本實(shí)用新型涉及一種絨毛膜促性腺激素β亞單位微流控盤(pán)片，屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，能夠在很短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中人絨毛膜促性腺激素β亞單位的定量檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，低成本的特點(diǎn)。

背景技術(shù)：

人絨毛膜促性腺素(Human Chorionic Gonadotropin，hCG)是由胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成和分泌的糖蛋白激素，由α、β兩個(gè)不同亞單位組成，α亞單位與垂體分泌的FSH（促卵泡激素）、LH（促黃體生成素）和TSH（促甲狀腺激素）等的α亞單位結(jié)構(gòu)相似，相互間能發(fā)生交叉反應(yīng)。β亞單位與LH的β亞單位不同，特異性更強(qiáng)，成為檢測(cè)中的首選靶點(diǎn)，總β-hCG可以在很大程度上替代總hCG的指示作用。hCG具有FSH和LH的功能，可以維持月經(jīng)黃體的壽命，使月經(jīng)黃體增大成為妊娠黃體；可以促進(jìn)雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，同時(shí)刺激孕酮形成；可吸附于滋養(yǎng)細(xì)胞表面，抑制植物凝集素對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激作用，以免胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞被母體淋巴細(xì)胞攻擊；具有類(lèi)LH功能，在胎兒垂體分泌LH以前，刺激胎兒睪丸分泌睪酮促進(jìn)男性性分化；還可促進(jìn)性腺發(fā)育，對(duì)男性能刺激睪丸中間質(zhì)細(xì)胞的活力，增加雄性激素（睪酮）的分泌；能與母體甲狀腺細(xì)胞TSH受體結(jié)合，刺激甲狀腺活性。hCG 的檢查對(duì)早期妊娠診斷有重要意義，對(duì)異常妊娠診斷、滋養(yǎng)層腫瘤患者（卵巢和卵巢外絨毛癌）的診斷和跟蹤、非滋養(yǎng)層腫瘤患者（卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、胃腸癌和睪丸癌）的診斷和跟蹤以及21三體綜合征的篩查等有一定價(jià)值。成熟女性因受精的卵子移動(dòng)到子宮腔內(nèi)著床后，形成胚胎，在發(fā)育成長(zhǎng)為胎兒過(guò)程中，胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生大量的hCG，可通過(guò)孕婦血液循環(huán)而排泄到尿中。當(dāng)妊娠1～2.5周時(shí)，血清和尿中的hCG水平即可迅速升高，第8周孕期達(dá)到高峰，至孕期第4個(gè)月始降至中等水平，并一直維持到妊娠末期。血hCG檢查是目前最早最準(zhǔn)確測(cè)試是否懷孕的檢查方式，一般是在性生活后8-10天可以通過(guò)抽血檢查hCG來(lái)明確是否有懷孕。

目前，檢測(cè) β-hCG 的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法 (ELISA) 和化學(xué)發(fā)光免疫分析法 (CLIA)。 酶聯(lián)免疫分析法由于方法間差異較大，導(dǎo)致結(jié)果不均一，且線性范圍較窄，操作復(fù)雜，不適于做單人份或少量標(biāo)本的檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)80年代，是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性，方法簡(jiǎn)便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無(wú)放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，目前得到了廣泛的應(yīng)用。

磁微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下可定向運(yùn)動(dòng)，使某些特殊成分得以分離、濃集或純化。

微流控盤(pán)片作為一種新型的分析檢測(cè)平臺(tái)，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在免疫分析領(lǐng)域已嶄露頭角。

免疫磁珠的生物微流控盤(pán)片是將磁顆粒技術(shù)，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析檢測(cè)方法，目前這種綜合性的檢測(cè)方法的主要難點(diǎn)表現(xiàn)為：1) 液體在芯片內(nèi)部微流動(dòng)的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內(nèi)部設(shè)置多個(gè)微泵和微閥，使得微流控體系變得更加復(fù)雜化；2) 反應(yīng)體系的混合不充分，導(dǎo)致反應(yīng)不充分；3) 集成化程度不高，導(dǎo)致非特異性背景高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型目的在于提供了一種絨毛膜促性腺激素β亞單位微流控盤(pán)片；本實(shí)用新型采用簡(jiǎn)單的方法即可實(shí)現(xiàn)微流控盤(pán)片內(nèi)部微流體的智慧控制，同時(shí)能夠使反應(yīng)液體得以充分混合，保證反應(yīng)體系高效進(jìn)行，可快速實(shí)現(xiàn)樣品中 hCG 濃度的定量檢測(cè)；具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，低成本的特點(diǎn)。

