本發(fā)明屬于環(huán)境污染物毒性檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分析環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境污染已經(jīng)成為全世界普遍存在的問題，其中，有機化合物、重金屬、抗生素等環(huán)境污染物所造成的環(huán)境污染尤為突出。近年來，國內(nèi)外越來越關(guān)注環(huán)境污染物對環(huán)境的破壞和對生物的毒害作用及其作用機理，一系列檢測環(huán)境污染程度與評價毒物毒性的方法被不斷地提出。
從環(huán)境化學(xué)分析的角度，高效液相色譜法、氣相色譜法等化學(xué)分析法可對環(huán)境污染物進行定性與定量分析，卻不能直接反映環(huán)境污染物對生態(tài)環(huán)境的影響，這些傳統(tǒng)的分析方法實驗周期長、成本高，通常不能廣泛、快速地用于毒物毒性與環(huán)境質(zhì)量的評估，見Lee,C.M.,Allen,H.E.The ecological risk assessment of copper differs from that of hydrophobic organic chemicals.Hum Ecol Risk Assess[J]；1998；4:605‐617。環(huán)境污染物對生物體的毒性，并非完全取決于其環(huán)境含量，一些變化的環(huán)境因素如pH值、氧化還原狀態(tài)等在很大程度上影響環(huán)境污染物的生物效應(yīng)。同時，化學(xué)分析數(shù)據(jù)并不能從整體上反映水質(zhì)的優(yōu)劣，或反映環(huán)境污染物對生物體和生態(tài)系統(tǒng)的影響。
生物毒性測試法可以彌補化學(xué)分析法在評價污染物毒性中的不足之處。鑒于模式生物對于生物科學(xué)與毒理學(xué)研究的重要價值，各種模式生物被逐漸開發(fā)出來用于環(huán)境科學(xué)與毒理學(xué)研究，例如秀麗線蟲和斑馬魚。在被開發(fā)出來的模式生物中，秀麗線蟲與斑馬魚因其個體小、測試周期短而日益受到重視與廣泛應(yīng)用。
秀麗線蟲是一種經(jīng)典模式生物，它的出現(xiàn)使得生命科學(xué)等領(lǐng)域許多復(fù)雜的問題得以簡單化，同時也解釋了許多基本的問題。與其他模式生物相比，秀麗線蟲對環(huán)境科學(xué)與生態(tài)毒理研究而言具有以下優(yōu)點：
(1)、秀麗線蟲從受精卵發(fā)育成一個成熟的成體僅需55小時左右，生活周期短、繁殖速度快、易于實驗室培養(yǎng)，因此，實驗周期短；
(2)、秀麗線蟲生活在土壤中，體長1mm左右，以細菌為食，對實驗人員自身并無危害；
(3)、秀麗線蟲通體透明，十分利于分析細胞譜系的變化與深入揭示和追蹤毒物的神經(jīng)毒理；
(4)、秀麗線蟲染色體數(shù)目少(2n＝12)，基因組小(8 107bp)，約有13500個基因，十分適于針對特定的毒理學(xué)研究開展全基因組篩選。
(5)、秀麗線蟲基因組中有約40％基因與人類基因組同源，暗示在秀麗線蟲中所進行的毒理學(xué)研究將在很大程度上反映毒物可能導(dǎo)致的對人體的毒害。
(6)、秀麗線蟲不僅可以生活在土壤中，在水溶液中也能生存，因此它可以作為分析土壤環(huán)境與水環(huán)境污染及相關(guān)毒理的有價值評估體系。
基于上述優(yōu)點，秀麗線蟲已經(jīng)成功地應(yīng)用于土壤與水環(huán)境中毒物毒性評估與毒理的研究(Steven G.Donkin,David B.Dusenbery.Using the Caenorhabditiselegans soil toxicity test to identify factors affecting toxicity of four metal ions in intact soil.Water,Air,and Soil Pollution[J]；1994；78；359‐373.Traunspurger,W et al.Ecotoxicological assessment of aquatic sediments with Caenorhabditiselegans(nematoda)‐A method for testing liquid medium and whole‐sediment samples.Environ ToxicolChem[J]；1997；16；245‐250)。
