本發(fā)明涉及無標(biāo)記的檢測(cè)細(xì)胞或者活體組織自身氧化應(yīng)激水平的生物熒光物質(zhì)，具體是基于檢測(cè)細(xì)胞或者活體組織的自熒光強(qiáng)度，作為檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

活性氧類是在氧不完全還原的情況下生成的一些化學(xué)物質(zhì)，包括超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫?；钚匝躅惣瓤梢栽诰€粒體氧化磷酸化過程中內(nèi)源性生成，也可以在細(xì)胞對(duì)外源性物質(zhì)、細(xì)胞因子或細(xì)菌侵染等的應(yīng)答反應(yīng)中生成。活性氧類是一把―雙刃劍，一方面越來越多的證據(jù)表明活性氧類作為胞內(nèi)重要的信號(hào)分子發(fā)揮作用，另一方面活性氧類能夠氧化并損壞細(xì)胞大分子 DNA、脂類和蛋白質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞中活性氧類的凈含量超過其抗氧化能力時(shí)，氧化應(yīng)激發(fā)生。由此可見氧化應(yīng)激可能是活性氧類生成增多，或者抗氧化系統(tǒng)減弱，或者兩種情況都出現(xiàn)而造成的。

氧化應(yīng)激與許多不同的病理狀態(tài)有關(guān)，包括心血管疾病、糖尿病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等等，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括腦卒中等。以腦卒中為例，大腦由于耗氧量高、脂肪酸含量高、抗氧化成分濃度低、某些區(qū)域鐵濃度高等原因，對(duì)氧化損傷非常敏感，氧化應(yīng)激在腦卒中的病理生理方面發(fā)揮著非常重要的作用。

目前檢測(cè)氧化應(yīng)激的方法普遍通過對(duì)各個(gè)活性氧分子的含量進(jìn)行染色，都需要染料所以不能實(shí)時(shí)連續(xù)檢測(cè)?；铙w組織上面檢測(cè)更加困難。所以尋找一種無標(biāo)記的檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的生物學(xué)指標(biāo)變得非常重要，而且也具有重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義以及臨床意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以使用細(xì)胞或者活體組織的自熒光，作為無標(biāo)記的氧化應(yīng)激檢測(cè)方法的新型生物標(biāo)志物。從而提出一種可以用于無標(biāo)記的檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的方法。

本發(fā)明以雙氧水刺激細(xì)胞以及活體皮膚后，自熒光顯著增加，以此作為無標(biāo)記檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的生物學(xué)指標(biāo)。 建立新型的檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：

一種無標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞或組織氧化應(yīng)激水平的方法：

(1) 將實(shí)驗(yàn)對(duì)象置于波長(zhǎng)在400-700nm范圍內(nèi)的激光下，以激發(fā)出樣本的自熒光；

(2) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象發(fā)出的波長(zhǎng)在420-800nm范圍內(nèi)的自熒光強(qiáng)度；

(3) 按照所述步驟(2)的方法，將該實(shí)驗(yàn)對(duì)象的自熒光強(qiáng)度與低氧化應(yīng)激以及高氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)對(duì)象的自熒光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比；

(4) 根據(jù)上述對(duì)比結(jié)果，完成無標(biāo)記檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的方法。

進(jìn)一步的，所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括細(xì)胞，動(dòng)物組織或人體組織的任意一種。

進(jìn)一步的，所述實(shí)驗(yàn)方法無需對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行任何標(biāo)記。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的檢測(cè)方法中，激發(fā)光的波長(zhǎng)優(yōu)選為420-680 nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為460-643nm的范圍內(nèi)。

進(jìn)一步的本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所檢測(cè)的自發(fā)熒光的波長(zhǎng)優(yōu)選為440-750nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為450-741nm的范圍內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種無標(biāo)記的檢測(cè)細(xì)胞以及組織氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)方法的應(yīng)用。

本發(fā)明利用細(xì)胞以及組織自熒光強(qiáng)度，作為其氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)。可以極大的降低檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的時(shí)間以及成本。使檢測(cè)者可以實(shí)時(shí)無創(chuàng)無標(biāo)記的檢測(cè)氧化應(yīng)激。

