本發(fā)明屬于高通量基因測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，涉及生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)以及自動(dòng)控制學(xué)科，特別涉及一種高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置。

背景技術(shù)：

第一代基因測(cè)序技術(shù)是熒光標(biāo)記的Sanger法。1977年Frederick Sanger發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法是基因測(cè)序領(lǐng)域的成功先例。Sanger法擁有高精度和簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。人類基因組的測(cè)序正是基于該技術(shù)完成的。但是DNA模板的組成或者二級(jí)結(jié)構(gòu)有時(shí)候引起DNA聚合酶不正常終止。第二代基因測(cè)序技術(shù)的核心技術(shù)思想是邊合成邊測(cè)序技術(shù)，即是通過一系列技術(shù)手段捕獲新合成的末端標(biāo)記來確定DNA序列。2005年以后，高通量基因測(cè)序技術(shù)就指的是第二代測(cè)序，也被稱為下一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing)，相對(duì)于第一代測(cè)序技術(shù)，測(cè)序速度大大提升。自從高通量基因測(cè)序技術(shù)問世以來，新興的基因組測(cè)序技術(shù)展現(xiàn)出了無限的活力。

而測(cè)序堿基熒光識(shí)別作為高通量基因測(cè)序的核心環(huán)節(jié)，對(duì)測(cè)序過程中環(huán)境溫度、亮度、潔凈度以及光路結(jié)構(gòu)都有較高要求。高通量基因測(cè)序儀中基因芯片的生存環(huán)境、光路結(jié)構(gòu)性能的優(yōu)劣直接決定了測(cè)序堿基熒光識(shí)別的精度。

現(xiàn)有高通量基因測(cè)序系統(tǒng)多采用激光從反應(yīng)室下的棱鏡穿過到達(dá)基因芯片下表面的激發(fā)方式，易受到周圍環(huán)境的干擾，循環(huán)成像時(shí)位移平臺(tái)的移動(dòng)容易導(dǎo)致激光光束的偏差，造成成像后的部分區(qū)域不發(fā)光或光強(qiáng)微弱，影響后期對(duì)測(cè)序堿基的熒光識(shí)別。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置，將基因芯片放置在相對(duì)密閉無塵的反應(yīng)室中，激光通過光路到達(dá)基因芯片上表面，實(shí)現(xiàn)堿基熒光成像，通過堿基識(shí)別算法，識(shí)別測(cè)序堿基，實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序堿基識(shí)別高精度、穩(wěn)定性好的要求。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置，基因芯片放置于基因測(cè)序儀反應(yīng)室內(nèi)，包括：

位移控制模塊100，通過步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)精密導(dǎo)軌移動(dòng)反應(yīng)室，以控制基因芯片的掃描進(jìn)程；

反應(yīng)室恒溫模塊200，利用溫控系統(tǒng)208控制反應(yīng)室的溫度變化，溫控系統(tǒng)208包括制熱和制冷裝置；

激光觸發(fā)模塊300，包括主要激發(fā)堿基A和堿基C上熒光基團(tuán)的紅色激光器302和主要激發(fā)堿基G和堿基T上熒光基團(tuán)的綠色激光器301，紅綠激光經(jīng)過直角棱鏡401，形成一道激光，打在基因芯片上，結(jié)合有不同dNTP的熒光基團(tuán)在激光的照射下，發(fā)出不同光譜特性的四種熒光；

熒光成像模塊400，利用sCMOS相機(jī)實(shí)現(xiàn)熒光圖像成像，最后將圖像傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行測(cè)序堿基熒光識(shí)別。

所述基因測(cè)序儀反應(yīng)室為相對(duì)密閉帶卡扣的抽屜形式，便于對(duì)流動(dòng)槽206進(jìn)行清洗或更換，包括反應(yīng)室主體203，反應(yīng)室主體203上設(shè)置抽殼件204、X向插片201和Y向插片202，X向插片201和Y向插片202堆疊在反應(yīng)室主體203的上表面，X向插片201和Y向插片202上各開有一條開口，兩條開口相互垂直，以便使物鏡與開口匹配，使得反應(yīng)室處于一個(gè)相對(duì)封閉的狀態(tài)。反應(yīng)室主體203的頂部設(shè)置物鏡固定夾205，反應(yīng)室主體203內(nèi)置載物臺(tái)207、流動(dòng)槽206以及溫控系統(tǒng)208，其中，流動(dòng)槽206設(shè)置在載物臺(tái)207上，反應(yīng)室主體203的側(cè)面分別開有小孔，供硅膠軟管插入，由注射針將軟管里的試劑導(dǎo)入流動(dòng)槽206，溫控單元208放置在載物臺(tái)207正下方，對(duì)溫度進(jìn)行閉環(huán)控制。

