本發(fā)明屬于蜂蜜質(zhì)量控制方法，涉及一種蜂蜜中王漿主蛋白成分的分離鑒定方法，尤其涉及一種基于王漿主蛋白成分鑒別中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的方法，以及并將其應(yīng)用到中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的鑒別之中。
背景技術(shù)：
：蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。蜂蜜的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，現(xiàn)在已經(jīng)在蜂蜜中鑒定出180余種物質(zhì)，蜂蜜中的主要成分是葡萄糖和果糖，約占蜂蜜總量的65％-80％，其次是水分，占16％-25％。此外，蜂蜜還含有多種維生素、蛋白質(zhì)以及人類必需的多種礦物質(zhì)和微量元素等，是藥食同源的天然營(yíng)養(yǎng)品。蜂蜜中的蛋白質(zhì)含量較少，其含量約為0.1％-0.5％，蜂蜜中的蛋白質(zhì)主要由王漿主蛋白和一些消化酶構(gòu)成，其中王漿主蛋白是蜂蜜蛋白質(zhì)的主要成分。不同蜂種來源的王漿主蛋白有明顯的種間差異。意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)和中華蜜蜂(Apisceranacerana)分別是西方蜜蜂和東方蜜蜂種下的亞種，兩者在身體形態(tài)和生活習(xí)性上差異較大，兩者的王漿主蛋白成分有明顯的種間差異，因此可以通過兩者王漿主蛋白的差異來鑒別中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。目前在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上中蜂蜂蜜的價(jià)格是意蜂蜂蜜的3-5倍，在利益驅(qū)使下，一些不法商販用意蜂蜂蜜冒充或摻入中蜂蜂蜜中以賺取高額利潤(rùn)，給中蜂養(yǎng)殖者以及相關(guān)蜂產(chǎn)品企業(yè)造成了較大損失，同時(shí)引發(fā)了消費(fèi)者的信任危機(jī)，不利于蜂產(chǎn)品市場(chǎng)的健康發(fā)展。因此，亟需一種方法來鑒別兩種蜂蜜，在一定程度上規(guī)范國(guó)內(nèi)的蜂蜜市場(chǎng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于王漿主蛋白成分鑒別中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的方法，通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)蜂蜜中總蛋白的提取：分別稱取10g中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，各放于50ml離心管中，各加10ml無菌水，震蕩混勻，離心機(jī)4℃條件下8000g/min離心10分鐘以除去蜂蠟、花粉等雜質(zhì)，用移液槍小心吸取上清液至新的50ml離心管中，將上清液置于4℃冰箱預(yù)冷10分鐘，加入在-20℃冰柜預(yù)冷的無水乙醇20ml，在冰水浴中溫和攪拌15分鐘，然后在4℃條件下以15000g/min的速度離心10分鐘，棄去上清液，沉淀加1.5ml無菌水，用玻璃棒攪拌然后震蕩混勻，后分裝到1.5ml離心管中置于-80℃冰箱備用，來自不同蜂種的蜂蜜用不同標(biāo)識(shí)標(biāo)記；(2)樣品蛋白濃度測(cè)定：用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定；(3)蛋白樣品的處理：分別取80μl中蜂蜂蜜蛋白樣品和意蜂蜂蜜蛋白樣品于1.5ml離心管中，各加入20μl的蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X))，震蕩混勻后95℃恒溫金屬浴變性10分鐘；(4)聚丙烯酰胺凝膠的制備：本實(shí)驗(yàn)采用的分離膠濃度為15％，濃縮膠為5％，膠條厚度1.5mm；(5)蜂蜜蛋白樣的電泳：采用蛋白電泳分離系統(tǒng)，兩種蛋白上樣量均為200μg，初始電壓為90V，蛋白進(jìn)入分離膠后改為150V至電泳結(jié)束，并加入蛋白Marker以指示蛋白分子量大?。?6)膠條的處理：電泳結(jié)束后膠條放入固定液中固定1小時(shí)，中間更換一次固定液。固定完成后用考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色3小時(shí)，然后置于脫色搖床上脫色至條帶清晰；(7)差異蛋白條帶的識(shí)別：記錄兩種不同來源的蛋白電泳結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker指示，找出差異性的蛋白條帶。(8)差異蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定：將差異性的蛋白條帶切膠后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)方法為Maldi-TOF-TOF，檢測(cè)完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索，確定差異性條帶的蛋白質(zhì)組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的鑒別方法在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鑒別中應(yīng)用。