本發(fā)明屬于糧食原料中糖苷腈含量的測定方法，涉及一種分光光度法測定氰化物含量的方法，屬于生物化學分析領域。
背景技術：
：糧食是人類必需的食物來源，同時也是釀酒、飼料、生物燃料等應用的主要原料。糧食的種類很多，常見的包括大麥、小麥、大豆、水稻、玉米、高粱、木薯類等。由于糧食的品種繁多，質(zhì)量良莠不齊，因此解決食品安全問題也成為保障人民身體健康的重大課題。糖苷腈，又名生氰糖苷、氰苷，是由氰醇衍生物的羥基和D-葡萄糖縮合形成的糖苷，廣泛存在于豆科，薔薇科，稻科等的10000余種糧食中。糖苷腈具有生氰作用，可水解生成高毒性的氫氰酸，從而對人體造成危害。糖苷腈的毒性甚強，對人的致死量為18mg/kg體重。糖苷腈的毒性主要是氫氰酸和醛類化合物的毒性。氫氰酸被吸收后，隨血液循環(huán)進入組織細胞，并透過細胞膜進入線粒體，氰化物通過與線粒體中細胞色素氧化酶的鐵離子結(jié)合，導致細胞的呼吸鏈中斷。因此挑選低糖苷腈含量的糧食品種是保證人民身體健康的重要途徑。目前并沒有針對糧食中糖苷腈含量有效準確的測定方法。常用的方法是直接對糧食樣品進行蒸餾后，利用化學滴定法和離子色譜法對氰化物含量進行測定。而對糧食樣品的直接蒸餾處理會致使糧食中的糖苷腈不能完全分解，使得后續(xù)得到的實驗數(shù)據(jù)不準確，降低了糧食中的糖苷腈含量，加大了食品安全隱患。并且利用化學滴定法及離子色譜法操作繁瑣，實驗耗時較長，由于氫氰酸易分解，因此將較低實驗結(jié)果的準確性。因此建立針對糧食原料中糖苷腈含量的測量方法是非常有必要的。技術實現(xiàn)要素：1.本發(fā)明的目的，旨在提供一種針對于糧食原料的，快速、準確、簡便的糖苷腈含量的測定方法。2.本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn)上述目的，步驟如下：(1)將糧食原料中的糖苷腈轉(zhuǎn)化為可測定氰化物：使用研磨機將糧食原料（約51g）研磨成0.2mm規(guī)格的粉末。準確稱取50.0±0.0005g的粉末樣品，轉(zhuǎn)移到燒杯中。加100mlβ-葡萄糖苷酶到燒杯中，混合均勻再轉(zhuǎn)移到500ml中頸圓底燒瓶中，再用100ml酶溶液潤洗。用鋁箔將圓底燒瓶的頸部覆蓋，防止蒸發(fā)熱損失。60℃水浴1小時，期間震蕩混勻數(shù)次。利用加熱器對樣品混合溶液進行蒸餾，收集100ml蒸餾液至一個200ml棕色容量瓶中，避免光照分解（稱量100ml蒸餾水在容量瓶中，收集蒸餾液直到刻度線）。(2)分光光度法測量樣品中糖苷腈濃度：取20ml蒸餾液加入到三口燒瓶中，加入1ml氯胺T溶液，完全混勻后，立即加入1ml巴比妥酸/吡啶溶液1ml（溶解3g的1,3-二甲基巴比妥酸在10ml蒸餾水中，加入15ml吡啶，最后加入蒸餾水定容50ml并儲存在棕色試劑瓶中）。試劑必須按順序加入，否則將不會顯色。將溶液充分混合均勻后，在水浴25℃條件下孵育5分鐘。之后利用分光光度計在室溫下590nm波長處讀取樣品吸光值。(3)配置標準溶液及制作標準曲線：通過稀釋氰化物儲備液到0~200ppb濃度來準備氰化物標準溶液。從下表的稀釋梯度中選取足夠的點來構建標準曲線（最小數(shù)量是5）。稀釋0.5ml的氰化物儲備液（1000ppm=1000000ppb）在500ml的蒸餾水中，得到一個1000ppb的中間濃度標準液。表1稀釋梯度表母液/中間標準溶液濃度（ppb）取液體積（ml）最終體積（ml）新標準溶液濃度（ppb）母液10000000.55001000中間標準標準液100020100200中間標準標準液100018100180中間標準標準液100016100160中間標準標準液100014100140中間標準標準液100012100120中間標準標準液100010100100中間標準標準液1000810080中間標準標準液1000610060中間標準標準液1000410040中間標準標準液1000210020（4）通過換算得出該批糧食每噸所含的糖苷腈含量：通過結(jié)合樣品的吸光值讀數(shù)與標準曲線來確定樣品中糖苷腈的含量，以ppb表示。