光材料薄層為矩形。更優(yōu)選地，所述矩形的長×寬為1mm×1mm～50mm×50mm。

本實(shí)用新型所述測(cè)試卡可采用現(xiàn)有技術(shù)中的試條，通常地，按照被檢樣品流動(dòng)的方向自上游至下游依次包括樣品墊、單抗墊、硝酸纖維膜及吸水墊。

本實(shí)用新型中所使用的材料均為現(xiàn)有材料，其可通過商購或按已知方法獲得。

本實(shí)用新型可按如下方法制作及應(yīng)用前述測(cè)試卡：以顯色或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記單抗，再將所得標(biāo)記單抗噴涂于單抗墊上，然后與帶有檢測(cè)帶(T帶)和質(zhì)控帶(C帶)的硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊、吸水墊一起組裝成試條并剪切；最后在卡盒的檢測(cè)窗口區(qū)域上覆蓋防水薄層，再將剪切好的試條裝入卡盒進(jìn)行組裝，得到測(cè)試卡。測(cè)試卡使用時(shí)先帶薄層一起加樣、層析，檢測(cè)時(shí)可以揭掉薄層后進(jìn)行檢測(cè)，或帶薄層一起測(cè)試。

本實(shí)用新型所述測(cè)試卡可適用于硝基酪氨酸指標(biāo)的檢測(cè)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉該測(cè)試卡亦可適用于其他指標(biāo)的檢測(cè)。

綜上可知，本實(shí)用新型提供的測(cè)試卡可以用于基于免疫層析的定性和定量檢測(cè)，通過在測(cè)試卡卡盒的檢測(cè)窗口區(qū)域加防水的薄層結(jié)構(gòu)，可以避免測(cè)試卡受環(huán)境濕度影響，提高了測(cè)試卡檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性，同時(shí)擴(kuò)大了測(cè)試卡對(duì)于環(huán)境的適用范圍，特別適合高濕度環(huán)境下的測(cè)量。同時(shí)本實(shí)用新型所公開的方法制作簡便，易于操作，有利于推廣。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1、2測(cè)試卡示意圖，其中上圖為俯視圖，下圖為側(cè)面圖；

圖2為實(shí)施例1、2試條結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中標(biāo)號(hào)具有如下意義：

1：卡盒；2：檢測(cè)窗口；3：防潮薄層；4：進(jìn)樣口；5：吸水墊；6：NC膜；7：C線；8：T線；9：熒光單抗墊；10：樣品墊。

具體實(shí)施方式

為了對(duì)本實(shí)用新型的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本實(shí)用新型的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說明本實(shí)用新型而不用于限制本實(shí)用新型的范圍。實(shí)施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照儀器制造商所建議的條件。

實(shí)施例1

1)測(cè)試卡的制備

取1mg/ml硝基酪氨酸抗原的PBS溶液及1mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通過劃線儀在NC膜上制作T線和C線，劃線量均為50μl/300mm。劃線后NC膜置于37℃烘箱中干燥過夜。

取硝基酪氨酸單抗的PBS溶液30μl，及熒光微球溶液50μl，混合均勻后加入NHS/EDC混合液，NHS終濃度為5mM，EDC終濃度為20mM，熒光微球與單抗摩爾比為1:100，室溫反應(yīng)1小時(shí)后10000rpm離心15分鐘×3次，沉淀用PBS溶液復(fù)溶至單抗?jié)舛葹?.5mg/ml。將所得熒光標(biāo)記單抗通過噴金儀在單抗墊上噴涂，噴液量為100μl/300mm。噴液后將單抗墊置于干燥柜中干燥4小時(shí)。

取出上述NC膜、單抗墊加吸水墊和樣品墊組裝成試條，通過切條機(jī)制作成寬度為4mm的試條，加干燥劑分裝待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的檢測(cè)窗口部分人工粘貼，再將上述剪切好的試條放入卡盒進(jìn)行組裝，得到測(cè)試用的測(cè)試卡。

所得測(cè)試卡的示意圖如圖1所示，其中上圖為俯視圖，下圖為側(cè)面圖；從圖1中可以看出，所述測(cè)試卡包括試條及卡盒1，所述卡盒設(shè)置檢測(cè)窗口2，在所述的檢測(cè)窗口2上方覆蓋有用于隔絕環(huán)境濕氣的防潮薄層3；本實(shí)施例防潮薄層為透明膠帶薄層，厚度為0.1～0.3mm，形狀為長方形，該形狀的大小為13mm×40mm，卡盒上還設(shè)有進(jìn)樣口4。所得試條的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，從圖2中可以看出，按樣品流動(dòng)的方向，自上游至下游依次包括樣品墊10、熒光單抗墊9、NC膜6、吸水墊5，NC膜上設(shè)有C線7及T線8。

