本發(fā)明屬于診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及生物標(biāo)記用于制備腺性膀胱炎診斷分型試劑的用途。
背景技術(shù)：
腺性膀胱炎(cystitisglandularis，cg)是一種比較少見(jiàn)的非腫瘤性炎性病變，是一種上皮增生與化生同時(shí)存在的病變，其過(guò)程為上皮增生凹入成brunn巢，其內(nèi)出現(xiàn)裂隙，形成分支狀、環(huán)狀管腔，中心出現(xiàn)腺性化生形成腺體結(jié)構(gòu)，與此時(shí)同時(shí)存在淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，因此稱之為腺性膀胱炎。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，腺性膀胱炎就是一種膀胱黏膜及黏膜下層黏液腺體異常增殖、化生性病變，其發(fā)病率日益增高，且與膀胱癌關(guān)系密切(楊安卿等，p27蛋白在不同分型腺性膀胱炎中的表達(dá)及其臨床意義，2016)。腺性膀胱炎是否為癌前病變，目前存在爭(zhēng)議。雖然其惡變率較低，但臨床上仍具有潛在惡變傾向(楊安卿等，p27蛋白在腺性膀胱炎的表達(dá)及其與膀胱癌的關(guān)聯(lián)，2016)。
腺性膀胱炎具有特殊的病理發(fā)展過(guò)程和臨床發(fā)病特點(diǎn)，病因目前仍不清楚，可能與膀胱慢性炎癥、結(jié)石、梗阻、神經(jīng)源性膀胱、膀胱外翻等疾病有關(guān)。在膀胱三角區(qū)、膀胱頸部及輸尿管口周圍等位置較易發(fā)生。
腺性膀胱炎的診斷方法主要有三種：膀胱鏡、超聲和ct。不同發(fā)展階段的腺性膀胱炎的臨床及聲像學(xué)表現(xiàn)各異，超聲檢查容易發(fā)生漏診或誤診為膀胱癌。腺性膀胱炎的超聲分型包括結(jié)節(jié)型、結(jié)節(jié)增厚型、片狀增厚型及彌漫增厚型，其中結(jié)節(jié)型容易誤診為膀胱癌，而膀胱壁無(wú)明顯增厚或結(jié)節(jié)狀突起者超聲檢査容易發(fā)生漏診(柯麗明等，腺性膀胱炎的超聲分型與誤診漏診分析，2014)。ct檢查簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)創(chuàng)，能從不同角度觀察病灶，可作為早期發(fā)現(xiàn)腺性膀胱炎或治療后隨訪的有效手段，ct的特征性表現(xiàn)在一定程度上能明確診斷，但對(duì)于一些表現(xiàn)不典型的病例只能依賴膀胱鏡活檢(黃丹江等，腺性膀胱炎的ct診斷影像學(xué)表現(xiàn)，2011)。因此，腺性膀胱炎最權(quán)威的診斷方法還是膀胱鏡。臨床主要根據(jù)膀胱鏡檢查及組織病理學(xué)類型分別對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行分組。膀胱鏡所見(jiàn)分組為慢性炎癥型、濾泡水腫型、乳頭狀瘤型、腸腺瘤樣型四種；組織病理學(xué)分組為無(wú)化生型、腸化生型、前列腺型三種(方海偉等，p53、ki67腫瘤標(biāo)志物在不同分型腺性膀胱炎中的表達(dá)及臨床意義，2010)。
如前所述，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)腺性膀胱炎分型需要借助于膀胱鏡，是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。但是，膀胱鏡檢查有很多禁忌，如尿道、膀胱處于急性炎癥期不宜進(jìn)行檢查，膀胱容量過(guò)小不宜進(jìn)行檢查，婦女月經(jīng)期或妊娠3個(gè)月以上不宜進(jìn)行檢查。而且，術(shù)前準(zhǔn)備和術(shù)后處理繁瑣。這些增加了檢查者的身體和心理痛苦。
生物標(biāo)志物可評(píng)估人體對(duì)疾病的易感性或檢出機(jī)體的異常，常用于病理狀態(tài)的診斷和檢測(cè)，預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展，或評(píng)估療效。與一些在疾病中發(fā)揮作用的危險(xiǎn)因素不同(如年齡、肥胖、吸煙等與疾病有關(guān)的因素)，生物標(biāo)志物不需要參與疾病的進(jìn)展過(guò)程。生物標(biāo)記物的篩選方法多種多樣，如通過(guò)代謝組學(xué)法、基因組學(xué)法、蛋白質(zhì)組學(xué)法發(fā)現(xiàn)小分子代謝標(biāo)志物、基因標(biāo)志物和蛋白質(zhì)標(biāo)志物，循環(huán)microrna和組織microrna等。
mirna可通過(guò)與靶基因3'-utr區(qū)的配對(duì)(完全配對(duì)或部分配對(duì))結(jié)合來(lái)降解mrna或抑制mrna翻譯，從而調(diào)控靶基因表達(dá)水平。作為調(diào)控分子，多數(shù)mirna具有與其他基因表達(dá)調(diào)控分子共同的特點(diǎn)，即細(xì)胞和組織特異性、表達(dá)時(shí)序性、結(jié)構(gòu)可變性及不同物種間的高度同源性。血液、尿液、胃液等體液中也存在著與循環(huán)dna、循環(huán)細(xì)胞類似，且源自原發(fā)病灶的循環(huán)mirna分子。這些循環(huán)mirna具有良好的穩(wěn)定性，在室溫放置24h、多次凍融、rna酶和dna酶作用及保存溫度改變等條件下均無(wú)明顯降解，考慮與mirna存在于凋亡小體、微泡、外染色體等脂質(zhì)或脂蛋白復(fù)合物中密切相關(guān)。因此，相對(duì)于其他診斷方法，循環(huán)mirna檢測(cè)創(chuàng)傷小，且具備一定的疾病相關(guān)特異度和穩(wěn)定性，有成為新型診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值(李越等，循環(huán)microrna在人類疾病診斷標(biāo)志物篩選中的研究進(jìn)展，2014)。
