本發(fā)明屬于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法，特別是一種利用13C-PLFA測(cè)定土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的方法。

背景技術(shù)：

厭氧氨氧化作用(ANAMMOX-Anaerobic ammonium oxidation)是指在厭氧條件下，微生物以NO₂^-為電子受體，NH₄⁺為電子供體，將NH₄⁺、NO₂^-轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨(dú)獾纳^(guò)程。1977年Broda從化學(xué)熱力學(xué)出發(fā)，計(jì)算其與生物的進(jìn)化關(guān)系時(shí)，大膽預(yù)言了Anammox過(guò)程的存在。第一個(gè)被命名的厭氧氨氧化的菌株是從一個(gè)生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)室富集培養(yǎng)菌株中利用物理方法珀可梯度離心法分離得到的。隨后Vande Graaf等人證實(shí)了厭氧氨氧化過(guò)程的存在。在這一過(guò)程中起作用的厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)氧極度敏感、生長(zhǎng)非常緩慢，并且在較高細(xì)菌濃度條件下才表現(xiàn)出厭氧氨氧化活性，因此用傳統(tǒng)的微生物分離、純化培養(yǎng)方法研究厭氧氨氧化菌非常困難。但隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，有許多新方法被引入到土壤微生物分析中。在分析環(huán)境樣品中厭氧氨氧化菌群落組成時(shí)，常常采用克隆、測(cè)序構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)的方法。該方法避免了對(duì)厭氧氨氧化菌純培養(yǎng)的要求，但是構(gòu)建克隆文庫(kù)工作量大，費(fèi)用高，不能實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的快速分析。

克隆和DGGE是研究微生物群落結(jié)構(gòu)常用的方法，但這兩種方法均僅能體現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)之間的相似性與差異性，若想確切分析各微生物含量，則需結(jié)合其他技術(shù)。磷脂脂肪酸(PLFA)是微生物細(xì)胞膜的主要成分，因微生物不同其PLFA組成與結(jié)構(gòu)各異，不同的磷脂脂肪酸指示不同的微生物，因此將PLFA與穩(wěn)定同位素標(biāo)記相結(jié)合并通過(guò)特定的厭氧氨氧化培養(yǎng)過(guò)程中，則可以更好地分析厭氧氨氧化過(guò)程中參與代謝的各土壤微生物含量，經(jīng)分析后可知厭氧氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法；本發(fā)明將¹³C標(biāo)記的尿素與PLFA結(jié)合并進(jìn)行厭氧培養(yǎng)來(lái)分析土壤厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的方法，該方法不僅對(duì)試驗(yàn)條件要求低、穩(wěn)定性好，并且靈敏性高、定量準(zhǔn)確性強(qiáng)，能精確地檢測(cè)出在厭氧氨氧化過(guò)程中具有活性、參與反應(yīng)的微生物的群落結(jié)構(gòu)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法，包括以下步驟：

設(shè)置6個(gè)容器，每個(gè)容器分別依次進(jìn)行如下的步驟1)～步驟4)：

1)、在容器中裝入待測(cè)土壤和¹³C-尿素溶液，均勻攪拌，從而使土壤中¹³C-尿素-N的濃度達(dá)到200mg/kg；

備注說(shuō)明：¹³C-尿素進(jìn)入土壤后在土壤脲酶的作用下水解為銨和¹³CO₂，為厭氧氨氧化提供了無(wú)機(jī)能源，厭氧氨氧化菌為化能自養(yǎng)型直接利用了¹³CO₂，通過(guò)¹³C-PLFAs檢測(cè)土壤厭氧氨氧化的群落結(jié)構(gòu)；

2)、向步驟1)所得的土壤中加入KNO₃溶液，均勻攪拌，從而使土壤中NO₃^－-N濃度達(dá)200mg/kg；

3)、向步驟2)所得的土壤中加水(迅速加水)調(diào)至泥漿態(tài)，并封閉容器；

4)、用惰性氣體替換掉容器中的空氣，然后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱進(jìn)行厭氧30±1℃培養(yǎng)；

5)、將步驟4)所得的6個(gè)容器分別培養(yǎng)1～2h，1d，3d，7d，10d，直至NO₃^--N、NH₄⁺-N值穩(wěn)定的那天；

對(duì)6個(gè)培養(yǎng)階段對(duì)應(yīng)的容器分別進(jìn)行內(nèi)容：

取土(例如5g)，使用SKALAR連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤NO₃^--N和NH₄⁺-N含量；

