本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多指標(biāo)活性成分測(cè)定的前列欣膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

前列欣膠囊收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版(一部)，主要由桃仁(炒)、沒(méi)藥(炒)、丹參、赤芍、紅花、澤蘭、王不留行(炒)、皂角刺、敗醬草、蒲公英、川楝、白芷、石韋、枸杞子等藥味組成，具有活血化瘀、清熱利濕的功效，臨床用于治療瘀血凝聚，濕熱下注所致的慢性前列腺炎及前列腺增生的癥狀，療效顯著，應(yīng)用廣泛。

目前，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)僅采用薄層色譜法結(jié)合對(duì)照品芍藥苷和對(duì)照藥材沒(méi)藥、白芷進(jìn)行鑒別，或采用高效液相色譜法測(cè)定歐前胡素的含量，質(zhì)控指標(biāo)單一，不能全面反應(yīng)中藥方劑多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。而目前有關(guān)前列欣膠囊化學(xué)成分分析測(cè)定的研究?jī)H僅針對(duì)其中某一成分進(jìn)行分析，如季國(guó)明等使用HPLC測(cè)定前列欣膠囊中歐前胡素的含量；倫立軍等則通過(guò)HPLC法測(cè)定前列欣膠囊中芍藥苷的的含量，史雪紅等同樣采用HPLC法測(cè)定了前列欣膠囊中丹酚酸B的含量，如前所述，這些研究?jī)H針對(duì)前列欣膠囊中的某一成分進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)際上根本無(wú)法反映藥劑整體質(zhì)量，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)成藥的質(zhì)量控制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于多指標(biāo)活性成分測(cè)定的前列欣膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，該方法通過(guò)高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確測(cè)定前列欣膠囊多種化學(xué)成分并結(jié)合HPLC指紋圖譜技術(shù)，從而全面地對(duì)前列欣膠囊的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性及臨床用藥的有效性與安全性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于多指標(biāo)活性成分測(cè)定的前列欣膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，包括基于高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定前列欣膠囊中八種活性成分和構(gòu)建前列欣膠囊HPLC指紋圖譜；其中，所述八種活性成分分別為沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、王不留行黃酮苷、異槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A和隱丹參酮。

上述基于高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)前列欣膠囊中八種活性成分進(jìn)行測(cè)定，包括如下步驟：

(1)取出前列欣膠囊中藥粉，稱取一定量藥粉待用；

(2)向步驟(1)中的藥粉中加入100％色譜甲醇，超聲提取后搖勻過(guò)濾，濾液過(guò)0.22μm微孔濾膜后得待測(cè)液；采用純色譜甲醇作為提取溶劑時(shí)，色譜峰較多，各峰分布均勻，峰強(qiáng)度好；

(3)分別精密稱取一定量沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、王不留行黃酮苷、異槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮對(duì)照品，加甲醇溶解，定容至刻度，配成各化合物質(zhì)量濃度為1mg·mL^-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液；使用時(shí)，分別移取8種對(duì)照品溶液制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并按一定比例逐級(jí)稀釋成不同濃度，待用；

(4)定性檢測(cè)：采用高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定步驟(2)中的待測(cè)液，根據(jù)精確分子質(zhì)量、相對(duì)保留時(shí)間，確定待測(cè)液中的八種活性成分；

(5)定量檢測(cè)：采用高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分別測(cè)定步驟(2)中的待測(cè)液和步驟(3)中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用外標(biāo)法對(duì)待測(cè)液中的八種活性成分進(jìn)行定量檢測(cè)。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述藥粉與色譜甲醇的質(zhì)量體積比為1g：15-20mL，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述藥粉與色譜甲醇的質(zhì)量體積比為1g：20mL；