代謝組學(xué)的概念是nicholson等在1999年率先提出的。相對(duì)于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)更關(guān)注生物體的表型，因此也是疾病潛在生物標(biāo)志物篩選中最有前景的發(fā)展方向。它借助于核磁共振波譜法、質(zhì)譜結(jié)合多種分離手段對(duì)生物體系在生理或病理狀態(tài)下所有內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，從而描繪出生物體代謝輪廓，探索內(nèi)源性小分子物質(zhì)與疾病發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系。分子量小于1000道爾頓的小分子化合物是代謝組學(xué)關(guān)注的主要目標(biāo)。相比較于基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)研究，代謝組學(xué)反映的是細(xì)胞活動(dòng)的最終產(chǎn)物，所以也最穩(wěn)定。由于細(xì)胞在維持功能時(shí)時(shí)刻都在發(fā)生代謝，因此代謝組學(xué)分析能反映有機(jī)體在一定時(shí)間段內(nèi)的功能和狀態(tài)，在某種疾病狀態(tài)下基因和蛋白表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物上得到放大，許多不能從這兩種物質(zhì)上體現(xiàn)的變化可以在代謝組學(xué)中得到檢測(cè)。目前研究已證實(shí)疾病的發(fā)生和進(jìn)展與代謝異常密切相關(guān)，代謝組學(xué)可以分析疾病發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生的所有代謝物，識(shí)別有價(jià)值的潛在標(biāo)志物，從而為疾病的診斷和分型開(kāi)辟新途徑(吳杰等，代謝組學(xué)分析在腫瘤標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用進(jìn)展，2016)。
申請(qǐng)人以“腺性膀胱炎”和“標(biāo)志物”在中文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索到3篇相關(guān)文獻(xiàn)：(1)方海偉等將40例患者按膀胱鏡檢及組織病理學(xué)類型進(jìn)行分組，采用免疫組織化學(xué)sabc法，檢查p53、ki67在各分型腺性膀胱炎中的表達(dá)，并與10例正常膀胱黏膜組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳頭狀瘤型、腸腺瘤型腺性膀胱炎有較高的p53、ki67表達(dá)率，并與正常膀胱黏膜比較有顯著性差異；慢性炎癥型、濾泡水腫型則p53、ki67表達(dá)率較低，與正常膀胱黏膜無(wú)差異；腸上皮型、前列腺型腺性膀胱炎p53表達(dá)率較高，并且與正常膀胱黏膜組比較有顯著性差異；腸上皮型、前列腺型腺性膀胱炎ki67表達(dá)率較高，與膀胱正常黏膜組比較，前列腺型組有顯著性差異，腸上皮型無(wú)顯著性差異(方海偉等，p53、ki67腫瘤標(biāo)志物在不同分型腺性膀胱炎中的表達(dá)及臨床意義，2010)；(2)程躍等取96例確定有異常病理改變并行手術(shù)治療的患者標(biāo)本，其中腺性膀胱炎(gc)40例，膀胱黏膜鱗狀上皮化生(smbm)32例，合并兩種病理改變(gc-smbm)24例，另取21例正常膀胱黏膜為對(duì)照組，利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)活檢標(biāo)本中p53、rasp21的表達(dá)情況，結(jié)果gc組及smbm組p53及rasp21陽(yáng)性率表達(dá)與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，gc-smbm組p53、rasp21及兩者同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(程躍等，單克隆抗體p53及rasp21在腺性膀胱炎及膀胱黏膜鱗狀上皮化生中的表達(dá)研究，2012)；(3)宋亞輝等從病理學(xué)角度支持腺性膀胱炎是正常膀胱組織向膀胱癌發(fā)展的中間階段，survivin可考慮作為診斷早期膀胱腺癌的敏感指標(biāo)(宋亞輝等，survivin在腺性膀胱炎與膀胱腺癌中的表達(dá)及臨床意義，2014)。
申請(qǐng)人以“cystitisglandularis”和“biomarker”在webofscience數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索到2篇相關(guān)文獻(xiàn)：(1)weizf等發(fā)現(xiàn)乳頭狀腺性膀胱炎患者膀胱粘膜組織中的htert、p53和pcna比膀胱正常人膀胱粘膜的水平明顯較高，提示乳頭狀腺性膀胱炎比較容易發(fā)生癌變(expressionofhtert,p53andpcnaincystitisglandularis,2007)；(2)velickovic,lj等使用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)黏蛋白cd10在腸化生型腺性膀胱炎的粘膜組織中不表達(dá)，可以用于區(qū)分腸化生型和無(wú)化生型腺性膀胱炎(differencesintheexpressionofmucinsinvariousformsofcystitisglandularis,2007)。