為了達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案是：

一種絨毛膜促性腺激素β亞單位微流控盤(pán)片，包括微流控盤(pán)片，所述的微流控盤(pán)片上安裝有微流檢測(cè)單元，所述的微流檢測(cè)單元包括全血注入槽，所述的全血注入槽通過(guò)全血分離信道與血球儲(chǔ)存槽相連，所述血球儲(chǔ)存槽與血漿傳送流道連通；所述的血漿傳送流道與混合/偵測(cè)槽頂部相連；所述的混合/偵測(cè)槽頂部通過(guò)管路與人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽連通；所述的混合/偵測(cè)槽頂部還通過(guò)管路與清洗液注入槽連通；所述的混合/偵測(cè)槽一側(cè)安裝有內(nèi)含磁鐵的外部磁鐵區(qū)域；所述的混合/偵測(cè)槽底部通過(guò)管路與廢液槽連通，且所述的混合/偵測(cè)槽底部與廢液槽之間的管路上安裝有閥門(mén)；所述的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽頂部通過(guò)管路與堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液注入槽的底部連通；所述的清洗液注入槽頂部通過(guò)管路與發(fā)光底物液注入槽的底部連通。

所述的微流控盤(pán)片上安裝6個(gè)以上且為6的倍數(shù)的微流檢測(cè)單元。

所述的微流控盤(pán)片上優(yōu)選安裝12個(gè)微流檢測(cè)單元。

本實(shí)用新型的有益效果是：本實(shí)用新型采用簡(jiǎn)單的方法即可實(shí)現(xiàn)微流控盤(pán)片內(nèi)部微流體的智慧控制，同時(shí)能夠使反應(yīng)液體得以充分混合，保證反應(yīng)體系高效進(jìn)行，可快速實(shí)現(xiàn)樣品中 hCG 濃度的定量檢測(cè)；具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，低成本的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本實(shí)用新型一種絨毛膜促性腺激素β亞單位微流控盤(pán)片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是圖1中微流控盤(pán)片上單個(gè)微流檢測(cè)單元的放大示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：人絨毛膜促性腺激素β亞單位的定量檢測(cè)

本實(shí)施例的一種絨毛膜促性腺激素β亞單位微流控盤(pán)片，如圖1、2所示，包括微流控盤(pán)片13，所述的微流控盤(pán)片13上安裝有12個(gè)微流檢測(cè)單元，所述的每個(gè)微流檢測(cè)單元包括全血注入槽1，所述的全血注入槽1通過(guò)全血分離信道2與血球儲(chǔ)存槽3相連，所述血球儲(chǔ)存槽3與血漿傳送流道4連通；所述的血漿傳送流道4與混合/偵測(cè)槽7頂部相連；所述的混合/偵測(cè)槽7頂部通過(guò)管路與人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9連通；所述的混合/偵測(cè)槽7頂部還通過(guò)管路與清洗液注入槽10連通；所述的混合/偵測(cè)槽7一側(cè)安裝有內(nèi)含磁鐵的外部磁鐵區(qū)域8；所述的混合/偵測(cè)槽7底部通過(guò)管路與廢液槽6連通，且所述的混合/偵測(cè)槽7底部與廢液槽6之間的管路上安裝有閥門(mén)5；所述的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9頂部通過(guò)管路與堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液注入槽11的底部連通；所述的清洗液注入槽10頂部通過(guò)管路與發(fā)光底物液注入槽12的底部連通。

1. 人絨毛膜促性腺激素β亞單位溶液配制

1）人絨毛膜促性腺激素β亞單位系列校準(zhǔn)品的制備：用胎牛血清將人絨毛膜促性腺激素β亞單位純品（羅氏診斷試劑（上海）有限公司）稀釋為系列校準(zhǔn)品，其校準(zhǔn)品濃度范圍為0～1000IU/L。