秀麗線蟲評價體系已經(jīng)發(fā)展成為含有致死率、最長壽命與半數(shù)致死天數(shù)、細胞凋亡、個體發(fā)育、生殖、運動行為、乙酰膽堿酯酶活性、學(xué)習(xí)行為、記憶行為、轉(zhuǎn)基因品系、突變體、基因表達模式等多項指標(biāo)的成熟模式生物，分別獲得了2002年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎、2006年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎、2008年諾貝爾化學(xué)獎，充分證明了采用該模式生物進行研究的優(yōu)勢，也充分奠定了其豐厚的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
雖然用秀麗線蟲測定環(huán)境污染物致死毒性的方法已有研究，但這些方法及其結(jié)果因為受限于實驗條件等原因，往往是簡單的通過體視顯微鏡確定秀麗線蟲的存活率，暴露組和對照組之間沒有可靠的、科學(xué)的數(shù)學(xué)模型進行關(guān)聯(lián)，從而得出更具統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，其能夠更加準(zhǔn)確地獲取秀麗線蟲的歸一化致死率，并采用非線性最小二乘法模擬得到相關(guān)種類的環(huán)境污染物的濃度與歸一化致死率的曲線以及環(huán)境污染物的半數(shù)致死濃度(LC50)。
為達到上述目的，本發(fā)明的解決方案是：
一種環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，其包括如下步驟：
(1)、獲取同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液，稀釋后得到秀麗線蟲樣液；
(2)、獲取濃度為C0的環(huán)境污染物原液，將環(huán)境污染物原液按照等比濃度梯度稀釋為n個環(huán)境污染物樣液，每個環(huán)境污染物樣液的濃度為k為1至n中的任意一個，n為大于1的整數(shù)，為稀釋因子；
(3)、獲取m+j×n個透明微孔，每個透明微孔內(nèi)均加入一定體積的秀麗線蟲樣液，j×n個透明微孔內(nèi)對應(yīng)加入不同濃度的環(huán)境污染物樣液，m為不添加環(huán)境污染物樣液的空白對照的個數(shù)，j為每種濃度的環(huán)境污染物樣液的平行對照的個數(shù)，m為≥1的整數(shù)，j為大于1的整數(shù)；
獲取歸一化系數(shù)Ben(0)為空白對照在t＝0時刻的秀麗線蟲個數(shù)，Cen(i,j,0)為j×n個透明微孔在t＝0時刻各自的秀麗線蟲個數(shù)，i為1至n中的任意一個；
(4)、培養(yǎng)t＝t0后，獲取t＝t0時刻時m個空白對照的秀麗線蟲個數(shù)的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t)為第x個空白對照在t＝t0時刻的秀麗線蟲個數(shù)，x為1至m中的任意一個；
獲取t＝t0時刻時每種濃度的環(huán)境污染物樣液中實際存活的秀麗線蟲個數(shù)Cen(i,j,t0)exp，并獲取該時刻每種濃度的環(huán)境污染物樣液中歸一化存活的秀麗線蟲個數(shù)Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)；
(5)、獲取t＝t0時刻時秀麗線蟲的歸一化致死率
其中，環(huán)境污染物為二價銅、1‐己基‐3‐甲基咪唑溴、草甘膦和四氯苯酚中的任意一種。
同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟：
(a‐1)、獲取秀麗線蟲原液；
(a‐2)、在秀麗線蟲原液中加入堿裂解液，殺死秀麗線蟲成蟲并得到含有秀麗線蟲蟲卵的液體；
(a‐3)、對含有秀麗線蟲蟲卵的液體進行培養(yǎng)，得到同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液。在步驟(a‐2)中，秀麗線蟲原液與堿裂解液的體積比為1:7。
