本發(fā)明涉及一種靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，屬于臨床體外檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

丙酮酸是糖酵解途徑產(chǎn)物，在正常情況下通過三羧酸循環(huán)氧化成CO2和水，使血內(nèi)乳酸/丙酮酸比值維持在9左右，當(dāng)機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，丙酮酸則被還原成乳酸，該比值上升，缺氧越嚴(yán)重比值越高；該比值測(cè)定可推測(cè)循環(huán)衰竭的嚴(yán)重程度；輕微的活動(dòng)會(huì)引起乳酸和丙酮酸同時(shí)升高，但比值不變。血液丙酮酸的測(cè)定主要用于維生素B1缺乏癥的診斷，維生素B1的焦磷酸酯是丙酮酸在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步氧化分解為乙酰輔酶A時(shí)的脫羧輔酶；維生素B1缺乏時(shí)，體內(nèi)丙酮酸的氧化發(fā)生障礙，使丙酮酸的含量增加。血中丙酮酸增高還見于糖尿病、心力衰竭、腹瀉，嚴(yán)重肝損傷、急性感染等病癥中。

目前監(jiān)測(cè)丙酮酸的方法比較多，有液相分析法、二硝基苯腙法、化學(xué)發(fā)光法、酶法，其中二硝基苯腙法出現(xiàn)的較早，但是為手工操作，且特異性較差，使用較少，而液相和化學(xué)發(fā)光有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是成本較高，隨著對(duì)丙酮酸檢測(cè)方法的不斷推進(jìn)和全自動(dòng)生化分儀的普及，酶法檢測(cè)血丙酮酸的研究越來越多，酶法檢測(cè)丙酮酸有兩種方法一種是基于過氧化物酶TRINDER反應(yīng)，而另一種是基于丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下NADH被氧化成NAD，前者反應(yīng)較為復(fù)雜，且由于TRINDER反應(yīng)本身固有的抗干擾問題一直非常突出，使用往往受到樣本的限制，后者反應(yīng)簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，一直受到人們的青睞，但是由于人體中丙酮酸的含量一般非常的少，在使用時(shí)由于分析靈敏度不夠容易導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，因此根據(jù)這個(gè)問題，發(fā)明了一種分析靈敏度高的酶法檢測(cè)丙酮酸檢測(cè)試劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，以及檢測(cè)方法。

檢測(cè)原理：

在乳酸脫氫酶（LDH）的存在下，NADPH與丙酮酸反應(yīng)，NADPH被氧化成NADP，在波長(zhǎng)340nm處吸光度的降低與丙酮酸的含量成正比。

見圖1。

一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑試劑組成成分如下：

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

試劑 R1：

緩沖液 10mmol/L

NADPH 2mmol/L-5mmol/L

保護(hù)劑 1g/L-3g/L

表面活性劑 1 2ml/L-5ml/L

表面活性劑 2 0.5ml/L-0.75ml/L

氯化鋰 0.1g/L-0.5g/L

金屬螯合劑 1mmol/L-5mmol/L

疊氮鈉 0.1g/L-1g/L

試劑 R2：

緩沖液 100mmol/L

保護(hù)劑 5g/L-10g/L

乳酸脫氫酶 2KU/L-5KU/L

疊氮鈉 0.1g/L-1g/L。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R1中緩沖液為25℃，PH=9.5的濃度為10mmol/L的TRIS緩沖液。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R2中緩沖液為25℃，PH=6.5的濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R1中所述保護(hù)劑為殼聚糖。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R1所述表面活性劑1為Surfynol 485(上海西寶生物)。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R1所述表面活性劑2為Zonyl FSN 100(上海西寶生物)。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R1所述金屬螯合劑為二羥乙基甘氨酸(DEG)。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，試劑R2所述保護(hù)劑為海藻糖。

所述的一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑，使用全自動(dòng)生化分析儀利用終點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)主波長(zhǎng)為340nm。