申請(qǐng)人檢索未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)采用代謝組學(xué)和循環(huán)mirna分子對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷，并對(duì)不同類型腺性膀胱炎進(jìn)行區(qū)分，更沒(méi)有公開(kāi)相關(guān)相關(guān)生物標(biāo)志物在這方面的應(yīng)用。由于腺性膀胱炎臨床表現(xiàn)缺乏特征性，現(xiàn)有檢查手段又存在各自的缺陷和不足，有必要開(kāi)發(fā)相關(guān)的診斷試劑對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷分型。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供生物標(biāo)記用于制備腺性膀胱炎診斷分型試劑的用途，具體地：本發(fā)明第一目的在于提供血液循環(huán)mirna分子用于診斷腺性膀胱炎，并對(duì)不同類型(以膀胱鏡所見(jiàn)分型，即慢性炎癥型、濾泡水腫型、乳頭狀瘤型、腸腺瘤樣型四種)的腺性膀胱炎進(jìn)行區(qū)分；本發(fā)明第二目的在于提供血液代謝小分子用于診斷腺性膀胱炎，并對(duì)不同類型(以膀胱鏡所見(jiàn)分型，即慢性炎癥型、濾泡水腫型、乳頭狀瘤型、腸腺瘤樣型四種)的腺性膀胱炎進(jìn)行區(qū)分；本發(fā)明可以從不同角度提供腺性膀胱炎診斷分型的診斷試劑。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
一種用于診斷腺性膀胱炎的生物標(biāo)志物群，所述腺性膀胱炎分為慢性炎癥型、濾泡水腫型、乳頭狀瘤型和腸腺瘤樣型，該生物標(biāo)志物群包括seqidno.1所示的mir-372-3p、seqidno.2所示的mir-383-3p和seqidno.3所示的mir-377-3p。聯(lián)合應(yīng)用mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積(auc)為0.964，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為96.2％和95.6％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為慢性炎癥型，生物標(biāo)志物群還包括seqidno.4所示的mir-485-3p和seqidno.5所示的mir-501-3p。在mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-485-3p和mir-501-3p診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.943，靈敏度和特異性分別為95.3％和94.2％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為濾泡水腫型，生物標(biāo)志物群還包括seqidno.6所示的mir-96-3p和seqidno.7所示的mir-93-5p。在mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-96-3p和mir-93-5p診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.969，靈敏度和特異性分別為96.5％和95.8％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為乳頭狀瘤型，生物標(biāo)志物群還包括seqidno.8所示的mir-223-5p和seqidno.9所示的mir-183-3p。在mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-223-5p和mir-183-3p診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.984，靈敏度和特異性分別為96.2％和96.6％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為腸腺瘤樣型，生物標(biāo)志物群還包括seqidno.10所示的mir-584-3p和seqidno.11所示的mir-128-3p。在mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-584-3p和mir-128-3p診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.973，靈敏度和特異性分別為96.0％和95.8％。
進(jìn)一步地，所述生物標(biāo)志物源于血漿。
上述生物標(biāo)志物群在制備腺性膀胱炎診斷試劑方面的用途。
一種用于診斷腺性膀胱炎的生物標(biāo)志物群，所述腺性膀胱炎分為慢性炎癥型、濾泡水腫型、乳頭狀瘤型和腸腺瘤樣型，該生物標(biāo)志物群包括甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸。聯(lián)合應(yīng)用甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積(auc)為0.958，靈敏度和特異性分別為96.6％和96.1％，單個(gè)應(yīng)用時(shí)roc曲線下面積均小于0.7。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為慢性炎癥型，生物標(biāo)志物群還包括硫酸吲哚酚和咖啡因。在甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用硫酸吲哚酚和咖啡因診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.952，靈敏度和特異性分別為96.3％和95.4％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為濾泡水腫型，生物標(biāo)志物群還包括溶血磷脂酰膽堿(18:1)、鵝去氧膽酸和神經(jīng)節(jié)苷脂。在甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、鵝去氧膽酸和神經(jīng)節(jié)苷脂診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.962，靈敏度和特異性分別為95.8％和95.2％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為乳頭狀瘤型，生物標(biāo)志物群還包括溶血磷脂酰膽堿(18:1)、磷脂酰絲氨酸和磷酸二氫丙酮。在甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、磷脂酰絲氨酸和磷酸二氫丙酮診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.979，靈敏度和特異性分別為95.5％和96.0％。