上述的稀釋因子的確定方法為：
以C0作為使秀麗線蟲達到50％的急性致死率以上的最高效應(yīng)濃度CH，以Cn作為使秀麗線蟲達到0％至5％的急性致死率的最低效應(yīng)濃度CL，則稀釋因子
本發(fā)明的環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的分析方法還可以包括如下步驟：
(6)、獲取環(huán)境污染物的濃度與歸一化致死率的曲線，并計算出環(huán)境污染物的半數(shù)致死濃度。
由于采用上述方案，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明提供了一種環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，其包括如下步驟：將同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液稀釋后得到秀麗線蟲樣液；將環(huán)境污染物原液按照等比濃度梯度稀釋為n個環(huán)境污染物樣液；在透明微孔內(nèi)加入秀麗線蟲樣液并相應(yīng)加入不同濃度的環(huán)境污染物樣液，不加入環(huán)境污染物樣液的透明微孔作為空白對照；培養(yǎng)t0后，獲取歸一化存活的秀麗線蟲個數(shù)并計算歸一化致死率；通過曲線擬合計算出環(huán)境污染物的半數(shù)致死濃度；本發(fā)明的分析方法能夠更準(zhǔn)確地計算出環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性，更具統(tǒng)計學(xué)意義，能夠為評價環(huán)境污染物對生態(tài)系統(tǒng)及人類健康的安全問題提供更科學(xué)的理論支撐。
附圖說明
圖1是本發(fā)明中的96孔透明微板布局示意圖。
96孔透明微板四周共42個孔(四周一圈36個孔，第11列6個孔)各加入200μL Milli‐Q水防止產(chǎn)生邊緣效應(yīng)；第6列加入100μL的Milli‐Q水作為空白對照b；第2、3、4、5列(c1‐c6)和第7、8、9、10列(c7‐c12)分別加入按稀釋因子設(shè)計的不同濃度的環(huán)境污染物，第2、3、4、5列互為平行實驗，第7、8、9、10列互為平行實驗。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，其包括如下步驟：
(1)、獲取同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液，稀釋后得到秀麗線蟲樣液；
(2)、獲取濃度為C0的環(huán)境污染物原液，將環(huán)境污染物原液按照等比濃度梯度稀釋為n個環(huán)境污染物樣液，每個環(huán)境污染物樣液的濃度為Ck為第k個環(huán)境污染物樣液的濃度，k為1至n中的任意一個，n為大于1的整數(shù)，為稀釋因子；例如：n可以為12；
(3)、獲取m+j×n個透明微孔，每個透明微孔內(nèi)均加入一定體積的秀麗線蟲樣液(例如100μL)，j×n個透明微孔分別暴露于不同濃度的環(huán)境污染物樣液(即毒性暴露法)，m為不添加環(huán)境污染物樣液的透明微孔的個數(shù)(作為空白對照)，j為加入了同種濃度的環(huán)境污染物樣液的透明微孔的個數(shù)(作為相同環(huán)境污染物樣液的濃度的平行對照)，m為≥1的整數(shù)，例如，m可以為6，j為大于1的整數(shù)；
獲取歸一化系數(shù)Ben(0)為空白對照在t＝0時刻的秀麗線蟲個數(shù)，Cen(i,j,0)為j×n個透明微孔在t＝0時刻的秀麗線蟲個數(shù)，i為1至n中的任意一個；
(4)、培養(yǎng)t＝t0后，獲取t＝t0時刻時m個空白對照的秀麗線蟲個數(shù)的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t0)為第x個空白對照在t＝t0時刻的秀麗線蟲個數(shù)，x為1至m中的任意一個；
獲取t＝t0時刻時每種濃度的環(huán)境污染物樣液中實際存活的秀麗線蟲個數(shù)Cen(i,j,t0)exp，并獲取該時刻每種濃度的環(huán)境污染物樣液中歸一化后存活的秀麗線蟲個數(shù)Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)；