2）人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備：

技術(shù)方案一：將2.0μm磁微粒（廣州達(dá)于成貿(mào)易有限公司）加磁場(chǎng)，靜置5min，倒出上清液，用MES緩沖液（2-（N-嗎啉）乙磺酸一水合物，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）清洗3次，并用該緩沖液進(jìn)行懸?。挥萌ルx子水配制EDC溶液（碳二亞胺，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）和Sulfo-NHS溶液（N-羥基硫代琥珀酰亞胺，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司），每mL磁微粒懸浮液中加入1mL濃度為10mg/mL的EDC溶液及Sulfo-NHS溶液，室溫條件下攪拌反應(yīng)1h后，加磁場(chǎng)，靜置5min，倒出上清液；用MES緩沖液懸浮，每mL磁微粒懸浮液中加入1mg人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體，在室溫條件下攪拌反應(yīng)1h后，加磁場(chǎng)，靜置5min，倒出上清液，加Tris-HCl緩沖液清洗3次；用含有品質(zhì)百分濃度為0.5%的牛血清白蛋白和品質(zhì)百分濃度為0.02%Proclin300（防腐劑，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）的PBS緩沖液重懸，得到人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液。

技術(shù)方案二：將人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體置于透析袋中，在PBS緩沖液中過(guò)夜透析；用PBS緩沖液配制BNHS溶液（生物素-N-羥基琥珀亞胺酯，海勵(lì)瑞生物科技有限公司），每mg抗體中加入15μL BNHS溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30min；將標(biāo)記好的抗體置于透析袋中，在PBS緩沖液中過(guò)夜透析。將2.0μm鏈霉親和素磁微粒（廣州達(dá)于成貿(mào)易有限公司）加磁場(chǎng)，靜置5min，倒出上清液，用PBS緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進(jìn)行懸?。坏钩錾锨逡?；每mL磁微粒懸浮液中加入1mg標(biāo)記好的抗體，混合均勻，室溫反應(yīng)20min；用含有5%牛血清白蛋白的Tris-HCl緩沖液清洗3次；用含有0.5%牛血清白蛋白和0.02% Proclin300 的PBS緩沖液重懸，得到人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液。

3）堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液的制備：用PB緩沖液配制Sulfo-SMCC溶液（4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司），每mg堿性磷酸酶中加入0.1mL Sulfo-SMCC溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30min，用PB緩沖液進(jìn)行透析；用PB緩沖液配制2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，每mg抗體中加入0.1mL 2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30min，用PB緩沖液進(jìn)行透析；將上述透析后的堿性磷酸酶和抗體混合均勻，室溫反應(yīng)120min；通過(guò)蛋白純化系統(tǒng)（AKTA purifier100）收集蛋白，加入50%的甘油，得到堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液。

4）堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物液的制備：向Tris-HCl緩沖液中加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD（1，2-二氧環(huán)已烷衍生物，廣州達(dá)于成貿(mào)易有限公司）和發(fā)光增強(qiáng)劑（AP底物增強(qiáng)劑，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）。

5）清洗液的制備：向Tris-HCl緩沖液中加入0.02%的吐溫20和15%的氯化鈉。

2. 絨毛膜促性腺激素β亞單位微流控盤(pán)片及其使用方法：

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取 25 μL 人絨毛膜促性腺激素β亞單位（hCG）系列校準(zhǔn)品(濃度為0 IU/ L、5 IU/ L、25 IU/ L、100 IU/ L、250 IU/ L、500 IU/ L、1000 IU/ L) 加入本實(shí)施例中人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9，將微流控盤(pán)片13置于配套儀器中。每個(gè)樣本分別重復(fù)測(cè)定三次。配套儀器根據(jù) RLU 和 hCG 濃度間的比例關(guān)系，自動(dòng)擬合計(jì)算出 hCG 濃度，取三次測(cè)定平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）將微流控盤(pán)片13放入配套儀器中，開(kāi)啟自動(dòng)加樣裝置，可將全血 120 μL 、人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液 15 μL、堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液 15 μL 分別注入至全血注入槽1、人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9、堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液注入槽11中。

3）以 4,000 RPM (加速度a=2,500 RPM/s) 操控微流控盤(pán)片13旋轉(zhuǎn) 60 秒，能在全血分離信道2分離血漿及血球，并將人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液及堿性磷酸酶標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液傳送至混合/偵測(cè)槽7，人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒溶液可藉外部磁鐵區(qū)域8中的磁鐵的吸引保留于混合/偵測(cè)槽 (可避免被沖刷至廢液槽)。

4）以 1,300 RPM (加速度a=800 RPM/s) 操控微流控盤(pán)片13旋轉(zhuǎn)14秒，可將血漿經(jīng)由血漿傳送流道4傳送至混合/偵測(cè)槽7，血球則被保留于血球儲(chǔ)存槽3。

5）以1,800 RPM (加速度a=3,500 RPM/s) 操控微流控盤(pán)片13旋轉(zhuǎn)20秒，藉由外部磁鐵區(qū)域8中的磁鐵操控，可操縱人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒于混合/偵測(cè)槽7內(nèi)移動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到良好的混合/培育效果。