例如，具體可為：將SKALAR連續(xù)流動(dòng)分析儀中氮?dú)馄块_(kāi)氮?dú)庵?.2MPa,松開(kāi)流量計(jì)值45單位，開(kāi)加熱器，并打開(kāi)主機(jī)99℃的加熱器，使用SKALAR連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤NO₃^--N和NH₄⁺-N含量；

備注說(shuō)明：容器中剩余的土壤可直接進(jìn)行下述步驟，如果不是及時(shí)進(jìn)行下述步驟，也可暫時(shí)放入-18℃保存；

6)、根據(jù)NO₃^--N，NH₄⁺-N的含量變化速率，選取變化速率最高的培養(yǎng)階段所對(duì)應(yīng)的容器中的土壤，提取其中的PLFA(磷脂脂肪酸)；

變化速率最高的培養(yǎng)階段的判斷規(guī)則為：6個(gè)培養(yǎng)階段的土壤在相同培養(yǎng)時(shí)間(單位培養(yǎng)時(shí)間)內(nèi)NO₃^--N，NH₄⁺-N的濃度下降值最高的培養(yǎng)階段為變化速率最高的培養(yǎng)階段，若NO₃^--N，NH₄⁺-N的變化速率不一致，則取二者變化速率的均值最大的為變化速率最高的培養(yǎng)階段；

備注說(shuō)明：上述單位培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)NO₃^--N，NH₄⁺-N的濃度下降值可依據(jù)常規(guī)的利用Origin擬合曲線后，據(jù)Origin中Analysis-Mathematics-Differentiate的方法，即能輕易檢測(cè)獲得；

7)、通過(guò)氣相色譜-燃燒-同位素比率質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-c-IRMS)測(cè)定提取出的PLFA中¹³C的豐度D¹³C，¹³C的豐度即¹³C標(biāo)記的磷脂脂肪酸的豐度。

備注說(shuō)明：¹³C標(biāo)記的磷脂脂肪酸可以指示參與厭氧氨氧化過(guò)程的微生物，即可知厭氧氨氧化微生物的豐度，進(jìn)而分析得出群落結(jié)構(gòu)，所以可以根據(jù)¹³C的豐度得出土壤厭氧氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)。

作為本發(fā)明的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法的改進(jìn)：

所述步驟1)中，每個(gè)容器中加入30g新鮮的待測(cè)土壤和1.2mL濃度為5g/L的¹³C-尿素溶液；

所述步驟2)中，每個(gè)容器中加入1.2mL濃度為5g/L的KNO₃溶液。

作為本發(fā)明的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟6)中提取PLFA的方法(采用修進(jìn)后的布萊和戴爾方法，布萊和戴爾方法僅應(yīng)用于于食品，且只能確定總脂類含量，修進(jìn)后的方法提取和分離出了磷脂脂肪酸來(lái)確定土壤微生物結(jié)構(gòu))包括以下步驟：

在土壤(或凍干土壤)加入氯仿：甲醇：檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液(0.15M，ph4.0)(1:2:0.8v/v/v)進(jìn)行提取；

將提取物(即，提取液)轉(zhuǎn)移至硅膠固相萃取柱后分別用氯仿和丙酮洗去中心脂和糖脂后，用甲醇將磷脂洗脫；洗脫后的磷脂添加內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯(C19:0)后，通過(guò)溫和堿性甲基化方法將脂肪酸甲基化為相應(yīng)的脂肪酸甲酯(FAMES)。溫和堿性甲基化方法，即，在含有磷脂的試管中加入1mL的甲醇甲苯混合液(甲醇：甲苯＝1:1)和1mL 0.2M的KOH甲醇溶液，放入37℃的水浴鍋中加熱進(jìn)行甲酯化后，加入2mL水、0.3mL冰醋酸，再用正己烷氯仿混合液(兩次，每次2mL，正己烷：氯仿＝4：1)萃取磷脂脂肪酸甲酯，并用氮?dú)獯蹈傻玫街舅峒柞ァ?/p>

備注說(shuō)明：脂肪酸甲酯(FAMES)與PLFA(磷脂脂肪酸)的關(guān)系為甲醇分解磷脂脂肪酸得脂肪酸甲酯，因此，在獲知脂肪酸甲酯的量的前提下能輕易獲得PLFA(磷脂脂肪酸)的量。