(5)、獲取t＝t0時刻時秀麗線蟲的歸一化致死率
其中，在步驟(1)中，環(huán)境污染物可以為二價銅、1‐己基‐3‐甲基咪唑溴、草甘膦和四氯苯酚中的任意一種。環(huán)境污染物的濃度可以為3.76×10‐3mol/L至3.7755×10‐2mol/L。
同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟：
(a‐1)、獲取秀麗線蟲原液；
(a‐2)、在秀麗線蟲原液中加入堿裂解液，得到含有秀麗線蟲蟲卵的液體；秀麗線蟲原液與堿裂解液的體積比為1:7；
(a‐3)、對含有秀麗線蟲蟲卵的液體進行培養(yǎng)，得到同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液。
具體而言，同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟：
1‐1、配制無菌K‐溶液、堿裂解液、線蟲生長固體培養(yǎng)基(Nematode Growth Medium，NGM)、用于培養(yǎng)大腸桿菌OP50(E.coli OP50)的LB液體培養(yǎng)基(Luria BertaniMedium)。
1‐2、將E.coli OP50在常溫下接種至滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)24h；
1‐3、將培養(yǎng)好的E.coli OP50接種至線蟲生長固體培養(yǎng)基(NGM培養(yǎng)基)上，于37℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24h；
1‐4、將秀麗線蟲接種至生長E.coli OP50的線蟲生長固體培養(yǎng)基上，在20℃條件下培養(yǎng)3天；
1‐5、用2mL無菌K‐溶液或無菌水將線蟲生長固體培養(yǎng)基(NGM培養(yǎng)基)表面的秀麗線蟲沖洗至15mL具有刻度的離心管中，靜置30min至2h以消耗其體內(nèi)殘留的食物，棄去上清液使得含有秀麗線蟲的液體留存約1.5mL；
1‐6、按含有秀麗線蟲的液體(蟲液):堿裂解液＝1:7的體積比，將堿裂解液加入蟲液中，混合搖勻，反應(yīng)20min，并每5min搖勻一次，以充分殺死秀麗線蟲母體，留下對堿裂解液有抵抗能力的含蟲卵的液體；
1‐7、對含蟲卵的液體在1500rpm離心1min，棄去上清液，加入無菌K‐溶液至離心前相同刻度，搖勻，1500rpm離心1min，棄去上清液，重復(fù)該操作2次；
1‐8、然后將離心管含有蟲卵的無菌K‐溶液轉(zhuǎn)移至有食物源的NGM培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(溫度為20℃)培養(yǎng)48h，獲得同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液(即L4期成蟲)。
其中，在步驟1‐1中，LB液體培養(yǎng)基按照《分子克隆試驗指南》(J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾等)中的方法配制。
在步驟1‐1中，線蟲生長固體培養(yǎng)基(NGM培養(yǎng)基)按照S.Brenner在1974年Genetics刊物上發(fā)表的論文(The genetic of Caenorhabditiselegans)中提及的方法配制。
在步驟1‐1中，配制1mol/L K2HPO4‐KH2PO4緩沖液(pH＝6，前后者按2:1比例配制而成)，用于平衡秀麗線蟲的滲透壓；膽固醇溶液、1mol/L MgSO4溶液、1mol/L CaCl2溶液，用于補充大腸桿菌生存所需營養(yǎng)元素；1mol/L NaOH溶液，用于調(diào)節(jié)pH。
在步驟1‐1中，無菌K‐溶液按照P.L.Williams等人在1990年Environmental Toxicology and Chemistry刊物上發(fā)表的論文(Aquatic toxicity testing using the nematode，Caenorhabditiselegans)中提及的方法配制。