所述位移控制模塊100中，利用X-Y導(dǎo)軌裝置帶動(dòng)反應(yīng)室運(yùn)動(dòng)；

所述反應(yīng)室恒溫模塊200中，利用溫度傳感器采集溫度，加熱裝置為位于載物臺(tái)下方的電熱片，制冷裝置為帶散熱風(fēng)扇的半導(dǎo)體制冷片；反應(yīng)室與試劑組和試劑泵連接，其中試劑泵連接電機(jī)，控制器也與電機(jī)連接，控制試劑泵向基因芯片完成注入工作。

所述激光觸發(fā)模塊300中：

綠色激光器301的輸出光依次經(jīng)濾光片一303、準(zhǔn)直透鏡一305、孔徑光闌一307，由反射鏡一309反射到達(dá)半透半反鏡311；

紅色激光器302的輸出光依次經(jīng)濾光片二304、準(zhǔn)直透鏡二306、孔徑光闌二308，由反射鏡二310反射到達(dá)半透半反鏡311；

兩束光再一同被反射鏡三312反射到反射鏡四313，由反射鏡四313將光束反射到透鏡314，再經(jīng)由直角棱鏡401，將光束反射到濾波輪402，經(jīng)由鏡筒403和物鏡404，到達(dá)基因芯片的上表面，激發(fā)攜帶有熒光基團(tuán)的堿基發(fā)光。

所述濾光片一303、半透半反鏡311和濾光片二304均裝在轉(zhuǎn)輪上，掃描過程中，不斷切換轉(zhuǎn)輪，并通過濾波輪402實(shí)現(xiàn)掃描過程中的自動(dòng)切換，形成四種光路。

所述sCMOS相機(jī)作為光電轉(zhuǎn)換器件，通過配備濾光片的鏡頭捕獲基因芯片上某一特定區(qū)域(Δx×Δy)受激后發(fā)出的熒光，所述位移控制模塊帶動(dòng)被掃描芯片運(yùn)動(dòng)，以完整對(duì)整個(gè)基因芯片的掃描過程。

本發(fā)明還提供了基于所述系統(tǒng)裝置的高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別方法，包括如下步驟：

步驟1，在基因芯片中注入四種不同類型的熒光染料，放置于基因測(cè)序儀反應(yīng)室中；

步驟2，調(diào)節(jié)反應(yīng)室恒溫模塊200，使環(huán)境溫度控制在基因生存所需的適宜范圍內(nèi)；

步驟3，控制激光觸發(fā)模塊300產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的平行線型激光束，激發(fā)待測(cè)基因芯片中核苷酸攜帶的熒光染料基團(tuán)發(fā)光；

步驟4，利用位移控制模塊100控制反應(yīng)室移動(dòng)，使激光束以速度可控的方式對(duì)基因芯片進(jìn)行線掃描；

步驟5，利用sCMOS相機(jī)對(duì)視野中基因芯片發(fā)光堿基進(jìn)行成像；

步驟6，將成像圖像傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行測(cè)序堿基熒光識(shí)別。

所述步驟6中，采用半極大值全寬度(FWHM)方法，即熒光強(qiáng)度下降到最大值一半時(shí)對(duì)應(yīng)的寬度，對(duì)熒光區(qū)域進(jìn)行堿基簇的判別。

本發(fā)明與傳統(tǒng)的測(cè)序堿基熒光圖像掃描成像方法相比，綜合了面成像檢測(cè)法低成本、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和共聚焦點(diǎn)掃描法靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，把點(diǎn)激發(fā)變成線激發(fā)，從而把二維掃描變成了一維掃描，提高了成像的速度；而與面成像方法相比，會(huì)聚成線的激發(fā)光光強(qiáng)具有更高的功率，探測(cè)靈敏度有所提高，對(duì)更低熒光強(qiáng)度的圖像成像效果更好。