2)測(cè)試卡的檢測(cè)

取分別含有硝基酪氨酸500、1000、2000ng/ml的質(zhì)控液(人工尿液)，從卡盒的加樣口加入，每張測(cè)試卡滴加75μl，靜置9分鐘后揭掉檢測(cè)窗口上的透明膠帶，用檢測(cè)儀器分別檢測(cè)T線和C線熒光強(qiáng)度。每個(gè)濃度測(cè)試3張?jiān)嚄l，統(tǒng)計(jì)(|T|+|C|)/|T|值的平均值，對(duì)質(zhì)控液濃度作圖并線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回推出每個(gè)質(zhì)控液的回推濃度，并計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。分別在相對(duì)濕度50％、60％、70％、80％和90％的環(huán)境下重復(fù)上述過程，均以50％相對(duì)濕度下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回推其他濕度下的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比濕度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

同時(shí)準(zhǔn)備無薄層結(jié)構(gòu)的卡盒對(duì)同一批剪切好的試條進(jìn)行組裝和測(cè)試，測(cè)試過程同上所述，對(duì)比有無薄層的差異。

3)測(cè)試結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如表1所示：

表1不同濕度下有無防水薄層的測(cè)試卡(|T|+|C|)/|T|及與50％相對(duì)濕度下的偏差

由表1可見，以50％相對(duì)濕度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線回推，有透明膠帶的試條在不同濕度下的回推濃度偏差不超過13％；而無透明膠帶的試條在不同濕度下的回推濃度偏差接近40％，且濕度越大，回推濃度越低。上述結(jié)果說明在卡盒檢測(cè)窗口上覆蓋防水薄層后，可以有效隔絕試條與環(huán)境中的水汽，(刪除對(duì)原因的解釋)，使測(cè)試卡在高濕度環(huán)境下保持檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

實(shí)施例2

1)測(cè)試卡的制備

取0.1mg/ml硝基酪氨酸抗原的PBS溶液及0.1mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通過劃線儀在NC膜上制作T線和C線，劃線量均為50μl/300mm。劃線后NC膜置于37℃烘箱中干燥過夜。

取硝基酪氨酸單抗的PBS溶液30μl，及熒光微球溶液50μl，混合均勻后加入NHS/EDC混合液，NHS終濃度為5mM，EDC終濃度為20mM，熒光微球與單抗摩爾比為1:1，室溫反應(yīng)1小時(shí)后10000rpm離心15分鐘×3次，沉淀用PBS溶液復(fù)溶至單抗?jié)舛葹?mg/ml。將所得熒光標(biāo)記單抗通過噴金儀在單抗墊上噴涂，噴液量為100μl/300mm。噴液后將單抗墊置于干燥柜中干燥4小時(shí)。

取出上述NC膜、單抗墊加吸水墊和樣品墊組裝成試條，通過切條機(jī)制作成寬度為4mm的試條，加干燥劑分裝待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的檢測(cè)窗口部分人工粘貼帶有壓敏膠的光學(xué)薄膜，再將上述剪切好的試條放入卡盒進(jìn)行組裝，得到測(cè)試用的測(cè)試卡。所得測(cè)試卡的防潮薄層為帶有壓敏膠的光學(xué)薄膜，厚度為0.1～0.3mm，形狀為長方形，該形狀的大小為13mm×40mm，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1及圖2所示。

2)測(cè)試卡的檢測(cè)

取分別含有硝基酪氨酸500、1000、2000ng/mL的質(zhì)控液(人工尿液)，從卡盒的加樣口加入，每張測(cè)試卡滴加75μL，靜置9分鐘后不揭掉檢測(cè)窗口上的光學(xué)膜，用檢測(cè)儀器分別檢測(cè)T線和C線熒光強(qiáng)度。每個(gè)濃度測(cè)試3張?jiān)嚄l，統(tǒng)計(jì)(T+C)/T值的平均值，對(duì)質(zhì)控液濃度作圖并線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回推出每個(gè)質(zhì)控液的回推濃度，并計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。分別在相對(duì)濕度20％、40％、60％和80％環(huán)境下重復(fù)上述過程，均以20％相對(duì)濕度下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回推其他濕度下的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比濕度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

3)測(cè)試結(jié)果

測(cè)試結(jié)果如表2所示，其為以20％相對(duì)濕度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線回推，帶有光學(xué)薄膜的試條在不同濕度下的回推濃度偏差<15％。

表2不同濕度下有光學(xué)膜的測(cè)試卡檢測(cè)結(jié)果

最后說明的是：以上實(shí)施例僅用于說明本實(shí)用新型的實(shí)施過程和特點(diǎn)，而非限制本實(shí)用新型的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本實(shí)用新型的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍當(dāng)中。