在步驟1‐1中，堿裂解液(clorox溶液)按照S.W.Emmons等人在1979年P(guān)roceedings of the National Academy of Sciences刊物上發(fā)表的論文(An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditiselegans)中提到的方法配制。
在步驟(2)中，獲取濃度為C0的環(huán)境污染物原液的方法為：將環(huán)境污染物(如重金屬、農(nóng)藥、抗生素、離子液體、取代酚等)的實驗用分析純藥品溶解于Milli‐Q水中，制備為濃度較高的環(huán)境污染物原液。該環(huán)境污染物原液對秀麗線蟲的急性致死率應(yīng)為50％以上，優(yōu)選為60％以上，更優(yōu)選為70％以上，進一步優(yōu)選為80％以上，更進一步優(yōu)選為90％以上，還可以優(yōu)選為100％。
急性致死率的測定方法如下：將含有秀麗線蟲的培養(yǎng)液加入一定濃度的環(huán)境污染物，然后置于體視顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)完畢后，置于20℃的生化培養(yǎng)箱中，然后加入環(huán)境污染物原液以進行毒性暴露；暴露一定時間后，采用體視顯微鏡計數(shù)秀麗線蟲的存活個數(shù)與死亡個數(shù)；用鉑絲輕觸秀麗線蟲，若10s內(nèi)沒有反應(yīng)，則判定為該條秀麗線蟲已死亡。急性致死率的定義為毒性暴露之后的秀麗線蟲的死亡個數(shù)與毒性暴露之前的秀麗線蟲的個數(shù)之比。
稀釋因子的確定方法為：
以C0作為使秀麗線蟲達到至少50％的急性致死率以上的最高效應(yīng)濃度CH，以Cn作為使秀麗線蟲達到0％至5％的急性致死率的最低效應(yīng)濃度CL，等比濃度梯度的環(huán)境污染物樣液的個數(shù)為n，則稀釋因子最高效應(yīng)濃度CH的急性致死率可以優(yōu)選為60％以上，更優(yōu)選為70％以上，進一步優(yōu)選為80％以上，更進一步優(yōu)選為90％以上，還可以優(yōu)選為100％。例如，若CL＝2.290×10-5mol/L，CH＝4.586×10-3mol/L，等比濃度梯度的環(huán)境污染物樣液的個數(shù)為n＝12，則稀釋因子那么，就按照稀釋因子的比例依次對濃度為C0的環(huán)境污染物原液進行稀釋。
步驟(3)具體包括如下步驟：
(b‐1)、獲取m+j×n個透明微孔，用無菌K‐溶液將NGM培養(yǎng)基表面L4期的秀麗線蟲沖洗至5mL離心管中，應(yīng)輕微沖洗以避免將E.coli OP50帶入離心管中；
(b‐2)、根據(jù)具體需要，每個透明微孔內(nèi)均加入100μL的稀釋后的秀麗線蟲樣液；采用體視顯微鏡對m+j×n個透明微孔中的秀麗線蟲的個數(shù)進行計數(shù)；m為不暴露在環(huán)境污染物樣液的透明微孔的個數(shù)(作為空白對照)；n為等比濃度梯度的環(huán)境污染物樣液的個數(shù)；j為暴露于同種濃度的環(huán)境污染物樣液的透明微孔的個數(shù)(作為平行對照)，例如，j＝4；m為≥1的整數(shù)，j為大于1的整數(shù)；
(b‐3)、獲取歸一化系數(shù)Ben(0)為空白對照在t＝0時刻的秀麗線蟲的個數(shù)，Cen(i,j,0)為j×n個透明微孔在t＝0時刻的對應(yīng)的秀麗線蟲個數(shù)，i為1至n中的任意一個。
(b‐4)、將j×n個透明微孔分別置于20℃的生化培養(yǎng)箱中并分別暴露于不同濃度的環(huán)境污染物樣液中。
步驟(4)具體包括如下步驟：
(c‐1)、暴露培養(yǎng)t＝t0后(例如t＝24小時)，采用體視顯微鏡對每個透明微孔中的秀麗線蟲的個數(shù)進行計數(shù)；
(c‐2)、獲取t＝t0時刻時m個空白對照的秀麗線蟲個數(shù)的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t0)為第x個空白對照在t＝t0時刻的秀麗線蟲個數(shù)，x為1至m中的任意一個；
(c‐3)、獲取t＝t0時刻時暴露于每種濃度的環(huán)境污染物樣液中的透明微孔中實際存活的秀麗線蟲個數(shù)Cen(i,j,t0)exp，并獲取該時刻暴露于每種濃度的環(huán)境污染物樣液的環(huán)境的透明微孔中歸一化存活的秀麗線蟲個數(shù)Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)。