綜上，本發(fā)明通過對(duì)測(cè)序堿基光路進(jìn)行精密化設(shè)計(jì)，提高了堿基識(shí)別過程的穩(wěn)定性，提高了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外通過控制基因測(cè)序儀進(jìn)行大規(guī)模的掃描成像，因此保證了足夠的測(cè)序通量。

附圖說明

圖1是本發(fā)明高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置的立體結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本發(fā)明基因測(cè)序儀反應(yīng)室的立體結(jié)構(gòu)圖。

圖3是本發(fā)明基因測(cè)序儀反應(yīng)室的截面示意圖。

圖4是本發(fā)明激光觸發(fā)模塊的邏輯結(jié)構(gòu)圖。

圖5是本發(fā)明高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。

圖6是本發(fā)明高通量堿基熒光識(shí)別方法流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式。

如圖1所示，本發(fā)明高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置，由四大功能模塊組成，包括位移控制模塊100、反應(yīng)室恒溫模塊200、激光觸發(fā)模塊300和熒光成像模塊400。本發(fā)明所有圖示中各模塊及儀器之間的連接關(guān)系是為了清楚闡釋其信息交互及控制過程的需要，應(yīng)視為邏輯上的控制關(guān)系，而不應(yīng)限于物理連接或無線連接。各模塊結(jié)構(gòu)或者功能如下：

位移控制模塊100，通過步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)精密導(dǎo)軌移動(dòng)反應(yīng)室，以控制基因芯片的掃描進(jìn)程，具體可基于X-Y導(dǎo)軌裝置來實(shí)現(xiàn)。

反應(yīng)室恒溫模塊200，利用溫度傳感器采集溫度，利用溫控系統(tǒng)208控制反應(yīng)室的溫度變化，溫控系統(tǒng)208包括制熱和制冷裝置。加熱裝置為位于載物臺(tái)下方的電熱片，制冷裝置為帶散熱風(fēng)扇的半導(dǎo)體制冷片；反應(yīng)室與試劑組和試劑泵連接，其中試劑泵連接電機(jī)，控制器也與電機(jī)連接，控制試劑泵向基因芯片完成注入工作。

激光觸發(fā)模塊300，包括主要激發(fā)堿基A和堿基C上熒光基團(tuán)的紅色激光器302和主要激發(fā)堿基G和堿基T上熒光基團(tuán)的綠色激光器301，紅綠激光經(jīng)過直角棱鏡401，形成一道激光，打在基因芯片上，結(jié)合有不同dNTP的熒光基團(tuán)在激光的照射下，發(fā)出不同光譜特性的四種熒光。

熒光成像模塊400，利用sCMOS相機(jī)實(shí)現(xiàn)熒光圖像成像，最后將圖像傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行測(cè)序堿基熒光識(shí)別。sCMOS相機(jī)作為光電轉(zhuǎn)換器件，通過配備濾光片的鏡頭捕獲基因芯片上某一特定區(qū)域(Δx×Δy)受激后發(fā)出的熒光，由位移控制模塊帶動(dòng)被掃描芯片運(yùn)動(dòng)，完整對(duì)整個(gè)基因芯片的掃描過程。

本發(fā)明中，基因芯片放置于圖2和圖3中的反應(yīng)室內(nèi)?；驕y(cè)序儀反應(yīng)室為相對(duì)密閉帶卡扣的抽屜形式，便于對(duì)流動(dòng)槽206進(jìn)行清洗或更換，包括反應(yīng)室主體203，反應(yīng)室主體203上設(shè)置抽殼件204、X向插片201和Y向插片202，X向插片201和Y向插片202堆疊在反應(yīng)室主體203的上表面，X向插片201和Y向插片202上各開有一條開口，兩條開口相互垂直，以便使物鏡與開口匹配，使得反應(yīng)室處于一個(gè)相對(duì)封閉的狀態(tài)。反應(yīng)室主體203的頂部設(shè)置物鏡固定夾205，反應(yīng)室主體203內(nèi)置載物臺(tái)207、流動(dòng)槽206以及溫控系統(tǒng)208，其中，流動(dòng)槽206設(shè)置在載物臺(tái)207上，反應(yīng)室主體203的側(cè)面分別開有小孔，供硅膠軟管插入，由注射針將軟管里的試劑導(dǎo)入流動(dòng)槽206，溫控單元208放置在載物臺(tái)207正下方，對(duì)溫度進(jìn)行閉環(huán)控制。