進(jìn)一步地，所述腺性膀胱炎為腸腺瘤樣型，生物標(biāo)志物群還包括溶血磷脂酰膽堿(16:0)和透明質(zhì)酸。在甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(16:0)和透明質(zhì)酸診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.981，靈敏度和特異性分別為96.7％和96.1％。
進(jìn)一步地，所述生物標(biāo)志物源于血漿。
上述生物標(biāo)志物群在制備腺性膀胱炎診斷試劑方面的用途。
本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的貢獻(xiàn)：
(1)本發(fā)明證明，聯(lián)合應(yīng)用mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-485-3p和mir-501-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-96-3p和mir-93-5p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-223-5p和mir-183-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-584-3p和mir-128-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人。通過(guò)這11個(gè)mirnas即可對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷并分型，可以將其制備成診斷區(qū)分腺性膀胱炎的診斷試劑。
(2)本發(fā)明證明，聯(lián)合應(yīng)用甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用硫酸吲哚酚和咖啡因可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、鵝去氧膽酸和神經(jīng)節(jié)苷脂可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、磷脂酰絲氨酸和磷酸二氫丙酮可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(16:0)和透明質(zhì)酸可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人。通過(guò)這13個(gè)血漿代謝物即可對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷并分型，可以將其制備成診斷區(qū)分腺性膀胱炎的診斷試劑。
(3)使用本發(fā)明提供的診斷試劑不通過(guò)介入手段就可以對(duì)腺性膀胱炎診斷分型，僅需患者少量血漿，檢查時(shí)沒(méi)有禁忌，克服了膀胱鏡檢查的不足。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例具體介紹本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)中未詳述的試驗(yàn)操作均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)試驗(yàn)操作。
實(shí)施例1基于血液循環(huán)mirna分子的診斷試劑
第一部分：篩選階段
一、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
1、血漿樣本：研究對(duì)象23例，年齡45～55歲，平均51.3歲；男12例，女11例。經(jīng)膀胱鏡確診分組：慢性炎癥組(慢性炎癥型6例，3m/3f)、濾泡水腫組(濾泡水腫型5例，3m/2f)、乳頭狀瘤組(乳頭狀瘤型5例，2m/3f)、腸腺瘤樣組(腸腺瘤樣型7例，4m/3f)。各病例均為初診，無(wú)藥物治療史。另有5例膀胱正常人為對(duì)照組。各組研究對(duì)象的年齡無(wú)顯著性差異。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝腎及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下層黏液腺體無(wú)異常增殖、無(wú)化生性病變的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周靜脈血血漿，采血時(shí)間均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。
2、血漿總rna提?。喝?00μl血漿，使用mirvanatmrnaisolation試劑盒(ambion公司)抽提總rna，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用分光光度計(jì)測(cè)定所提取rna的質(zhì)量。
3、分離標(biāo)記：將1μgrna，7μldepc水，2μlrnaspikecontrololigospoly，5μlatp濃度為1mmol/ltris的溶液混合后快速離心。向上述溶液加入1.5μl25mmol/lmncl2，1.5μl10×reactionbuffer，1.0μl酸性磷酸酶，1.0μldilutedatpmix后37℃孵育15min；熒光標(biāo)記連接，取上述混合物15μl快速離心后置冰浴上，加入2μlt4dna連接酶，4μl5×flashtag連接mix生物素，混勻后快速離心，25℃孵育0.5h。