超聲處理?xiàng)l件為：超聲功率300～320W，頻率30～40kHz，處理時(shí)間為30～60min；

優(yōu)選的，所述步驟(4)或(5)中高效液相色譜的的色譜條件為：Kromasil 100-5C₁₈色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流速為0.8mL·min^-1；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.8％甲酸水溶液(B)；梯度洗脫；進(jìn)樣量為10μL。

本研究表明采用Kromasil 100-5C₁₈色譜柱前列欣膠囊提取物中各化合物分離效果較好，同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分色譜峰的拖尾現(xiàn)象，因此考察了流動(dòng)相加入不同比例弱酸(0.2％甲酸、0.4％甲酸、0.6％甲酸、0.8％甲酸)對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果表明，水相中加入0.8％甲酸時(shí)各色譜峰分離度較好，峰型尖銳；同時(shí)經(jīng)紫外檢測(cè)器考察樣品在不同波長(zhǎng)(190～400nm)下的色譜圖，結(jié)果表明，選擇300nm時(shí)，樣品HPLC色譜峰較多，基線穩(wěn)定，因此，選擇300nm作為樣品指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述梯度洗脫程序具體為：0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A。

優(yōu)選的，所述步驟(4)或(5)中質(zhì)譜條件為：分別采用電噴霧正、負(fù)離子模式；全掃描范圍m/z 100-1000；毛細(xì)管電壓：4.0kV；噴霧氣壓：310.28Kpa；干燥氣流速：10.0L·min^-1；干燥氣溫度：325℃；裂解電壓：100V；錐孔電壓：60V。

上述構(gòu)建前列欣膠囊HPLC指紋圖譜的方法，包括如下步驟：

(1)供試品溶液的配置：取出前列欣膠囊中藥粉，稱取一定量藥粉；向藥粉中加入色譜甲醇，超聲提取后搖勻過(guò)濾，濾液過(guò)0.22μm微孔濾膜后得供試品溶液；

(2)高效液相色譜HPLC分析：Kromasil 100-5C₁₈色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.8％甲酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A；流速為0.8mL·min^-1；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；進(jìn)樣量為10μL；

(3)測(cè)定10批前列欣膠囊樣品并進(jìn)行分析比較，得到由其共有特征峰構(gòu)成的前列欣膠囊HPLC的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

優(yōu)選的，所述前列欣膠囊HPLC的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜具有的34個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間t_R分別為：7.40min,8.20min,10.77min,20.10min,20.88min,22.77min,24.62min,26.59min,27.39min,33.81min,36.50min,37.69min,39.03min,40.56min,42.69min,44.65min,48.36min,51.56min,57.52min,59.41min,64.88min,67.59min,68.71min,72.20min,72.69min,74.11min,74.50min,76.79min,78.43min,79.74min,81.32min,84.84min,91.04min,91.79min。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述前列欣膠囊HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的前列欣膠囊HPLC的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明同時(shí)采用高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定前列欣膠囊中八種活性成分并構(gòu)建前列欣膠囊HPLC指紋圖譜同時(shí)用于對(duì)前列欣膠囊藥品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，二者相互印證，從而更全面地反映前列欣膠囊藥品的質(zhì)量，有利于研究和保證前列欣膠囊藥品原料及制劑的質(zhì)量。所述檢測(cè)方法靈敏可靠，比目前已有的前列欣膠囊藥品分析方法有更強(qiáng)更全面的分析能力，能夠有效提高對(duì)前列欣膠囊藥品成品的質(zhì)控水平，對(duì)于保證臨床用藥的有效性和安全性具有積極的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為對(duì)照品(A)、前列欣膠囊(B)樣品的HPLC圖；

其中，1-沒(méi)食子酸色譜峰；2-綠原酸色譜峰；3-咖啡酸色譜峰；4-王不留行黃酮苷色譜峰；5-異槲皮苷；6-丹酚酸B；7.丹酚酸A色譜峰；8-隱丹參酮色譜峰；