作為本發(fā)明的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟7)為：

利用步驟6)所得脂肪酸甲酯經(jīng)氣相色譜(GC)分離，具體為：首先打開(kāi)氮?dú)鈿馄康目傞y，調(diào)節(jié)壓力至0.5MPa，打開(kāi)空氣發(fā)生器、氫氣發(fā)生器電源，向氣瓶供氣；打開(kāi)流量控制器機(jī)殼，調(diào)節(jié)壓力與流量，調(diào)節(jié)氫氣與空氣的壓力為50KPa，載氣壓力為70KPA，總氣壓為300KPa，調(diào)節(jié)尾吹至30ml/min后進(jìn)樣；分離之后由相連接的火陷離子檢測(cè)器(FID)檢測(cè)(儀器為美國(guó)Agilent公司，系統(tǒng)中存有美國(guó)MIDI公式的磷脂脂肪酸數(shù)據(jù)庫(kù))，以此進(jìn)行脂肪酸的定量；單個(gè)PLFA的¹³C/¹²C由氣相色譜－燃燒法－穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(GC-C-IRMS)進(jìn)行測(cè)定，其中Delta V同位素比質(zhì)儀連有TraceGCUltra氣相色譜、GC Combustion III(所有設(shè)備為德國(guó)Thermo Finnigan公司)；

PLFA單體的量按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

Mi＝dilution×(P_FAME×ng Std)/(P_ISTD×W) (1)

(1)式中，Mi為單個(gè)磷脂脂肪酸(PLFA)的量(以干土計(jì))，單位為μg/g；P_FAME為樣品峰面積；P_ISTD為內(nèi)標(biāo)(methyl ester C19:0，6.2ng/μL)峰面積；P_FAME及P_ISTD由由氣相色譜儀獲得；ng Std為內(nèi)標(biāo)的濃度(6.2ng/μL)；dilution為稀釋倍數(shù)；W為烘干土干重(以干土計(jì))，3g。

各個(gè)脂肪酸中C來(lái)源于尿素-C的量(Pi，μg/g)用公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

Pi＝Mi*(δ¹³C_c-δ¹³C_control)/(δ¹³C_M-δ¹³C_control) (2)

其中，Mi是單個(gè)PLFA的濃度，由公式(1)算得，δ¹³C_c和δ¹³C_control是標(biāo)記前和標(biāo)記后單個(gè)脂肪酸的δ¹³C，δ¹³C_M是添加尿素的δ¹³C，由同位素比質(zhì)儀得。

各土壤中PLFA總的¹³C富集比例(p_t)即¹³C的豐度D¹³C用下式(3)進(jìn)行計(jì)算：

p_t＝∑Pi/∑Mi (3)

其中Mi是單個(gè)脂肪酸中C的含量(μg/kg)。

作為本發(fā)明的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟1)中，容器為100mL的玻璃螺口培養(yǎng)瓶，用軟橡膠塞加塞實(shí)現(xiàn)密封。該玻璃螺口培養(yǎng)瓶例如為：底部直徑約4.5cm，口徑約1.3cm，甁身高約9.5cm。

作為本發(fā)明的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟3)中，每30g土壤加水5～7ml(較佳為6mL)。

本發(fā)明明確了土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法，同時(shí)也可以作為底泥、污泥反應(yīng)器、濕地等環(huán)境中厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)的參考。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是菜園土NO₃^--N,NH₄⁺-N趨勢(shì)圖；

圖2是菜園土¹³C–PLFA圖譜；

圖3是無(wú)機(jī)肥處理水稻土NO₃^--N,NH₄⁺-N趨勢(shì)圖；

圖4是無(wú)機(jī)肥處理水稻土¹³C–PLFA圖譜；

圖5是有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理水稻土NO₃^--N,NH₄⁺-N趨勢(shì)圖；

圖6是有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理水稻土¹³C-PLFA圖譜；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

下面實(shí)例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法的可行性和應(yīng)用效果。

實(shí)施例1、菜園土中土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法，依次進(jìn)行以下步驟：

準(zhǔn)備6個(gè)100mL培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶分別進(jìn)行如下的步驟1)～步驟4)：

1)、在每個(gè)培養(yǎng)瓶加入30g新鮮的待測(cè)土壤，吸取鮮配的1.2mL濃度為5g/L的¹³C-尿素溶液均勻?yàn)⒂诿總€(gè)培養(yǎng)瓶的土壤中并迅速攪拌混勻，使土壤中¹³C-尿素-N的濃度達(dá)到約200mg/kg；