表示形式為：Xppb糖苷腈。換算結(jié)果以g糖苷腈/t（噸）糧食原料來表示：Y為g糖苷腈/t（噸）糧食原料。換算公式為：Y=X×4×10-3。從樣品蒸餾液中的ppb糖苷腈轉(zhuǎn)換為g糖苷腈/t（噸）糧食原料的系數(shù)因子為4×10-3。該系數(shù)因子是用以下方法計算出來的：從ppb轉(zhuǎn)化到mg糖苷腈/1000ml蒸餾液：ppb糖苷腈×10-3≡mg糖苷腈/1000ml蒸餾液計算200ml容量瓶中收集的全部糖苷腈含量：mg糖苷腈/1000ml蒸餾液×0.2≡mg糖苷腈/200ml蒸餾液因此，200ml的蒸餾液中含有50g糧食原料中的糖苷腈：mg糖苷腈/200ml蒸餾液≡mg糖苷腈/50g糧食原料將糖苷腈的單位從mg轉(zhuǎn)化為g：mg糖苷腈/50g糧食原料×10-3≡g糖苷腈/50g糧食原料由于50g糧食原料=1/20000噸：g糖苷腈/50g糧食原料×20000≡g糖苷腈/t（噸）糧食原料因此，從蒸餾液中ppb糖苷腈到g糖苷腈/t(噸)糧食原料的系數(shù)因子轉(zhuǎn)化過程為：ppb糖苷腈×1×10-3×0.2×10-3×20000=g糖苷腈/t（噸）糧食原料ppb糖苷腈×4×10-3=g糖苷腈/t（噸）糧食原料任何其它的稀釋倍數(shù)在從樣品吸光值應用到標準曲線線性范圍時都應被計算在內(nèi)。3.本發(fā)明的原理在于：β-葡萄糖苷酶可以將糧食中的糖苷腈轉(zhuǎn)化為氰醇及葡萄糖，再經(jīng)過蒸餾，將氰醇熱轉(zhuǎn)化為氫氰酸及異丁醛。CN-離子通過氧化劑氯胺T氧化后，與吡啶中間體結(jié)合后，可以與二甲基巴比妥酸產(chǎn)生顯色反應。由于產(chǎn)生顯色反應的化合物濃度與糧食樣品中糖苷腈的含量成正比，因此結(jié)合樣品溶液吸光值與標準曲線可以得出樣品中所含的糖苷腈含量，再經(jīng)過公式轉(zhuǎn)換可以得出該批糧食原料每噸中的糖苷腈含量。而經(jīng)過測量，測得分光光度計對其最大吸收波長為590nm，因此選取在室溫條件下590nm波長處對樣品及標準溶液進行讀數(shù)。4.本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明一種糧食原料中糖苷腈含量的測定方法，是針對于糧食原料中的糖苷腈含量的測定方法。相對于其它前處理方式，利用β-葡萄糖苷酶可以將糧食原料中的糖苷腈充分轉(zhuǎn)化為氰醇，使得后續(xù)測量得到的結(jié)果更加的準確。另外，利用分光光度計進行測量，相對于化學滴定法及離子色譜法，操作更加簡便，實驗耗時更短，這樣也更有利于實驗精度的提高。因此，該方法是一種有效、準確、快速的糧食原料中糖苷腈含量的測定方法。具體實施方式一．所用樣品：5種大麥麥芽（由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院收集）二．所用試劑及儀器試劑：無水醋酸鈉（Sigma）CAS號：127-09-3；冰醋酸（Sigma）CAS號：64-19-7；β-葡萄糖苷酶(SigmaG-0395-50KU)CAS號：9001-22-3；氯胺T溶液（Sigma）CAS號：127-65-1；1,3-二甲基巴比妥酸（Greyhound）CAS號：769-42-6；氰化物標準溶液1000mg/l（Merck）CAS號：14244-62-3；吡啶(Simga)CAS號：110-86-1。儀器：容量瓶（包括200ml棕色容量瓶）；刻度移液管；中頸圓底燒瓶；防濺球管；冷凝管；量筒（1000，500，200和100ml）；28ml帶蓋三口燒瓶；渦旋振蕩器；pH計；Buhler-Miag研磨機；加熱器；水??