本發(fā)明涉及大型溞快速檢測水質(zhì)毒性技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于大型蚤急性毒性檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
大型溞屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、枝角類，是常見的浮游甲殼動物，是淡水食物鏈中不可缺少的組成成分。因其生活周期短、生長快、生殖量高、易培養(yǎng)、對水環(huán)境脅迫敏感等特點使其成為國內(nèi)外實驗室廣泛使用的模式生物，在農(nóng)藥、化學(xué)品的急慢性毒性和環(huán)境激素效應(yīng)的測試方面具有重要的作用，且其在水域生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的地位，因此受到眾多國家毒理學(xué)工作者的重視。大型溞是敏感性較強，非常有代表性的一種浮游動物，現(xiàn)已成為一種標(biāo)準(zhǔn)試驗生物，被廣泛用于水生生物毒理學(xué)的研究中。目前，ISO標(biāo)準(zhǔn)、OECD指南、美國EPA標(biāo)準(zhǔn)以及我國國標(biāo)中都有涉及大型溞的生長抑制和繁殖的標(biāo)準(zhǔn)。
大型蚤急性毒性試驗以蚤體的死亡和運動抑制表征急性毒性，大型蚤的急性毒性測定即用大型蚤為試驗生物，測定物質(zhì)或廢水的24或48小時的半數(shù)抑制濃度(24h-EC50或48h-EC50)，或半數(shù)致死濃度(24h-LC50或48h-LC50)，以反映物質(zhì)或廢水的毒性程度。
在水質(zhì)物質(zhì)對溞類(大型溞)的急性毒性測定方法中的測定原理主要是：24h-EC、48h-EC指在24h或48h內(nèi)百分之五十的受試蚤運動受抑制時被測物濃度。(運動受抑制是指反復(fù)轉(zhuǎn)動試驗容器，15s之內(nèi)失去活動能力的大型蚤，被認為運動受抑制；即使其觸角仍能活動，也應(yīng)算做不活動的個體。)24h-LC、48h-LC指在24h或48h內(nèi)百分之五十的受試蚤死亡時被測物的濃度，以受試蚤心臟停止跳動為其死亡標(biāo)志。以試驗樣品濃度(或其對數(shù))和相應(yīng)濃度下大型蚤的死亡率(或運動受抑制率)為基礎(chǔ)建立正相關(guān)關(guān)系，并據(jù)此估算得到該物質(zhì)對大型蚤的LC、EC值，因此如果能結(jié)合此原理快速測定液體毒性，從物理的角度直觀的表征方便判斷，那么就是對此方法應(yīng)用的更大進步。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于大型蚤急性毒性檢測試劑盒，設(shè)計合理、結(jié)果直觀、使用方便，檢測效率高。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，所述的試劑盒主要包括：包裝殼、觀察通道、加液通道、補光系統(tǒng)、培養(yǎng)容器；所述的觀察通道是指白色的透光片，所述的加液通道是指漏斗形的加液管連接的管路，所述的補光系統(tǒng)是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線、開關(guān)、電池組成，所述的培養(yǎng)容器分為兩組，對照組和試驗組，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；所述的觀察通道安裝在培養(yǎng)容器上方，所述的補光系統(tǒng)安裝在培養(yǎng)容器的下方，所述的加液通道分別連接對照組和試驗組的培養(yǎng)容器。
進一步的，所述的試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：a.挑選適宜的大型溞幼蟲進行培養(yǎng)，選擇體大、健康的大型溞作為母溞，然后選擇母溞制備溞卵，保存溞卵，備用；b.制備稀釋水母液、餌料；c.制備包裝殼，并將觀察通道、加液通道、補光系統(tǒng)、培養(yǎng)容器進行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒。
進一步的，所述的挑選適宜的大型溞幼蟲進行培養(yǎng)是指選用試驗室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生12-24h的發(fā)育好，運動能力強的幼蚤，然后在20±2℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，所述的培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加2-5ml的微藻濃縮液，運行循環(huán)水裝置10-30鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長過程中每天運行循環(huán)水裝置1小時，7-10日后，選擇體形較大、活動能力強大型溞母體，然后進行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次30-50g/㎡，每天投喂3-5次，投喂時間為10-15天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進行分離，將得到的成溞單獨在16-20℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在24-48h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器。
進一步的，所述的保存液優(yōu)選為甘油，所述的甘油濃度為25-50％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
進一步的，所述的將成溞與幼溞進行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，所述的分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，所述的下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，所述第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對應(yīng)兩個分離容器，上下兩個分離篩網(wǎng)之間安裝有多個固定裝置，可根據(jù)選擇的細度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
進一步的，所述的稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用。
進一步的，所述的餌料是將小球藻經(jīng)過實驗室培養(yǎng)后進行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到所述的餌料，所述的餌料放入餌料容器中保存。
進一步地，所述的容器及管路均選用無毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
進一步的，所述的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在7.6-8.0，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水10-20ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在18-25℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果確定正式試驗的濃度范圍，按幾何級數(shù)的濃度系列，即等比級數(shù)間距設(shè)計5-7個濃度；等比級系數(shù)不超過2.2，如1、2、4、8、16等比級系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個大型蚤運動抑制率在40％-60％的濃度最為理想；
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測液，平均每蚤的待測液不低于2mL，每個濃度至少有4-6個平行，對照組內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗開始后，打開補光系統(tǒng)開關(guān)，應(yīng)于24h-48h內(nèi)每隔12h定期通過觀察通道觀察每個孔中仍能活動的水蚤數(shù)，測定0-100％大型蚤不活動或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨椋ㄟ^對照試驗首先來判斷待測液是否具有毒性，然后計算每個濃度中不活動的試驗蚤，包括死亡蚤，占試驗總數(shù)的百分比，用概率單位目測法，計算EC50，也可用計算機EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒的有益效果體現(xiàn)在：由于該試劑盒是將優(yōu)選的大型溞卵直接孵化測定的，過程直接簡單，有效的排除因為外界環(huán)境對溞卵生長特性的影響，通過物理補光系統(tǒng)，可以優(yōu)先判斷待測液的毒性，提高定性檢測效率，然后更進一步的進行定量檢測計算，節(jié)省檢測時間，應(yīng)用范圍廣，待測物質(zhì)不僅僅局限于水質(zhì)等其他液體，固體或不同狀態(tài)的物質(zhì)也可以使用。