2)、吸取1.2mL濃度為5g/L的KNO₃溶液均勻?yàn)⒂诓襟E1)所得的培養(yǎng)瓶土壤中，并攪拌混勻使NO₃^－-N濃度約達(dá)200mg/kg；

3)、迅速加水6ml調(diào)至泥漿態(tài)并加橡皮塞封閉100mL培養(yǎng)瓶；

4)、用注射器向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)充惰性氣體He趕走空氣，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱進(jìn)行厭氧30℃培養(yǎng)。

5)、將步驟4)所得的6個(gè)容器分別培養(yǎng)1～2h，1d，3d，7d，10d，直至NO₃^--N,NH₄⁺-N值穩(wěn)定的那天(約14天)；

對(duì)6個(gè)培養(yǎng)階段對(duì)應(yīng)的容器分別進(jìn)行內(nèi)容：

破壞性取土，每個(gè)培養(yǎng)瓶各取5g土，于150ml震蕩瓶中，加50ml 1mol/L KCl浸提液在20℃，180r/s震蕩1小時(shí)，過(guò)濾上機(jī)測(cè)定，將SKALAR連續(xù)流動(dòng)分析儀中氮?dú)馄块_(kāi)氮?dú)庵?.2Mpa，松開(kāi)流量計(jì)值45單位，開(kāi)加熱器，并打開(kāi)主機(jī)99℃的加熱器，使用SKALAR連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NO₃^--N，NH₄⁺-N，每個(gè)培養(yǎng)瓶中剩余的土壤(25g)可放入-18℃冰箱保存(也可即可直接進(jìn)行后續(xù)步驟)。

測(cè)得NO₃^--N，NH₄⁺-N濃度結(jié)果如圖1所示，將該結(jié)果依據(jù)常規(guī)的在利用Origin擬合曲線后，據(jù)Origin中Analysis-Mathematics-Differentiate的方法進(jìn)行運(yùn)算，NO₃^--N，NH₄⁺-N濃度下降速率均最快的前兩天為培養(yǎng)后第7天及第14天。

6)、取-18℃冰箱保存的培養(yǎng)后7天及14天的土壤用修進(jìn)的布萊和戴爾方法提取PLFA。向3.0g(凍干土壤樣本)中加入15.2ml的氯仿：甲醇：檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液(0.15M，ph4.0)(1:2:0.8v/v/v)進(jìn)行提取(250rpm、室溫、提取2h)，在提取所得的殘?jiān)屑尤?.6ml的氯仿：甲醇：檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液(0.15M，ph4.0)(1:2:0.8v/v/v)進(jìn)行再次的提取(提取工藝參數(shù)同上)；將2次提取所得的提取液進(jìn)行合并，作為提取物。

將提取物轉(zhuǎn)氮?dú)獯蹈珊?，用甲醇溶?體積用量為1ml*2次)繼而氮?dú)獯蹈珊?，用氯?體積用量為0.5ml*3次)溶解移至硅膠固相萃取柱后(內(nèi)裝C18型號(hào)/規(guī)格的硅膠500mg)分別用氯仿(10ml，流速為0.3m/min)和丙酮(10ml，流速為0.3m/min)洗去中心脂和糖脂后，用甲醇(8ml，流速為0.3m/min)將磷脂洗脫；收集磷脂洗脫液。

洗脫后的磷脂(即，磷脂洗脫液)氮?dú)獯蹈珊筇砑?00μl的內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯(19:0，6.2ng/μL)后氮?dú)獯蹈?，從而形成含有磷脂的試管。通過(guò)溫和堿性甲基化方法將脂肪酸甲基化為相應(yīng)的脂肪酸甲酯(FAMES)。溫和堿性甲基化方法即，在上述含有磷脂的試管中加入1mL的甲醇甲苯混合液(甲醇：甲苯＝1:1)和1mL 0.2M的KOH甲醇溶液，放入37℃的水浴鍋中加熱進(jìn)行甲酯化后，加入2mL水、0.3mL冰醋酸，再用正己烷氯仿混合液(兩次，每次2mL，正己烷：氯仿＝4：1)萃取磷脂脂肪酸甲酯，并用氮?dú)獯蹈傻玫街舅峒状住?/p>