6）將清洗液70 μL注入至清洗液注入槽10內(nèi)，以4,200 RPM (加速度a=2,600 RPM/s) 操控微流控盤(pán)片13旋轉(zhuǎn) 12 秒，可將清洗液傳送至混合/偵測(cè)槽7，清洗液可置換混合/偵測(cè)槽7內(nèi)的液體，此液體會(huì)被傳送至廢液槽6，人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微?？山逵赏獠看盆F區(qū)域8中的磁鐵的吸引保留于混合/偵測(cè)槽內(nèi)。

7）將發(fā)光底物液 50 μL注入至發(fā)光底物液注入槽12內(nèi)，以1,700 RPM (加速度a=2,000 RPM/s) 操控微流控盤(pán)片13旋轉(zhuǎn)23秒，可將發(fā)光底物傳送至混合/偵測(cè)槽7，發(fā)光底物可置換混合/偵測(cè)槽7內(nèi)的液體，此液體會(huì)被傳送至廢液槽6，人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被的磁微粒可藉由外部磁鐵區(qū)域8中的磁鐵的吸引保留于混合/偵測(cè)槽內(nèi)。最終，已反應(yīng)的液體會(huì)在混合/偵測(cè)槽7進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度 (RLU) 與人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗原濃度間的比例關(guān)系，檢測(cè)系統(tǒng)可自動(dòng)換算，可快速報(bào)告測(cè)試結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)人絨毛膜促性腺激素β亞單位的定量檢測(cè)。

8）結(jié)果表明：采用本實(shí)用新型所述方法通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)，檢測(cè)靈敏度為 0.001 IU/L，檢測(cè)范圍為 0.001～1000 IU/L，批間變異系數(shù)小于 8 %，批內(nèi)變異系數(shù)小于 8 %。

本實(shí)施例采用簡(jiǎn)單的方法即可實(shí)現(xiàn)微流控盤(pán)片內(nèi)部微流體的智慧控制，同時(shí)能夠使反應(yīng)液體得以充分混合，保證反應(yīng)體系高效進(jìn)行，可快速實(shí)現(xiàn)樣品中 hCG 濃度的定量檢測(cè)；具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，低成本的特點(diǎn)。

實(shí)施例2：磁微粒顆粒尺寸篩選

磁性微球的粒徑小，比表面積大，表面含有活性基團(tuán)，故偶聯(lián)容量大，但磁性微球尺寸過(guò)小不利于磁鐵收集，尺寸過(guò)大在盤(pán)片中不利于混合反應(yīng)，故進(jìn)行磁微粒尺寸篩選。

其他的實(shí)驗(yàn)條件參見(jiàn)實(shí)施例1，磁微粒顆粒的尺寸按照以下方案進(jìn)行。

選擇顆粒尺寸分別為 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm、5.0 μm 磁顆粒標(biāo)記降鈣素原單克隆抗體抗體。檢測(cè)時(shí)采用磁性大小經(jīng)過(guò)優(yōu)選的永久磁鐵，固定磁鐵高度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下 ：

磁微粒粒徑尺寸從 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm 依次增強(qiáng)，3.0 μm 干擾加大，5.0 μm 開(kāi)始減小，信號(hào)值最低，綜合各因素 2.0 μm 信號(hào)最強(qiáng)，干擾最小。

結(jié)果分析 ：磁微粒尺寸較小時(shí)，比表面積較大，表面所負(fù)載的生物分子量大，同時(shí)能夠很好地分散在溶液中，但要保證磁性微球充分被收集所需的磁場(chǎng)強(qiáng)度大。在本實(shí)施例中由于磁珠所受的磁場(chǎng)力不能保證其充分被收集，導(dǎo)致部分有效磁珠在清洗過(guò)程中流失，從而導(dǎo)致最終檢測(cè)信號(hào)值不高。當(dāng)磁顆粒粒徑較大時(shí)，比表面積小，表面生物分子的標(biāo)記率相對(duì)較低，相同條件下，磁性粒子所受磁場(chǎng)力大，分散的磁珠能夠得到充分的收集，但其由于極易發(fā)生沉降，導(dǎo)致生物分子間反應(yīng)不充分，從而減弱發(fā)光信號(hào)。綜合考慮，粒徑為 1.0 μm 至 3.0 μm 磁性微球效果較好，因此本實(shí)用新型的實(shí)施例中 2.0 μm 的磁性微球效果最好。