4、芯片雜交：采用affymetrix公司mirna芯片試劑盒，遵從試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。.雜交液的配制：50μl2×雜交mix，5μl20×雜交對(duì)照物，5μl去離子甲酰胺，10μldepc水，1.7μl對(duì)照物寡聚核苷酸b2及10μl二甲基亞砜。將上述雜交液與生物素樣本混合后99℃孵育5min，45℃孵育5min，取100μl用于微陣列雜交，48℃，60r/min孵育16h。
5、芯片掃描及圖像數(shù)據(jù)處理：通過(guò)genepix4000bmicroarrayscanner(axoninstruments，fostercity，ca)掃描儀對(duì)芯片掃描，并采集熒光強(qiáng)度。然后再通過(guò)genepixpro6.0software(axon)圖像分析軟件對(duì)采集的雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化分析，用每個(gè)探針的原始信號(hào)值減去該點(diǎn)的背景值得到每個(gè)探針的修正值；用同一批次實(shí)驗(yàn)中在每張芯片上修正值≥50的非對(duì)照探針做標(biāo)準(zhǔn)化，以這部分探針中值作為標(biāo)準(zhǔn)化因子對(duì)整張芯片的點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)化處理。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)后處理后，分別用慢性炎癥組/對(duì)照組、濾泡水腫組/對(duì)照組、乳頭狀瘤組/對(duì)照組、腸腺瘤樣組/對(duì)照組計(jì)算相應(yīng)mirnas分子的差異倍數(shù)，挑選差異大于1.5或小于0.5的mirna作為有表達(dá)差異的mirnas，即獲得初篩結(jié)果，用于進(jìn)一步驗(yàn)證。
6、表達(dá)驗(yàn)證：對(duì)初篩有表達(dá)差異的mirnas進(jìn)行驗(yàn)證，其引物參照genbank數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。按照qpcr逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，20μl反應(yīng)體系，37℃孵育60min，95℃溫育5min終止反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄成cdna后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。遵照qpcr試劑盒說(shuō)明書(shū)，20μl反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性2min，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為95℃，15s及60℃，60s。通過(guò)abi7500定量pcr儀獲得ct值，單個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、患者與膀胱正常人相比有差異性表達(dá)的mirna
芯片結(jié)果的分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組和腸腺瘤樣組血漿中mir-222-3p、mir-146a-5p、mir-485-3p、mir-501-3p、mir-96-3p、mir-93-5p、mir-223-5p、mir-183-3p、mir-584-3p、mir-128-3p、mir-425-3p、mir-372-3p、mir-342-3p、mir-124-5p、mir-155-5p、mir-183-5p、mir-383-3p、mir-377-3p這18種mirnas表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，表達(dá)差異顯著(p＜0.05)。
2、qpcr表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果
對(duì)疾病組和對(duì)照組血漿中的上述差異性mirna進(jìn)行qpcr驗(yàn)證，結(jié)果顯示：
與對(duì)照組比，慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組和腸腺瘤樣組血漿中mir-372-3p下調(diào)0.3～0.5倍，mir-383-3p上調(diào)1.8～2.2倍，mir-377-3p下調(diào)0.2～0.4倍；與對(duì)照組比，慢性炎癥組血漿中mir-485-3p上調(diào)1.9～2.3倍，mir-501-3p上調(diào)1.7～2.0倍；與對(duì)照組比，濾泡水腫組血漿中mir-96-3p上調(diào)2.1～2.4倍，mir-93-5p上調(diào)2.5～2.8倍；與對(duì)照組比，乳頭狀瘤組血漿中mir-223-5p上調(diào)2.6～2.9倍，mir-183-3p上調(diào)1.8～2.1倍；與對(duì)照組比，腸腺瘤樣組血漿中mir-584-3p上調(diào)3.2～3.4倍，mir-128-3p上調(diào)2.4～2.6倍。驗(yàn)證結(jié)果如表1所示。
表1差異性mirna的qpcr表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果
第二部分：驗(yàn)證階段
血漿樣本：研究對(duì)象81例，年齡45～55歲，平均50.4歲；男42例，女39例。經(jīng)膀胱鏡確診分組：慢性炎癥組(慢性炎癥型20例，11m/9f)、濾泡水腫組(濾泡水腫型22例，11m/11f)、乳頭狀瘤組(乳頭狀瘤型21例，11m/10f)、腸腺瘤樣組(腸腺瘤樣型18例，8m/10f)。各病例均為初診，無(wú)藥物治療史。另有15例膀胱正常人為對(duì)照組。各組研究對(duì)象的年齡無(wú)顯著性差異。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝腎及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下層黏液腺體無(wú)異常增殖、無(wú)化生性病變的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周靜脈血血漿，采血時(shí)間均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。