在步驟(5)中，致死率定義為各個透明微孔中死亡的秀麗線蟲數(shù)占空白對照的平均秀麗線蟲數(shù)的比例或百分率，歸一化致死率定義為以m(例如為6)個空白對照的平均線蟲數(shù)為參考對各個透明微孔中的死亡的秀麗線蟲數(shù)進行歸一化校正后的致死率，這樣可以提高秀麗線蟲計數(shù)的精度。
本發(fā)明的環(huán)境污染物對秀麗線蟲致死毒性的分析方法還可以包括如下步驟：
(6)、獲取相關(guān)環(huán)境污染物的濃度與歸一化致死率的曲線，并計算出環(huán)境污染物的半數(shù)致死濃度(LC50)。
其中，步驟(6)具體包括如下步驟：采用APTox軟件中的Logit或Weibull函數(shù)對不同濃度的環(huán)境污染物的秀麗線蟲歸一化致死率數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，得到環(huán)境污染物的濃度‐歸一化致死率關(guān)系曲線，置信區(qū)間為95％；然后分別計算出不同的環(huán)境污染物的半數(shù)致死濃度(LC50)。上述的APTox軟件的軟著登字為第062731，登記號為2006SR15065。
在步驟(6)中，所得到的半數(shù)致死濃度(LC50)可以為6.099×10‐4至5.962×10‐3mol/L。置信區(qū)間的下限可以為3.981×10‐4至5.154×10‐3mol/L，上限可以為8.036×10‐4至6.974×10‐3mol/L。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明：
實施例一
本實施例提供了一種環(huán)境污染物(Cu2+)對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，其包括如下步驟：
(1)、將E.coli OP50在常溫下接種至滅菌后的LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)24h；
(2)、將培養(yǎng)好的E.coli OP50接種至NGM培養(yǎng)基上，于37℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24h；
(3)、將秀麗線蟲接種至已生長E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基上，于20℃的條件下恒溫培養(yǎng)三天；
(4)、用2mL無菌K‐溶液將NGM培養(yǎng)基表面的秀麗線蟲沖洗至15mL具有刻度的離心管中，靜置30min，棄去上清液使得含有秀麗線蟲的液體(蟲液)留存約1.5mL；
(5)、按蟲液:堿裂解液＝1:7的體積比，將堿裂解液加入蟲液中，混合搖勻，反應(yīng)20min，并每5min搖勻一次，以充分殺死秀麗線蟲母體，留下對堿裂解液有抵抗能力的蟲卵；
(6)、對含蟲卵的液體在1500rpm離心1min，棄去上清液，加入無菌K‐溶液至離心前相同刻度，搖勻，1500rpm離心1min，棄去上清液，重復(fù)該操作2次；
(7)、將離心管含有蟲卵的無菌K‐溶液轉(zhuǎn)移至有食物源(E.coli OP50)的NGM培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(溫度為20℃)培養(yǎng)48h，獲得同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)液(L4期成蟲)，備用；
(8)、用移液器移取2mL無菌水沖洗同步化后并處于L4期的秀麗線蟲，將其置于裝有無菌K‐溶液的離心管中2h，以消耗其體內(nèi)殘留的食物，從而減少急性致死毒性測試過程中的干擾因素；
(9)、將秀麗線蟲蟲液用稀釋法加入到96孔透明微板中，每個透明微孔中加入100μL蟲液(確保每孔線蟲數(shù)基本一致)；