7)、利用步驟6)所得脂肪酸甲酯經(jīng)氣相色譜(GC)分離，首先打開(kāi)氮?dú)鈿馄康目傞y，調(diào)節(jié)壓力至0.5MPa，打開(kāi)空氣發(fā)生器、氫氣發(fā)生器電源，向氣瓶供氣；打開(kāi)流量控制器機(jī)殼，調(diào)節(jié)壓力與流量，調(diào)節(jié)氫氣與空氣的壓力為50KPa，載氣壓力為70KPA，總氣壓為300KPa，調(diào)節(jié)尾吹至30ml/min后進(jìn)樣，分離之后由相連接的火陷離子檢測(cè)器(FID)檢測(cè)(儀器為美國(guó)Agilent公司，系統(tǒng)中存有美國(guó)MIDI公式的磷脂脂肪酸數(shù)據(jù)庫(kù))，以此進(jìn)行脂肪酸的定量。單個(gè)PLFA的¹³C/¹²C由氣相色譜－燃燒法－穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(GC-C-IRMS)進(jìn)行測(cè)定，其中Delta V同位素比質(zhì)儀連有TraceGCUltra氣相色譜、GC Combustion III(所有設(shè)備為德國(guó)Thermo Finnigan公司)；

PLFA單體的量按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

Mi＝dilution*(P_FAME*ng Std)/(P_ISTD*W) (1)

(1)式中，Mi為單個(gè)磷脂脂肪酸(PLFA)的量(以干土計(jì))，單位為μg/g；P_FAME為樣品峰面積；P_ISTD為內(nèi)標(biāo)(methyl ester C19:0，6.2ng/μL)峰面積；P_FAME及P_ISTD由由氣相色譜儀獲得；ng Std為內(nèi)標(biāo)的濃度(6.2ng/μL)；dilution為稀釋倍數(shù)；W為烘干土干重(以干土計(jì))，3g。

各個(gè)脂肪酸中C來(lái)源于尿素-C的量(Pi，μg/g)用公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

Pi＝Mi*(δ¹³C_c-δ¹³C_control)*100/(δ¹³C_M-δ¹³C_control) (2)

其中，Mi是單個(gè)PLFA的濃度，由公式(1)算得，δ¹³C_c和δ¹³C_control是標(biāo)記前和標(biāo)記后單個(gè)脂肪酸的δ¹³C，δ¹³C_M是添加尿素的δ¹³C，由同位素比質(zhì)儀得。

各土壤中PLFA總的¹³C富集比例(p_t)即¹³C的豐度(D¹³C)用下式(3)進(jìn)行計(jì)算：

p_t＝∑Pi/∑Mi*100 (3)

具體實(shí)驗(yàn)如下：

實(shí)驗(yàn)：供試土壤采自浙江省余杭麻車頭村；

所得數(shù)據(jù)以14d的15:0iso為例：

P_FAME＝6.651，P_ISTD＝18.105，ng Std＝6.2，W＝3，所以Mi＝0.759205；

δ¹³C_c＝1.279，δ¹³C_control＝1.074，δ¹³C_M＝99，所以Pi＝0.208；

∑Pi＝1.170，∑Mi＝66.242，p_t＝1.766。

因數(shù)據(jù)量較大，不一一贅述。

共測(cè)得20種磷脂脂肪酸，經(jīng)計(jì)算得出各磷脂脂肪酸的¹³C富集比例(p_t)如圖2所示，橫坐標(biāo)即測(cè)得的各種磷脂脂肪酸，縱坐標(biāo)即各種磷脂脂肪酸占總磷脂脂肪酸的百分比。從圖2可看出，培養(yǎng)后14d菜園土土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

根據(jù)磷脂脂肪酸所指示的不同微生物，14d的結(jié)果顯示表征細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量占約93.9±0.7％，而真菌的占約0.49±0.02％，放線菌的占約5.5±0.2％。

說(shuō)明：培養(yǎng)7d后土壤所得結(jié)論基本同上。

實(shí)驗(yàn)2、無(wú)機(jī)肥處理水稻土土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)

供試土壤采自江蘇省金壇市指前鎮(zhèn)建春村，純NPK處理(100％當(dāng)?shù)赜昧?，N 300kg·hm^-2，P₂O₅ 120kg·hm^-2，K₂O 100kg·hm^-2)。采取同實(shí)施例1中的工藝參數(shù)以及工藝步驟。

測(cè)得NO₃^--N，NH₄⁺-N濃度結(jié)果如圖3所示，經(jīng)運(yùn)算，NO₃^--N，NH₄⁺-N濃度均在培養(yǎng)后7天及14天的濃度下降速率最快。