圖2為10批前列欣膠囊的HPLC指紋圖譜疊加圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1

1儀器與材料

安捷倫1260高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器、梯度泵、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(SARTOURIUS BSA)、指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件為“中藥色譜指紋相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(國(guó)家藥典委員會(huì)2004A)；SB-5200D型高功率數(shù)控超聲波儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

色譜柱：美國(guó)Agilent ZORBAX SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，瑞典Kromasil 100-5C₁₈(4.6mm×250mm,5μm)。沒(méi)食子酸(批號(hào)149-91-7)、綠原酸(批號(hào)327-97-9)、咖啡酸(批號(hào)331-39-5)、王不留行黃酮苷(批號(hào)53452-16-7)、異槲皮苷(批號(hào)482-35-9)、丹酚酸B(批號(hào)115939-25-8)、丹酚酸A(批號(hào)96574-01-5)、隱丹參酮(批號(hào)35825-57-1)，標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98％，均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)，乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific)，無(wú)水乙醇(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，甲酸、磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為密理博超純水(18MΩ)。10批樣品購(gòu)于濟(jì)南市各大藥店，樣品信息見(jiàn)表1。

表1樣品來(lái)源

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1供試品溶液的制備

取前列欣膠囊粉末0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入10mL色譜甲醇，超聲提取30min(提取功率320W，頻率40kHz)，搖勻，過(guò)濾，濾液過(guò)0.22μm微孔濾膜后作為供試品溶液，備用。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取1.0mg沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、王不留行黃酮苷、異槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮對(duì)照品，置1mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成各化合物質(zhì)量濃度為1mg·mL^-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液。分別吸取100μL的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存溶液，置于同一容量瓶(1mL)中，用甲醇定容至刻度，備用。

2.3色譜條件

瑞典Kromasil 100-5C₁₈色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.8％甲酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A)；流速為0.8mL·min^-1；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；進(jìn)樣量為10μL。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4質(zhì)譜條件

進(jìn)入高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜的流動(dòng)相采用三通分流至0.4mL·min^-1。分別采用電噴霧正、負(fù)離子模式；全掃描范圍m/z 100-1000；毛細(xì)管電壓：4.0kV；噴霧氣壓：310.28Kpa；干燥氣流速：10.0L·min^-1；干燥氣溫度：325℃；裂解電壓：100V；錐孔電壓：60V。

3結(jié)果與討論

3.1ESI-TOF/MS鑒別

根據(jù)獲得的化合物的精確分子量和相對(duì)保留時(shí)間信息，DAD檢測(cè)器獲得的紫外吸收信息，并參考相關(guān)文獻(xiàn)及中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)各化合物進(jìn)行鑒別。鑒別結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行了對(duì)比，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性(結(jié)果見(jiàn)表2)。

表2 ESI-TOF/MS精確質(zhì)量測(cè)量結(jié)果

3.2八種活性成分定量測(cè)定

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 將“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液稀釋到37.5、25、12.5、5、2.5、1.25μg·mL^-1，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液中各化合物的峰面積，以各化合物質(zhì)量濃度(μg·mL^-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程(見(jiàn)表3)。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至低濃度進(jìn)樣，以3倍信噪比計(jì)算各成分的檢測(cè)下限，以10倍信噪比計(jì)算定量下限，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)良好，方法靈敏度較高，可以滿足前列欣膠囊提取物中各活性組分的含量測(cè)定。

表3 8種化合物的回歸方程、線性范圍及檢測(cè)下限、定量下限

3.2.2精密度試驗(yàn) 取S1號(hào)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其中8個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，分別計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，其特征峰保留時(shí)間RSD依次是0.24％、0.14％、0.13％、0.11％、0.03％、0.03％、0.02％、0.01％，均小于1％，峰面積RSD依次是1.79％、1.90％、2.51％、1.21％、2.74％、3.14％、0.47％、0.96％，均小于5％，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.2.3重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下處理方法制成供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得8個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果8個(gè)特征峰保留時(shí)間RSD依次是0.52％、0.24％、0.25％、0.18％、0.12％、0.13％、0.12％、0.02％，均小于1％，峰面積RSD依次是2.63％、1.31％、1.56％、2.69％、1.16％、1.28％、1.97％、1.25％，均小于5％，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