其它試驗(yàn)材料和方法同篩選階段。
受試者工作特征曲線(roc)分析：構(gòu)建roc曲線來(lái)驗(yàn)證上述qpcr表達(dá)驗(yàn)證的mirnas對(duì)腺性膀胱炎診斷分型的能力。
結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積(auc)為0.964，靈敏度和特異性分別為96.2％和95.6％(在最佳cutoff值下，下同)，單個(gè)應(yīng)用時(shí)roc曲線下面積均小于0.7；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-485-3p和mir-501-3p診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.943，靈敏度和特異性分別為95.3％和94.2％；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-96-3p和mir-93-5p診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.969，靈敏度和特異性分別為96.5％和95.8％；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-223-5p和mir-183-3p診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.984，靈敏度和特異性分別為96.2％和96.6％；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-584-3p和mir-128-3p診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.973，靈敏度和特異性分別為96.0％和95.8％。由于mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p在慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組、腸腺瘤樣組中的上調(diào)或下調(diào)情況基本一致，所以僅通過(guò)mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p聯(lián)合應(yīng)用無(wú)法區(qū)分慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組和腸腺瘤樣組。
結(jié)論分析：roc曲線評(píng)價(jià)方法中，roc曲線下的面積值auc在大于0.5的情況下，越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好。auc在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，auc在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，auc在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。上述結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-485-3p和mir-501-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人，靈敏度高，特異性強(qiáng)；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-96-3p和mir-93-5p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人，靈敏度高，特異性強(qiáng)；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-223-5p和mir-183-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人，靈敏度高，特異性強(qiáng)；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-584-3p和mir-128-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人，靈敏度高，特異性強(qiáng)。通過(guò)這11個(gè)mirnas即可對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷并分型。roc曲線評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2roc曲線評(píng)價(jià)結(jié)果(循環(huán)mirnas)
本實(shí)施例的貢獻(xiàn)：
本實(shí)施例證明，聯(lián)合應(yīng)用mir-372-3p、mir-383-3p和mir-377-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-485-3p和mir-501-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-96-3p和mir-93-5p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-223-5p和mir-183-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用mir-584-3p和mir-128-3p可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人。通過(guò)這11個(gè)mirnas即可對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷并分型，可以將其制備成診斷區(qū)分腺性膀胱炎的診斷試劑。