上述四大功能模塊分別控制基因測(cè)序儀中對(duì)應(yīng)的各個(gè)組件，從而保障基因測(cè)序儀中適宜基因生存的環(huán)境溫度，控制堿基成像，從而實(shí)現(xiàn)堿基熒光識(shí)別。主要包括：控制測(cè)序系統(tǒng)將試劑導(dǎo)入反應(yīng)室內(nèi)的流動(dòng)槽206中，并調(diào)節(jié)反應(yīng)室的溫度；控制掃描過程中位移平臺(tái)的橫向和縱向速度及距離；控制激發(fā)光源的形狀大小以及激發(fā)時(shí)長(zhǎng)間隔；激發(fā)基因芯片中待測(cè)堿基片段樣品中核苷酸攜帶的熒光基團(tuán)發(fā)光；控制相機(jī)捕獲熒光信號(hào)，控制堿基成像過程。

高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別系統(tǒng)裝置由多個(gè)具體組件構(gòu)成，分別與計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)中的各個(gè)功能模塊相對(duì)應(yīng)，接受并執(zhí)行來自各個(gè)功能模塊的指令。這些組件包括：用于將試劑注入反應(yīng)室流動(dòng)槽206的組件，用于調(diào)節(jié)反應(yīng)室溫度的組件，用于調(diào)節(jié)位移平臺(tái)移動(dòng)距離的組件，用于激發(fā)激光的組件，用于堿基圖像成像的組件等。應(yīng)當(dāng)說明的是，不同功能的各個(gè)組件之間不一定完全獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)不同功能的各個(gè)組件也可能會(huì)涉及一個(gè)或多個(gè)相同的部件。在本發(fā)明中，系統(tǒng)裝置的關(guān)鍵在于自動(dòng)地控制并調(diào)節(jié)反應(yīng)室溫度、保障潔凈度及密閉性，為基因芯片的存放提供一個(gè)適宜的環(huán)境，提供了一個(gè)高效可行且穩(wěn)定性強(qiáng)的光路結(jié)構(gòu)，以便后期對(duì)堿基熒光進(jìn)行識(shí)別。

需要說明的是，本發(fā)明不涉及堿基片段樣品的制備，對(duì)象為已制備好的堿基樣品。將已制備好的基因芯片放置于基因測(cè)序儀的反應(yīng)室中固定，反應(yīng)室中配備有溫控系統(tǒng)208及試劑傳輸模塊，用于控制反應(yīng)室內(nèi)溫度以及為基因芯片提供測(cè)序所需的試劑。反應(yīng)室恒溫模塊200中設(shè)置有與控制器相連的溫度傳感器，控制器與反應(yīng)室恒溫模塊200的驅(qū)動(dòng)器連接，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)室內(nèi)溫度的調(diào)節(jié)與控制；試劑傳輸模塊通過注射針和硅膠軟管將基因試劑傳輸?shù)椒磻?yīng)室內(nèi)的流動(dòng)槽206，由控制器控制傳輸時(shí)間及速度。

在傳統(tǒng)高通量基因測(cè)序技術(shù)中，多選擇汞燈、氙燈等作光源，汞燈的壽命與啟動(dòng)次數(shù)和工作時(shí)間有關(guān)，啟動(dòng)次數(shù)愈多，每次工作時(shí)間愈短，壽命愈短；氙燈則需專用的低壓直流電源箱，燈的溫度極高，價(jià)格比汞燈更為昂貴。本發(fā)明中，采用激光器作為激發(fā)光源，其具有亮度高、方向性好、單色性好、相干性好等優(yōu)點(diǎn)。最主要的是，激光器為冷光源，可有效避免加裝隔熱光學(xué)器件。對(duì)堿基進(jìn)行成像過程中，傳統(tǒng)高通量測(cè)序技術(shù)采用面陣相機(jī)進(jìn)行面掃描，逐個(gè)區(qū)域進(jìn)行圖像成像，但該方式具有曝光時(shí)間長(zhǎng)、成像質(zhì)量差等缺點(diǎn)。本發(fā)明采用的是sCMOS相機(jī)，其具有高靈敏度、高分辨率和高讀出速度的特性。sCMOS相機(jī)作為光電轉(zhuǎn)換器件，通過配備相應(yīng)濾光片的鏡頭對(duì)基因芯片上某一特定區(qū)域(Δx×Δy)受激后發(fā)出的熒光進(jìn)行成像。