所述的試劑為液態(tài)雙試劑，試劑比例為3:1。

本發(fā)明的創(chuàng)新之處如下：

1）本發(fā)明為雙試劑，本發(fā)明優(yōu)先選擇更加靈敏的NADPH作為底物替代原有的NADH，大大提高了反應(yīng)的效率，提高反應(yīng)的靈敏度；

2）在試劑1中選擇添加了A和B兩種表面活性劑，兩種表面活性劑的同時(shí)加入能夠提高反應(yīng)液體在340波長(zhǎng)下顏色的變化的明顯程度，且能夠使體系中的顏色在完成變化后保持顏色的穩(wěn)定性；

3）在試劑1中優(yōu)先選擇了二羥乙基甘氨酸(DEG)，作為重金屬離子的螯合劑，能夠有效的防止重金屬離子對(duì)NADPH的干擾，且添加了殼聚糖來保護(hù)NADPH的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1是丙酮酸反應(yīng)原理圖；

圖2是12個(gè)不同低濃度梯度的丙酮酸四種方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明

實(shí)施例1

本實(shí)施例描述的是一種現(xiàn)有的丙酮酸檢測(cè)試劑的配方：

試劑1（R1）:

磷酸鹽緩沖液 100mmol/L，PH=8.0；

NADH 2.5mmol/L；

疊氮鈉 0.5g/L；

試劑 R2：

磷酸鹽緩沖液 100mmol/L，PH=7.0；

乳酸脫氫酶 2KU/L；

疊氮鈉 0.5g/L；

實(shí)施例2

本實(shí)施例描述的是一種分析靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑的配方：

試劑 R1：

TRIS 10mmol/L；

NADPH 2mmol/L；

殼聚糖 1g/L；

Surfynol 485 2ml/L；

Zonyl FSN 100 0.5ml/L；

氯化鋰 0.1g/L；；

二羥乙基甘氨酸(DEG) 1mmol/L；

疊氮鈉 0.1g/L；

試劑 R2：

磷酸鹽緩沖液 100mmol/L；

海藻糖 5g/L；

乳酸脫氫酶 2KU/L；

疊氮鈉 0.1g/L；

實(shí)施例3

本實(shí)施例所描述的是一種關(guān)鍵原材料增加后的靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑的配方；

試劑 R1：

TRIS 10mmol/L；

NADPH 5mmol/L；

殼聚糖 3g/L；

Surfynol 485 5ml/L；

Zonyl FSN 100 0.75ml/L；

氯化鋰 0.5g/L；

二羥乙基甘氨酸(DEG) 5mmol/L；

疊氮鈉 1g/L；

試劑 R2：

磷酸鹽緩沖液 100mmol/L；

海藻糖 10g/L；

乳酸脫氫酶 5KU/L；

疊氮鈉 1g/L。

本實(shí)施例描述的是一種關(guān)鍵原材料增加后的靈敏度高的丙酮酸檢測(cè)試劑的靈敏度的驗(yàn)證方法，將本實(shí)施例的配方、實(shí)施例1中的配方、實(shí)施例2的配方和化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行同步檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。

試驗(yàn)的具體操作方法：選取12個(gè)已知不同濃度的丙酮酸樣本，然后將十二個(gè)不同的樣本分別使用本實(shí)施例的配方、實(shí)施例1中的配方、實(shí)施例2的配方和化學(xué)發(fā)光法，其中實(shí)施例1、實(shí)施例2和本實(shí)施例的試劑借助全自動(dòng)生化分析儀器，化學(xué)發(fā)光法借助化學(xué)發(fā)光儀對(duì)不同濃度的同一丙酮酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：實(shí)施例1中檢測(cè)結(jié)果在低值部分很難檢測(cè)出結(jié)果多出現(xiàn)0值，甚至出現(xiàn)負(fù)值，由此可見試劑的分析靈敏度不夠，而實(shí)施例2和本實(shí)施例中檢測(cè)結(jié)果與靈敏度較高的化學(xué)發(fā)光法相比較，檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好，與理論濃度偏差較小，并且在非常低的濃度下也能夠檢測(cè)出，說明發(fā)明具有較高的靈敏度。