實(shí)施例2基于血漿小分子代謝物的診斷試劑
第一部分：篩選階段
一、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
1、血漿樣本：研究對(duì)象23例，年齡45～55歲，平均51.3歲；男12例，女11例。經(jīng)膀胱鏡確診分組：慢性炎癥組(慢性炎癥型6例，3m/3f)、濾泡水腫組(濾泡水腫型5例，3m/2f)、乳頭狀瘤組(乳頭狀瘤型5例，2m/3f)、腸腺瘤樣組(腸腺瘤樣型7例，4m/3f)。各病例均為初診，無(wú)藥物治療史。另有5例膀胱正常人為對(duì)照組。各組研究對(duì)象的年齡無(wú)顯著性差異。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝腎及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下層黏液腺體無(wú)異常增殖、無(wú)化生性病變的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周靜脈血血漿，采血時(shí)間均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。
2、lc-ms分析用樣品的制備
取血漿50μl，加入200μl乙腈，手動(dòng)混合30s后超聲混合20min，再以10,000×g離心30min，收集上清液于分離式玻璃管中，沉淀繼續(xù)用200μl體積濃度50％的甲醇萃取，將甲醇萃取的上清液與乙腈萃取的上清液合并，氮?dú)獯蹈?，殘留物?80℃保存。lc-ms分析前，用100μl體積濃度5％的乙腈水溶液將殘留物溶解，14,000×g離心5min，上清液進(jìn)樣分析(8h內(nèi)有效)。
3、lc-ms分析參數(shù)
色譜系統(tǒng)：watersacquityhplc/q-tofmicroms
色譜柱：acquityuplctmbehc18(2.1m×100mm×1.7μm)
流動(dòng)相：a相為水(含0.1％甲酸)；b相為乙腈(含0.1％甲酸)
梯度條件：0-2min，2-50％b；2-3min，50-98％b；3-4.5min，98％b；4.5-6min，2％b。
流速：0.5ml/min；柱溫：45℃。
ms條件：電噴霧(uplc/q-tof/msesi)離子源，在正、負(fù)離子模式下，掃描范圍m/z100-1000；毛細(xì)管電壓3.0kv，錐孔電壓35kv，離子源溫度100℃，干燥氣溫度為450℃，干燥氣流速900l/h，錐孔氣流量50l/h。
4、數(shù)據(jù)處理分析和差異代謝結(jié)構(gòu)鑒定
將lc-ms得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入simca軟件(version13.0.2，umetrics)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)建立opls-da模型，尋找慢性炎癥組與對(duì)照組、濾泡水腫組與對(duì)照組、乳頭狀瘤組與對(duì)照組、腸腺瘤樣組與對(duì)照組之間代謝輪廓貢獻(xiàn)較大(vip＞1.0且p＜0.01)的代謝物，然后將這些代謝物的確切分子質(zhì)量數(shù)據(jù)提交至在線數(shù)據(jù)庫(kù)kegg(http://wwwkeg.com)、metlin(http://www.metlin.scipps.edu)、hmdb(http://www.hmdb.ca)搜尋，解析化合物質(zhì)譜，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終通過(guò)這些化合物標(biāo)準(zhǔn)品確證差異代謝物的結(jié)構(gòu)。
5、定量驗(yàn)證：采用質(zhì)譜對(duì)差異代謝物定量，測(cè)定差異代謝物在各組樣本中的濃度水平。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
質(zhì)譜定量結(jié)果顯示：與對(duì)照組比，慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組和腸腺瘤樣組血漿中甲基巴豆酰肉堿上調(diào)2.4～2.6倍，溶血磷脂酰乙醇胺下調(diào)0.5～0.6倍，花生四烯酸上調(diào)3.6～3.9倍；與對(duì)照組比，慢性炎癥組血漿中硫酸吲哚酚下調(diào)0.4～0.5倍，咖啡因上調(diào)1.8～2.0倍；與對(duì)照組比，濾泡水腫組血漿中溶血磷脂酰膽堿(18:1)下調(diào)0.5～0.6倍，鵝去氧膽酸上調(diào)2.7～2.8倍，神經(jīng)節(jié)苷脂上調(diào)2.3～2.5倍；與對(duì)照組比，乳頭狀瘤組血漿中溶血磷脂酰膽堿(18:1)下調(diào)0.5～0.6倍，磷脂酰絲氨酸下調(diào)0.5～0.6倍，磷酸二氫丙酮上調(diào)1.7～1.9倍；與對(duì)照組比，腸腺瘤樣組血漿中溶血磷脂酰膽堿(16:0)下調(diào)0.4～0.5倍，透明質(zhì)酸上調(diào)3.1～3.3倍。質(zhì)譜定量驗(yàn)證結(jié)果如表3所示。
表3差異性血漿代謝物的質(zhì)譜定量驗(yàn)證結(jié)果
第二部分：驗(yàn)證階段