(10)、通過預(yù)實驗結(jié)果得到的濃度‐效應(yīng)數(shù)據(jù)以及期望的濃度‐效應(yīng)曲線點數(shù)，按幾何級數(shù)濃度梯度計算稀釋因子，將已配制的重金屬Cu2+使用液(Copper sulfate,CuSO4,美國Sigma公司，儲備液用Milli‐Q水配制，為3.76×10‐3mol/L并置于4℃冰箱中保存)根據(jù)最高毒性稀釋配制，并置于4℃冰箱中保存，使用液按稀釋因子(計算得：)所得的濃度梯度分別加入96孔透明微板的相應(yīng)孔中；其中，如圖1所示，96孔透明微板四周共42個孔(四周一圈36個孔，第11列6個孔)各加入200μL Milli‐Q水防止產(chǎn)生邊緣效應(yīng)；第6列加入100μL的Milli‐Q水作為空白對照b；第2、3、4、5列(c1‐c6)和第7、8、9、10列(c7‐c12)分別加入按稀釋因子設(shè)計的不同濃度Cu2+，第2、3、4、5列互為平行實驗，第7、8、9、10列互為平行實驗。每孔加入溶液體積均為100μL；即，總計每孔的混合液中有：100μL環(huán)境污染物溶液+100μL蟲液＝200μL的液體與數(shù)目基本一致的秀麗線蟲；將96孔透明微板置于20攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中進行毒性暴露；
(11)、24h后，采用體視顯微鏡計數(shù)96孔透明微板每孔中秀麗線蟲的存活與死亡個體數(shù)，在此過程中，用鉑絲輕觸秀麗線蟲，若10s內(nèi)沒有反應(yīng)則判定為死亡。
(12)、根據(jù)公式計算歸一化致死率：
(13)、選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中的Logit或Weibull函數(shù)進行非線性最小二乘擬合，得到Cu2+的LC50擬合值與95％置信區(qū)間上下限分別為7.589×10‐4mol/L、7.186×10‐4mol/L、8.036×10‐4mol/L。
實施例二
本實施例提供了一種環(huán)境污染物(1‐己基‐3‐甲基咪唑溴)對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，本實施例的方法與實施例一的方法的不同之處在于：1‐己基‐3‐甲基咪唑溴(1‐hexyl‐3‐methylimidazolium bromide,[hmim]Br，Damas beta公司)儲備液濃度為3.7755×10‐2mol/L，稀釋因子對秀麗線蟲的急性致死毒性數(shù)據(jù)選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中的Logit或Weibull函數(shù)進行非線性最小二乘擬合，得到LC50擬合值與95％置信區(qū)間上下限分別為：5.962×10‐3mol/L、5.154×10‐3mol/L、6.974×10‐3mol/L；其余參數(shù)與實施例一相同。
實施例三
本實施例提供了一種環(huán)境污染物(草甘膦)對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，本實施例的方法與實施例一的方法的不同之處在于：草甘膦(Glyphosate,GLY,美國Fluka公司)儲備液濃度為7.64×10‐3mol/L，稀釋因子GLY對秀麗線蟲的急性致死毒性數(shù)據(jù)選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中的Logit或Weibull函數(shù)進行非線性最小二乘擬合，得到LC50擬合值與95％置信區(qū)間上下限分別為：1.683×10‐3mol/L、1.317×10‐3mol/L、2.137×10‐3mol/L。其余參數(shù)與實施例一相同。
實施例四
本實施例提供了一種環(huán)境污染物(四氯苯酚)對秀麗線蟲致死毒性的分析方法，本實施例的方法與實施例一的方法的不同之處在于：四氯苯酚(4‐Chlorophenol,德國Dr.Ehrenstorfer公司)儲備液濃度為3.12×10‐2mol/L，稀釋因子四氯苯酚對秀麗線蟲的急性致死毒性數(shù)據(jù)選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中的Logit或Weibull函數(shù)進行非線性最小二乘擬合，得到LC50擬合值與95％置信區(qū)間上下限分別為：6.099×10‐4mol/L、3.981×10‐4mol/L、8.55×10‐4mol/L。
其余參數(shù)與實施例一相同。
上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。