3.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)供試品溶液按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果8個(gè)特征峰保留時(shí)間RSD依次是0.33％、0.15％、0.15％、0.12％、0.05％、0.04％、0.03％、0.01％，均小于1％，峰面積RSD依次是1.83％、2.07％、2.23％、1.28％、2.26％、3.16％、2.73％、1.72％，均小于5％，表明樣品在24h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

3.2.5回收率試驗(yàn) 精密稱取已知各目標(biāo)化合物含量的前列欣膠囊樣品0.25g，分別準(zhǔn)確加入沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、王不留行黃酮苷、異槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮對(duì)照品適量，按照供試品溶液制備方法處理3份，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各目標(biāo)化合物峰面積，計(jì)算平均加樣回收率(n＝3)分別為95.25％、96.85％、98.10％、96.71％、97.87％、95.80％、97.57％、96.74％；RSD分別為3.38％、2.82％、3.95％、2.15％、3.02％、2.86％、3.30％、2.24％，見(jiàn)表4。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本方法的回收率良好。

表4加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

3.2.6樣品測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，獲得10批前列欣膠囊樣品中8種化合物色譜峰面積，將測(cè)得結(jié)果帶入表2線性回歸方程，計(jì)算前列欣膠囊樣品中8種化合物的含量(見(jiàn)表5)。從表中可以看出，不同批次樣品中各化合物含量平均值在84.46～615.36μg·g^-1之間，其RSD在1.32％～2.93％之間，說(shuō)明不同批次樣品中各活性成分含量差異不大。

表5樣品中8種化合物含量測(cè)定結(jié)果(μg·g^-1，n＝10)

3.3前列欣膠囊HPLC指紋圖譜

3.3.1指紋圖譜建立和共有峰標(biāo)定取10批不同批次的前列欣膠囊樣品，按“2.1”項(xiàng)下處理方法將其制備成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，建立前列欣膠囊的HPLC指紋圖譜(見(jiàn)圖2)。在本研究所建立的分析系統(tǒng)下，各樣品中分離度較好且穩(wěn)定出現(xiàn)的峰有34個(gè)(見(jiàn)圖2)，相對(duì)保留時(shí)間t_R分別為：7.40min,8.20min,10.77min,20.10min,20.88min,22.77min,24.62min,26.59min,27.39min,33.81min,36.50min,37.69min,39.03min,40.56min,42.69min,44.65min,48.36min,51.56min,57.52min,59.41min,64.88min,67.59min,68.71min,72.20min,72.69min,74.11min,74.50min,76.79min,78.43min,79.74min,81.32min,84.84min,91.04min,91.79min。計(jì)算結(jié)果表明，各色譜峰保留時(shí)間的RSD％均在1％以內(nèi)，而峰面積的RSD均在5％以內(nèi)，說(shuō)明不同批次前列欣膠囊中各共有峰重現(xiàn)性較好，可以選為指紋圖譜的共有峰用于其質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.3.2相似度評(píng)價(jià) 通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(國(guó)家藥典委員會(huì)2004A版)對(duì)10批前列欣膠囊的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，選定上述34個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，采用共有模式作為對(duì)照指紋圖譜，用于10批前列欣膠囊相似度評(píng)價(jià)，分別采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法用于其相似度計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

從表中可以看出，不同批次前列欣膠囊的相似度較為接近，說(shuō)明其質(zhì)量差別不大，所得結(jié)果與多指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果一致，可與之相互印證，有效提高對(duì)前列欣膠囊藥品成品的質(zhì)控水平，對(duì)于保證臨床用藥的有效性和安全性具有積極的意義。

上述雖然結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。