血漿樣本：研究對(duì)象81例，年齡45～55歲，平均50.4歲；男42例，女39例。經(jīng)膀胱鏡確診分組：慢性炎癥組(慢性炎癥型20例，11m/9f)、濾泡水腫組(濾泡水腫型22例，11m/11f)、乳頭狀瘤組(乳頭狀瘤型21例，11m/10f)、腸腺瘤樣組(腸腺瘤樣型18例，8m/10f)。各病例均為初診，無(wú)藥物治療史。另有15例膀胱正常人為對(duì)照組。各組研究對(duì)象的年齡無(wú)顯著性差異。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝腎及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下層黏液腺體無(wú)異常增殖、無(wú)化生性病變的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周靜脈血血漿，采血時(shí)間均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。
其它試驗(yàn)材料和方法同篩選階段。
受試者工作特征曲線(roc)分析：構(gòu)建roc曲線來(lái)驗(yàn)證上述質(zhì)譜定量驗(yàn)證的差異代謝物對(duì)腺性膀胱炎診斷分型的能力。
結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積(auc)為0.958，靈敏度和特異性分別為96.6％和96.1％，單個(gè)應(yīng)用時(shí)roc曲線下面積均小于0.7；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用硫酸吲哚酚和咖啡因診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.952，靈敏度和特異性分別為96.3％和95.4％；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、鵝去氧膽酸和神經(jīng)節(jié)苷脂診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.962，靈敏度和特異性分別為95.8％和95.2％；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、磷脂酰絲氨酸和磷酸二氫丙酮診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.979，靈敏度和特異性分別為95.5％和96.0％；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(16:0)和透明質(zhì)酸診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人時(shí)，roc曲線下面積為0.981，靈敏度和特異性分別為96.7％和96.1％。由于甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸在慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組、腸腺瘤樣組中的上調(diào)或下調(diào)情況基本一致，所以僅通過(guò)甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸聯(lián)合應(yīng)用無(wú)法區(qū)分慢性炎癥組、濾泡水腫組、乳頭狀瘤組和腸腺瘤樣組。
上述結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用硫酸吲哚酚和咖啡因可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、鵝去氧膽酸和神經(jīng)節(jié)苷脂可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、磷脂酰絲氨酸和磷酸二氫丙酮可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(16:0)和透明質(zhì)酸可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腸腺瘤樣型患者與膀胱正常人。通過(guò)這13個(gè)血漿代謝物即可對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷并分型。roc曲線評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4roc曲線評(píng)價(jià)結(jié)果(血漿代謝物)
本實(shí)施例的貢獻(xiàn)：
本實(shí)施例證明，聯(lián)合應(yīng)用甲基巴豆酰肉堿、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分腺性膀胱炎患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用硫酸吲哚酚和咖啡因可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分慢性炎癥型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、鵝去氧膽酸和神經(jīng)節(jié)苷脂可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分濾泡水腫型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(18:1)、磷脂酰絲氨酸和磷酸二氫丙酮可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用溶血磷脂酰膽堿(16:0)和透明質(zhì)酸可以準(zhǔn)確診斷區(qū)分乳頭狀瘤型患者與膀胱正常人。通過(guò)這13個(gè)血漿代謝物即可對(duì)腺性膀胱炎進(jìn)行診斷并分型，可以將其制備成診斷區(qū)分腺性膀胱炎的診斷試劑。
上述實(shí)施例的作用在于具體介紹本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，不應(yīng)將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于該具體實(shí)施例。
sequencelisting
<110>南京拓睿譜基因科技有限公司
<120>生物標(biāo)記用于制備腺性膀胱炎診斷試劑的用途
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