所得數(shù)據(jù)以14d的15:0iso為例：

P_FAME＝31.656，P_ISTD＝28.249，ng Std＝6.2，W＝3，所以Mi＝2.3159；

δ¹³C_c＝1.245，δ¹³C_control＝1.074，δ¹³C_M＝99，所以Pi＝0.174；

∑Pi＝2.985，∑Mi＝102.258，p_t＝2.920。

因數(shù)據(jù)量較大，不一一贅述。

共測(cè)得20種磷脂脂肪酸，經(jīng)計(jì)算得出各磷脂脂肪酸的¹³C富集比例(p_t)如圖4所示，橫坐標(biāo)即測(cè)得的各種磷脂脂肪酸，縱坐標(biāo)即各種磷脂脂肪酸占總磷脂脂肪酸的百分比。從圖4可看出，培養(yǎng)14d無(wú)機(jī)處理水稻土的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

根據(jù)磷脂脂肪酸所指示的不同微生物，表征細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量占約94.0％，而真菌的占約0.60％，放線菌的占約5.4％。

說(shuō)明：培養(yǎng)7d后土壤所得結(jié)論基本同上。

實(shí)施例3、有機(jī)肥無(wú)機(jī)肥配施處理水稻土土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

供試土壤采自江蘇省金壇市指前鎮(zhèn)建春村，豬糞堆肥6000kg·hm^-2+50％NPK處理；其中，純NPK(尿素、過(guò)磷酸鈣、硫酸鉀)處理肥料用量為：N 300kg·hm^-2，P₂O₅ 120kg·hm^-2，K₂O 100kg·hm^-2；豬糞堆肥養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)45.4％，N 2.3％，P₂O₅ 2.9％，K₂O1.2％，含水量29.1％。采取同實(shí)施例1中的工藝參數(shù)以及工藝步驟。

測(cè)得NO₃^--N，NH₄⁺-N濃度結(jié)果如圖5所示，經(jīng)運(yùn)算，NO₃^--N，NH₄⁺-N濃度均在培養(yǎng)后7天及14天的濃度下降速率最快。

所得數(shù)據(jù)以14d的15:0iso為例：

P_FAME＝16.273，P_ISTD＝24.569，ng Std＝6.2，W＝3，所以Mi＝1.3688；

δ¹³C_c＝1.242，δ¹³C_control＝1.074，δ¹³C_M＝99，所以Pi＝0.171；

∑Pi＝1.734，∑Mi＝62.648，p_t＝2.768。

因數(shù)據(jù)量較大，不一一贅述。

共測(cè)得20種磷脂脂肪酸，經(jīng)計(jì)算得出各磷脂脂肪酸的¹³C富集比例(p_t)如圖6所示，橫坐標(biāo)即測(cè)得的各種磷脂脂肪酸，縱坐標(biāo)即各種磷脂脂肪酸占總磷脂脂肪酸的百分比。從圖6可看出，培養(yǎng)14d有機(jī)處理水稻土的土壤厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

根據(jù)磷脂脂肪酸所指示的不同微生物，表征細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量占約92.1％，而真菌的占約0.6％，放線菌的占約7.3％。

說(shuō)明：培養(yǎng)7d后土壤所得結(jié)論基本同上。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、采用現(xiàn)有的本行業(yè)公認(rèn)的檢測(cè)精度高的DGGE結(jié)合qPCR對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所述的土壤進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果的簡(jiǎn)述如表1所述：

表1

對(duì)比例1-1、將實(shí)施例1中的使土壤中¹³C-尿素-N的濃度由200mg/kg改成150mg/kg，將NO₃^－-N濃度由200mg/kg改成150mg/kg，其余等同于實(shí)施例1。

結(jié)果顯示，細(xì)菌含量有顯著下降(僅為80％左右)，真菌變化不大，放線菌含量有上升，與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)相差較大，不能正確顯示實(shí)際結(jié)果。

對(duì)比例1-2、將實(shí)施例1中的使土壤中¹³C-尿素-N的濃度由200mg/kg改成250mg/kg，將NO₃^－-N濃度由200mg/kg改成250mg/kg，其余等同于實(shí)施例1。

結(jié)果顯示，細(xì)菌含量上升，真菌與放線菌含量均降低(放線菌僅為3.5％左右)，與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)相差較大，不能正確顯示實(shí)際結(jié)果。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。