本發(fā)明提出了一種鑒別中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，根據(jù)兩者王漿主蛋白方面的差異來準(zhǔn)確地鑒別中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。本發(fā)明是通過生物學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在蛋白上的差異，并確定其蛋白種類，以此來鑒別兩種不同蜂種來源的蜂蜜，解決市場(chǎng)上存在的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜難以分辨，以及意蜂蜂蜜冒充和摻入中蜂蜂蜜這一問題，在一定程度上遏制以低價(jià)意蜂蜂蜜冒充高價(jià)中蜂蜂蜜的亂象。附圖說明圖1是中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的SDS-PAGE膠圖，其中1-4為中蜂蜂蜜條帶，5-8為意蜂蜂蜜條帶，箭頭標(biāo)出的為兩者的差異條帶。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一一種鑒別中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)蜂蜜中總蛋白的提?。悍謩e稱取10g中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，各放于50ml離心管中，各加10ml無菌水，震蕩混勻，離心機(jī)4℃條件下8000g/min離心10分鐘以除去蜂蠟、花粉等雜質(zhì)，用移液槍小心吸取上清液至新的50ml離心管中，將上清液置于4℃冰箱預(yù)冷10分鐘，加入在-20℃冰柜預(yù)冷的無水乙醇20ml，在冰水浴中溫和攪拌15分鐘，然后在4℃條件下以15000g/min的速度離心10分鐘，棄去上清液，沉淀加1.5ml無菌水，用玻璃棒攪拌然后震蕩混勻，后分裝到1.5ml離心管中置于-80℃冰箱備用，來自不同蜂種的蜂蜜用不同標(biāo)識(shí)標(biāo)記；(2)樣品蛋白濃度測(cè)定：用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定(上海碧云天生物有限公司，貨號(hào)P0011)；(3)蛋白樣品的處理：分別取80μl中蜂蜂蜜蛋白樣品和意蜂蜂蜜蛋白樣品于1.5ml離心管中，各加入20μl的蛋白上樣緩沖液[SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)]，震蕩混勻后95℃恒溫金屬浴變性10分鐘；(4)聚丙烯酰胺凝膠的制備：本實(shí)驗(yàn)采用的分離膠濃度為15％，濃縮膠為5％，膠條厚度1.5mm；(5)蜂蜜蛋白樣的電泳：采用蛋白電泳分離系統(tǒng)，兩種蛋白上樣量均為200μg，初始電壓為90V，蛋白進(jìn)入分離膠后改為150V至電泳結(jié)束，并加入蛋白Marker以指示蛋白分子量大?。?6)膠條的處理：電泳結(jié)束后膠條放入固定液中固定1小時(shí)，中間更換一次固定液。固定完成后用考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色3小時(shí)，然后置于脫色搖床上脫色至條帶清晰；(7)差異蛋白條帶的識(shí)別：記錄兩種不同來源的蛋白電泳結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker指示，找出差異性的蛋白條帶。(8)差異蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定：將差異性的蛋白條帶切膠后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)方法為Maldi-TOF-TOF，檢測(cè)完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索，確定差異性條帶的蛋白質(zhì)組成。實(shí)施例二本實(shí)施例中的蜂蜜樣品信息如下表1，樣品放4℃冰箱備用。按照實(shí)施例一的方法步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中樣品編號(hào)中1-中4對(duì)應(yīng)膠圖中的1-4孔道，樣品編號(hào)意1-意4對(duì)應(yīng)膠圖中的5-8孔道，條帶結(jié)果見圖1，質(zhì)譜結(jié)果見表2。表1蜂蜜樣品信息表差異蛋白條帶的質(zhì)譜結(jié)果如下：表2差異蛋白條帶質(zhì)譜鑒定結(jié)果條帶編號(hào)蜂種來源質(zhì)譜鑒定結(jié)果C1中華蜜蜂中蜂MRJP1、2、3C2中華蜜蜂中蜂MRJP1、2、3C3中華蜜蜂中蜂MRJP1-7M1意大利蜜蜂意蜂MRJP1-9M2意大利蜜蜂意蜂MRJP1、2M3意大利蜜蜂意蜂MRJP1-4M4意大利蜜蜂意蜂MRJP1、2M5意大利蜜蜂意蜂MRJP1、2M6意大利蜜蜂意蜂MRJP1、2、3從膠圖和質(zhì)譜結(jié)果可以看出，兩種蜂蜜在蛋白組成上有明顯的差異，可以根據(jù)其王漿主蛋白的差異來鑒別兩者。雖然上述實(shí)施例已對(duì)本發(fā)明作出了詳盡的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，還可對(duì)本發(fā)明的方案作出其不偏離中心的修改，它們都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3