；4位分析天平；Cecil7200分光光度計。該實驗所使用的所有試劑純度都為分析純（純度>99%）（1）醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH5.0)將8.204g無水醋酸鈉溶解于500ml蒸餾水中，配置0.2M的醋酸鈉溶液。稀釋5.8ml的冰醋酸至500ml，配置0.2M的醋酸溶液。將500ml0.2M的醋酸鈉溶液轉(zhuǎn)移至1L的燒杯中，使用0.2M的醋酸調(diào)節(jié)pH值至5（約加200ml）在調(diào)節(jié)pH值后，加入足夠的β-葡萄糖苷酶使最終的酶活達到2000-6000U/L。之后加入到1L容量瓶中，使用蒸餾水定容。（2）氯胺T溶液溶解0.25g氯胺T在蒸餾水中，定容50ml。溶液需在實驗當天配置并儲存在棕色試劑瓶中。（3）巴比妥酸/吡啶溶液溶解3g的1,3-二甲基巴比妥酸在10ml的蒸餾水中，加15ml吡啶。最后加入蒸餾水定容50ml并儲存在棕色試劑瓶中。（4）氰化物儲存溶液利用1000ppm的氰化物儲備液配置氰化物標準液，并進行適當?shù)南♂?。三．實驗方法分別稱取5種麥芽（約51g），用研磨機將麥芽研磨成0.2mm規(guī)格的粉末。精確稱取各樣品50.0±0.0005g，轉(zhuǎn)移至燒杯中。加入100mlβ-葡萄糖苷酶到燒杯中，混合均勻后再轉(zhuǎn)移到500ml中頸圓底燒杯中，在使用100mlβ-葡萄糖苷酶溶液進行潤洗。用鋁箔將圓底燒瓶的頸部覆蓋，防止蒸發(fā)熱損失。60℃水浴1小時，期間震蕩混勻數(shù)次。選取加熱器合適檔位對混合溶液進行蒸餾，避免防濺球管頸部產(chǎn)生任何樣品的泡沫。收集100ml各樣品蒸餾液至一個200ml棕色容量瓶中，避免光照分解(稱量100ml蒸餾水在容量瓶中，收集蒸餾液直至刻度線)。選取氰化物濃度為0ppb，40ppb，100ppb，160ppb，200ppb的氰化物標準溶液來作為標液，繪制標準曲線。以上標準溶液為使用蒸餾水稀釋濃度為1000ppb的氰化物中間濃度標準液而得到。分別將5個樣品蒸餾液及5個濃度的氰化物標準液吸取20ml，各自加到三口燒瓶中。用移液器加入1ml氯胺T溶液，完全混勻后，立即加入1ml巴比妥酸/吡啶溶液。試劑必須按順序加入，否則不會顯色。將各溶液混合均勻后，在25℃水浴中孵育5分鐘。之后利用Cecil7200分光光度計在室溫下590nm波長處對全部溶液進行吸光值讀取。利用5個氰化物標液的濃度及吸光值繪制標準曲線。結(jié)合5個樣品的吸光值與標準曲線，確定5個樣品中糖苷腈濃度ppb，再利用轉(zhuǎn)化公式將濃度ppb轉(zhuǎn)化為該批麥芽每噸中糖苷腈的含量。四．實驗結(jié)果5個濃度梯度的氰化物標液的吸光值如表2。表2標準溶液吸光值C(CN-)（ppb）040100160200吸光值（A）00.1610.4120.7170.863如表2的數(shù)據(jù)建立的標準曲線的線性方程為Y=0.0044x-0.0093，線性相關系數(shù)為R2=0.9981,線性相關良好。5個麥芽樣品的吸光值如表3，結(jié)合標準曲線可計算出蒸餾液中的糖苷腈濃度ppb及每種樣品每噸所含糖苷腈含量。表3麥芽樣品測量結(jié)果/1號樣品2號樣品3號樣品4號樣品5號樣品吸光值0.3120.1820.6730.7090.092糖苷腈ppb73.0243.48155.07163.2523.02g糖苷腈/t（噸）麥芽0.2920.1740.6200.6530.092在同樣的實驗條件下對1號、4號樣品平行測定6次，相對標準差（RSD）都在1%以下，結(jié)果如表4。表4平行實驗結(jié)果每噸麥芽中糖苷腈含量平行實驗結(jié)果表明，該測定方法結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。當前第1頁1 2 3