附圖說明
圖1是本發(fā)明所述的一種用于大型蚤急性毒性檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
其中，1-包裝殼，2-觀察通道，3-加液通道，4-補光系統(tǒng)，5-試驗組，6-對照組。
具體實施方式
為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
為便于對本發(fā)明實施例的理解，下面將結(jié)合附圖及具體實施例為例做進一步的解釋說明，實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明實施例的限定。
實施例1：如圖1所示，一種用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，主要包括：包裝殼1、觀察通道2、加液通道3、補光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器；觀察通道2是指白色的透光片，加液通道3是指漏斗形的加液管連接的管路，補光系統(tǒng)4是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線、開關(guān)、電池組成，培養(yǎng)容器分為兩組，對照組6和試驗組5，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；觀察通道2安裝在培養(yǎng)容器上方，補光系統(tǒng)4安裝在培養(yǎng)容器的下方，加液通道3分別連接對照組6和試驗組5的培養(yǎng)容器。
試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：
a.挑選適宜的大型溞幼蟲進行培養(yǎng)是指選用試驗室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生12h的發(fā)育好，運動能力強的幼蚤，然后在18℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加2ml的微藻濃縮液，運行循環(huán)水裝置10鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長過程中每天運行循環(huán)水裝置1小時，7日后，選擇體形較大、活動能力強大型溞母體，然后進行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次30g/㎡，每天投喂3次，投喂時間為10天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進行分離，將得到的成溞單獨在16℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在24h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器，保存溞卵，備用；
保存液優(yōu)選為甘油，甘油濃度為25％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
將成溞與幼溞進行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對應(yīng)兩個分離容器，上下兩個分離篩網(wǎng)之間安裝有多個固定裝置，可根據(jù)選擇的細度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
b.制備稀釋水母液、餌料：
稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用；
餌料是將小球藻經(jīng)過實驗室培養(yǎng)后進行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到所述的餌料，所述的餌料放入餌料容器中保存。
c.制備試劑盒盒體，并將觀察通道2、加液通道3、補光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器進行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，容器及管路均選用無毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
一種用于大型溞急性毒性檢測的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在7.6，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水10ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在18℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果確定正式試驗的濃度范圍，按幾何級數(shù)的濃度系列，即等比級數(shù)間距設(shè)計5個濃度；等比級系數(shù)不超過2.2，如1、2、4、8、16等比級系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個大型蚤運動抑制率在40％的濃度最為理想。
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測液，平均每蚤的待測液不低于2mL，每個濃度至少有4個平行，對照組6內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗開始后，打開補光系統(tǒng)4開關(guān)，應(yīng)于24h內(nèi)每隔12h定期通過觀察通道2觀察每個孔中仍能活動的水蚤數(shù)，測定大型蚤不活動或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨?，通過對照試驗首先來判斷待測液是否具有毒性，然后計算每個濃度中不活動的試驗蚤，包括死亡蚤，占試驗總數(shù)的百分比，用概率單位目測法，計算EC50，也可用計算機EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
實施例2：如圖1所示，一種用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，主要包括：包裝殼1、觀察通道2、加液通道3、補光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器；觀察通道2是指白色的透光片，加液通道3是指漏斗形的加液管連接的管路，補光系統(tǒng)4是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線、開關(guān)、電池組成，培養(yǎng)容器分為兩組，對照組6和試驗組5，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；觀察通道2安裝在培養(yǎng)容器上方，補光系統(tǒng)4安裝在培養(yǎng)容器的下方，加液通道3分別連接對照組6和試驗組5的培養(yǎng)容器。
試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：
a.挑選適宜的大型溞幼蟲進行培養(yǎng)是指選用試驗室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生18h的發(fā)育好，運動能力強的幼蚤，然后在20℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加3.5ml的微藻濃縮液，運行循環(huán)水裝置20鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長過程中每天運行循環(huán)水裝置1小時，8日后，選擇體形較大、活動能力強大型溞母體，然后進行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次40g/㎡，每天投喂4次，投喂時間為13天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進行分離，將得到的成溞單獨在18℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在36h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器，保存溞卵，備用；