附圖說明

圖1：激發(fā)光488nm激發(fā)細(xì)胞自熒光，接受波長(zhǎng)范圍500-550nm的接受光。自熒光增加圖。

圖2：激發(fā)光488nm激發(fā)小鼠皮膚自熒光，接受波長(zhǎng)范圍500-530nm的接受光。自熒光增加圖。

具體實(shí)施方式

下面將通過具體描述，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“自熒光”，其含義為生物分子在受到適當(dāng)波長(zhǎng)的激發(fā)光照射時(shí)，吸收激發(fā)光的能量進(jìn)入激發(fā)態(tài)，再退出激發(fā)態(tài)從而發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的現(xiàn)象中，所述波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“激發(fā)光”，其含義為能夠激發(fā)生物分子發(fā)生自發(fā)熒光現(xiàn)象的光，其波長(zhǎng)應(yīng)比自發(fā)熒光短

本發(fā)明中使用的術(shù)語“氧化應(yīng)激”，其含義為是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。

發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞以及組織自熒光與氧化應(yīng)激水平之間的關(guān)系。

一、實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)本發(fā)明，使用HaCaT細(xì)胞，培養(yǎng)在37攝氏度，5%的二氧化碳環(huán)境中。使用雙氧水處理細(xì)胞15分鐘后，重新放回普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)。1小時(shí)，3小時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)雙氧水處理過的細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)無標(biāo)記成像。其中激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為440-600 nm。

使用雄性C57小鼠，雙氧水處理30分鐘后，小鼠在動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，條件為22-24℃，12小時(shí)的明/暗循環(huán)，并可自由進(jìn)食取水。6小時(shí)后，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)雙氧水處理過的皮膚進(jìn)行無創(chuàng)無標(biāo)記成像。其中激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為440-600 nm。

圖1：HaCaT細(xì)胞經(jīng)雙氧水處理后，6小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞自熒光的改變。A、B、C、D分別為對(duì)照組，雙氧水濃度分別為0.1mM，0.3mM，0.5mM。

圖1：經(jīng)過雙氧水處理后的HaCaT細(xì)胞，自熒光量隨著雙氧水濃度的增加而顯著增加。

圖2：C57小鼠皮膚組織，經(jīng)雙氧水處理15分鐘后，清洗去。24小時(shí)內(nèi)，皮膚自熒光的改變。

圖2：經(jīng)過雙氧水處理后的C57小鼠皮膚組織，自熒光量隨著雙氧水濃度的增加而顯著增加。

由上實(shí)驗(yàn)可以得出，細(xì)胞或者組織經(jīng)過雙氧水處理后，自熒光會(huì)發(fā)生變化，且該變化與氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)。因此，細(xì)胞和組織自熒光能夠作為無創(chuàng)無標(biāo)記實(shí)時(shí)檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物。

本發(fā)明基于這一發(fā)現(xiàn)，建立一種無標(biāo)記無創(chuàng)實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞或者組織氧化應(yīng)激水平的方法，該方法包括以下步驟：

(1) 將實(shí)驗(yàn)對(duì)象置于波長(zhǎng)在400-700nm范圍內(nèi)的激光下，以激發(fā)出樣本的自熒光。

(2) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象發(fā)出的波長(zhǎng)在420-800nm范圍內(nèi)的自熒光強(qiáng)度；

(3) 按照所述步驟(2)的方法，將該實(shí)驗(yàn)對(duì)象的自熒光強(qiáng)度與低氧化應(yīng)激以及高氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)對(duì)象的自熒光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比；

(4) 根據(jù)上述對(duì)比結(jié)果，完成一種無標(biāo)記檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的方法。

本發(fā)明的利用激發(fā)光激發(fā)細(xì)胞以及組織的自熒光的方式包括使用普通的連續(xù)光輸出進(jìn)行激發(fā)的方式、使用電調(diào)制進(jìn)行調(diào)制激發(fā)的方式或者使用脈沖激光進(jìn)行激發(fā)的方式中的至少一種。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方式和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。