本發(fā)明中，基因芯片的掃描過程由步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)精密導(dǎo)軌移動(dòng)反應(yīng)室來實(shí)現(xiàn)。位移平臺(tái)帶動(dòng)被掃描基因芯片協(xié)同運(yùn)動(dòng)以完成整個(gè)掃描過程。

本發(fā)明中，激光觸發(fā)模塊300中，紅綠色激光器主要用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的激光光束，照射反應(yīng)室流動(dòng)槽206中的基因芯片，激發(fā)基因芯片中待測(cè)堿基片段樣品中核苷酸攜帶的熒光基團(tuán)發(fā)光，此外，激光觸發(fā)模塊300光路中安裝的光學(xué)元件可調(diào)節(jié)激光的光強(qiáng)分布，使光斑的光強(qiáng)均勻分布，避免產(chǎn)生光強(qiáng)呈高斯分布的光斑，同時(shí)孔徑光闌可調(diào)節(jié)光斑的大小形狀，使輸出平行光強(qiáng)均勻的形狀可控的光源。

具體地，激光觸發(fā)模塊300的一種結(jié)構(gòu)如圖4所示：

綠色激光器301的輸出光依次經(jīng)濾光片一303、準(zhǔn)直透鏡一305、孔徑光闌一307，由反射鏡一309反射到達(dá)半透半反鏡311；

紅色激光器302的輸出光依次經(jīng)濾光片二304、準(zhǔn)直透鏡二306、孔徑光闌二308，由反射鏡二310反射到達(dá)半透半反鏡311；

兩束光再一同被反射鏡三312反射到反射鏡四313，由反射鏡四313將光束反射到透鏡314，再經(jīng)由直角棱鏡401，將光束反射到濾波輪402，經(jīng)由鏡筒403和物鏡404，到達(dá)基因芯片的上表面，激發(fā)攜帶有熒光基團(tuán)的堿基發(fā)光。

上述的濾光片用于篩選特定波長(zhǎng)的光束，其他波長(zhǎng)的光束則被阻斷，通過的光束進(jìn)入準(zhǔn)直透鏡；準(zhǔn)直透鏡使得出射光為平行光，且能量在該方向上集中，匯聚到孔徑光闌；孔徑光闌用于限制入射光光束大小，對(duì)光束進(jìn)行整形優(yōu)化，通過的光束進(jìn)入反射鏡；反射鏡用于將光束進(jìn)行反射使其對(duì)準(zhǔn)半透半反射；半透半反射用于控制特定波段的光束被反射，而其他波段的光束則能通過，反射的光進(jìn)入透鏡；透鏡用于會(huì)聚接收的光束，經(jīng)會(huì)聚的光束進(jìn)入直角棱鏡；直角棱鏡用于高效地在內(nèi)部全反射入射光，使其對(duì)準(zhǔn)sCMOS相機(jī)；sCMOS相機(jī)用于對(duì)接收的光束進(jìn)行成像，并將生成的圖片傳送至計(jì)算機(jī)。

在堿基熒光成像過程中，控制器通過控制基因測(cè)序儀反應(yīng)室的運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因芯片中待測(cè)堿基片段進(jìn)行掃描循環(huán)成像。激光觸發(fā)模塊300控制激光光路在待測(cè)堿基片段樣品上逐次移動(dòng)，同時(shí)確定每次移動(dòng)后反應(yīng)室流動(dòng)槽206中待測(cè)堿基片段樣品的圖像位置信息；激光觸發(fā)模塊300控制激光光源產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光束，激發(fā)待測(cè)堿基樣品中核苷酸攜帶的熒光染料基團(tuán)發(fā)光，并在每次激光掃描過程中確定待測(cè)堿基片段樣品的成像位置，進(jìn)行堿基熒光成像。

具體來說，熒光成像模塊400主要包括聚焦單元、濾波輪單元、直角棱鏡單元以及sCMOS相機(jī)單元。聚焦單元中物鏡404及鏡筒403用于收集基因芯片中堿基熒光基團(tuán)所發(fā)熒光并調(diào)節(jié)焦距，經(jīng)收集后的光束進(jìn)入濾波輪單元；濾波輪402用于篩選通過特定波長(zhǎng)的光束，其他波長(zhǎng)的光束則被阻斷，通過的光束進(jìn)入直角棱鏡單元；直角棱鏡401將光束反射使其對(duì)準(zhǔn)sCMOS相機(jī)單元；sCMOS相機(jī)用于對(duì)接收的光束進(jìn)行成像，并將生成的圖片傳送至計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行后期堿基熒光識(shí)別。