保存液優(yōu)選為甘油，甘油濃度為37.5％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
將成溞與幼溞進行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，所述的下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對應(yīng)兩個分離容器，上下兩個分離篩網(wǎng)之間安裝有多個固定裝置，可根據(jù)選擇的細度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
b.制備稀釋水母液、餌料：
稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用。
餌料是將小球藻經(jīng)過實驗室培養(yǎng)后進行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到餌料，餌料放入餌料容器中保存。
c.制備試劑盒盒體，并將觀察通道2、加液通道3、補光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器進行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，容器及管路均選用無毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
一種用于大型溞急性毒性檢測的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在7.8，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水15ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在22℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果確定正式試驗的濃度范圍，按幾何級數(shù)的濃度系列，即等比級數(shù)間距設(shè)計6個濃度；等比級系數(shù)不超過2.2，如1、2、4、8、16、32等比級系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個大型蚤運動抑制率在50％的濃度最為理想。
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測液，平均每蚤的待測液不低于2mL，每個濃度至少有5個平行，對照組6內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗開始后，打開補光系統(tǒng)4開關(guān)，應(yīng)于36h內(nèi)每隔12h定期通過觀察通道2觀察每個孔中仍能活動的水蚤數(shù)，測定大型蚤不活動或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨?，通過對照試驗首先來判斷待測液是否具有毒性，然后計算每個濃度中不活動的試驗蚤，包括死亡蚤，占試驗總數(shù)的百分比，用概率單位目測法，計算EC50，也可用計算機EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
實施例3：如圖1所示，一種用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，試劑盒主要包括：包裝殼1、觀察通道2、加液通道3、補光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器；觀察通道2是指白色的透光片，加液通道3是指漏斗形的加液管連接的管路，補光系統(tǒng)4是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線、開關(guān)、電池組成，培養(yǎng)容器分為兩組，對照組6和試驗組5，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；觀察通道2安裝在培養(yǎng)容器上方，補光系統(tǒng)4安裝在培養(yǎng)容器的下方，加液通道3分別連接對照組6和試驗組5的培養(yǎng)容器。
試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：
a.挑選適宜的大型溞幼蟲進行培養(yǎng)是指選用試驗室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生24h的發(fā)育好，運動能力強的幼蚤，然后在22℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加5ml的微藻濃縮液，運行循環(huán)水裝置30鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長過程中每天運行循環(huán)水裝置1小時，10日后，選擇體形較大、活動能力強大型溞母體，然后進行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次50g/㎡，每天投喂5次，投喂時間為15天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進行分離，將得到的成溞單獨在20℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在48h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器，保存溞卵，備用；
保存液優(yōu)選為甘油，甘油濃度為50％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
將成溞與幼溞進行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對應(yīng)兩個分離容器，上下兩個分離篩網(wǎng)之間安裝有多個固定裝置，可根據(jù)選擇的細度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
b.制備稀釋水母液、餌料:
稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用。
餌料是將小球藻經(jīng)過實驗室培養(yǎng)后進行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到所述的餌料，餌料放入餌料容器中保存。
c.制備試劑盒盒體，并將觀察通道2、加液通道3、補光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器進行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測的試劑盒，容器及管路均選用無毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
一種用于大型溞急性毒性檢測的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在8.0，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水20ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在25℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果確定正式試驗的濃度范圍，按幾何級數(shù)的濃度系列，即等比級數(shù)間距設(shè)計7個濃度；等比級系數(shù)不超過2.2，如1、2、4、8、16等比級系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個大型蚤運動抑制率在60％的濃度最為理想。
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測液，平均每蚤的待測液不低于2mL，每個濃度至少有6個平行，對照組6內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗開始后，打開補光系統(tǒng)4開關(guān)，應(yīng)于48h內(nèi)每隔12h定期通過觀察通道2觀察每個孔中仍能活動的水蚤數(shù)，測定大型蚤不活動或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨椋ㄟ^對照試驗首先來判斷待測液是否具有毒性，然后計算每個濃度中不活動的試驗蚤，包括死亡蚤，占試驗總數(shù)的百分比，用概率單位目測法，計算EC50，也可用計算機EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的精神和范圍。