本發(fā)明對(duì)高通量測(cè)序堿基熒光識(shí)別方法與系統(tǒng)裝置的實(shí)現(xiàn)方式如圖5所示。

本發(fā)明中，高通量堿基熒光識(shí)別方法流程如圖6所示。高通量堿基熒光識(shí)別方法中，先進(jìn)行熒光亮點(diǎn)區(qū)域的確定，再確定其相應(yīng)邊界、面積和區(qū)域內(nèi)的最大灰度值。

確定堿基熒光簇的規(guī)則如下：若熒光亮點(diǎn)區(qū)域的半徑大于等于三個(gè)像素，則認(rèn)為該區(qū)域包含一個(gè)堿基簇；若熒光亮點(diǎn)區(qū)域的面積大于2×FWHM×FWHM，而小于16×FWHM×FWHM，且直徑小于8×FWHM，則認(rèn)為該區(qū)域包含多個(gè)堿基簇，在該熒光亮點(diǎn)區(qū)域內(nèi)，通過查找多個(gè)局部灰度極大值，將該區(qū)域分割成多個(gè)更小的、含有單個(gè)堿基簇的區(qū)域；若熒光亮點(diǎn)區(qū)域面積非常大，大于16×FWHM×FWHM，且該亮點(diǎn)區(qū)域內(nèi)只有一個(gè)灰度極大值，則視為干擾源，將該區(qū)域標(biāo)記為污染區(qū)域并舍棄。

對(duì)確定的堿基簇，直接提取亮點(diǎn)區(qū)域內(nèi)灰度值最大的像素的坐標(biāo)作為堿基簇的坐標(biāo)，取亮點(diǎn)區(qū)域內(nèi)最大的灰度值為熒光強(qiáng)度值。

測(cè)量到的四種顏色對(duì)應(yīng)的四種堿基A、C、G、T的信號(hào)強(qiáng)度分別為I_A、I_C、I_G、I_T，構(gòu)成原熒光強(qiáng)度值I_measure，由下列四元一次方程獲得：

其中m_a，a、m_a，c等為四種熒光基團(tuán)的互相影響因子，構(gòu)成交叉影響矩陣M，I_a、I_c、I_g、I_t為構(gòu)成四種堿基A、C、G、T的信號(hào)強(qiáng)度基。

對(duì)原熒光強(qiáng)度值矩陣I_measure進(jìn)行校正，用M做校正得到新的熒光強(qiáng)度值矩陣I′，則I′為：

I′＝I_measure×M^T

對(duì)新的熒光強(qiáng)度值矩陣I′進(jìn)行操作，分別對(duì)四種堿基做如下篩選：

首先，對(duì)每個(gè)堿基簇，只選取熒光強(qiáng)度值最高的堿基，并幾下其熒光強(qiáng)度值，這是對(duì)每種堿基的第一次篩選；

然后，對(duì)每種堿基第一次篩選結(jié)果的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行從小到大排序，以位于總數(shù)90％處的熒光強(qiáng)度值乘以10％，所得結(jié)果作為熒光強(qiáng)度值的下限，低于這個(gè)下限的熒光強(qiáng)度值都去掉，這是對(duì)每種堿基的第二次篩選；

最后，分別把C、G、T三種堿基熒光強(qiáng)度值的累計(jì)分布乘以一個(gè)校正因子，然后與堿基A的熒光強(qiáng)度值分布做單樣本柯爾莫哥洛夫—斯米諾夫檢驗(yàn)。通過最小化單樣本柯爾莫哥洛夫—斯米諾夫檢驗(yàn)的D統(tǒng)計(jì)量，得到相應(yīng)堿基的校正因子r_CA、r_GA、r_TA，從而得到校正因子矩陣f，f為

用f校正M，并使其歸一化。用校正后的交叉影響矩陣計(jì)算四種堿基的熒光強(qiáng)度值，即完成對(duì)高通量堿基熒光識(shí)別的過程。