本發(fā)明屬于光譜分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法，尤其涉及一種基于紅外光譜和高斯多峰擬合分析牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)(Protein)屬于生物高分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本物質(zhì)，也是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，沒有蛋白質(zhì)就生物就沒有生命。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成單位，氨基酸以肽鍵形式連接成多肽鏈，經(jīng)過盤曲折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。蛋白質(zhì)具有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)分子結(jié)構(gòu)，不同的分子結(jié)構(gòu)決定了它的具體活性和功能。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指氨基酸殘基在肽鏈中的排列順序；肽鏈中的主鏈借助氨基酸殘基亞氨基上的氫原子和羰基上的氧原子之間形成的氫鍵，有規(guī)則的卷曲折疊成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象被稱為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等。在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，肽鏈按照一定的空間結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步形成更復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)。具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定的空間排列方式結(jié)合在一起形成的聚集體結(jié)構(gòu)稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。研究表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)分子各個(gè)基團(tuán)的空間分布，而其所占的比例在一定程度上顯著影響著蛋白的活性與功能。

目前，鑒定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是一項(xiàng)非常繁瑣的工作，研究人員要先對(duì)樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，然而有一部分蛋白質(zhì)(膜蛋白質(zhì))很難被提取出來。提取出的蛋白質(zhì)需要富集成一定的量才能進(jìn)一步進(jìn)行純化。純化可以借助硫酸銨沉淀法、瓊脂糖凝膠法的一維或二維電泳，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)等性質(zhì)進(jìn)行初步分離。再根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電性及結(jié)構(gòu)大小，采用分步洗脫的柱層析方法進(jìn)行分離收集，得到純的蛋白質(zhì)樣品。純化后的已知分子量和摩爾濃度的蛋白質(zhì)才能借助圓二色譜進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。顯然，整個(gè)過程中實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、工作量大、未知因素多、所需成本極高。許多研究者都對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析望而卻步，從而限制了蛋白質(zhì)生物活性的深入研究。因此，通過研究并獲得一種簡單有效鑒定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，這顯得尤為迫切。

通過檢索國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)，目前尚未發(fā)現(xiàn)利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transformation Infrared Spectroscopy,FTIR)和高斯多峰擬合研究植株水平上植物體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可簡單有效檢測牡丹體內(nèi)全蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，以填補(bǔ)植株水平上蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)研究的空白，解決現(xiàn)有技術(shù)成本高、周期長和數(shù)據(jù)涵蓋面窄等困擾研究者的難題。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈探索，最終獲得了如下一種基于紅外光譜和高斯多峰擬合分析牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括如下步驟：將干燥的牡丹植株器官樣品磨成粉末，采用溴化鉀壓片法進(jìn)行FTIR的掃描，根據(jù)所得FTIR原始數(shù)據(jù)作曲線圖，選取圖中1600-1700cm^-1處氨基I區(qū)域的曲線進(jìn)行高斯單峰正態(tài)分布的曲線擬合，再根據(jù)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的FTIR峰位對(duì)擬合峰進(jìn)行高斯多峰擬合，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比。

進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明技術(shù)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選后，如上所述牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法，該方法的具體步驟包括：

(1)取干燥的樣品與100-200倍量的干燥KBr研成均一細(xì)粉，粒徑小于2μm，底模裝入模膛，將所述細(xì)粉加入液壓機(jī)模心，然后將頂模放入模心，用(5-10)×10⁷Pa壓力在液壓機(jī)上壓成透明薄片，將KBr壓片夾放入紅外光譜儀中的透射配件中，以KBr空白片或空氣為參比，選用4cm^-1的分辨率，掃描128次，波數(shù)范圍是400-4000cm^-1，獲得FTIR原始數(shù)據(jù)；

(2)借助Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)FTIR原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先對(duì)該原始數(shù)據(jù)作曲線圖，得到牡丹植株器官樣品的原始FTIR圖譜；

(3)在所述原始FTIR圖譜中選取1600-1700cm^-1處氨基I區(qū)域的曲線，對(duì)其進(jìn)行高斯單峰正態(tài)分布的曲線擬合；

(4)再根據(jù)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的FTIR峰位，對(duì)步驟(3)所得擬合曲線再次進(jìn)行高斯多峰擬合，根據(jù)擬合結(jié)果判定多峰擬合的分峰數(shù)和峰面積，從而計(jì)算出牡丹植株器官樣品中蛋白質(zhì)的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法，其中牡丹植株器官樣品的制樣方法是：將清洗干凈的牡丹植株器官鮮樣切碎后，置于110℃殺青1h，75℃烘干至恒重，然后用經(jīng)球磨儀將樣品粉碎成粉末，粒徑小于2μm。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法，其中的牡丹植株器官選自牡丹的根、莖、葉和花的一種。

根據(jù)牡丹根氨基I區(qū)域(1600-1700cm^-1)的曲線擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牡丹的根系中只存在β+S、β、α和L+T二級(jí)結(jié)構(gòu)，不存在β+T的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這說明對(duì)牡丹根中蛋白質(zhì)進(jìn)行高斯多峰擬合分析時(shí)，為避免β+T對(duì)分析結(jié)果的影響，應(yīng)該選用4個(gè)分峰而不是5個(gè)分峰。再進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法，其中的牡丹植株器官選自牡丹的根，對(duì)牡丹根中蛋白質(zhì)進(jìn)行高斯多峰擬合分析時(shí)選用β+S、β、α和L+T共4個(gè)分峰。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用FTIR、高斯單峰擬合和高斯多峰擬合等方法提出一種簡單精確的測定牡丹植株水平上蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，該方法具有如下有益效果：

(1)可以直接對(duì)植株水平上樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，不需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和純化，能大幅度降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)周期、節(jié)約人力物力。

(2)本發(fā)明是基于FTIR光譜法和高斯多峰擬合進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析，不僅簡單有效，準(zhǔn)確度高，而且數(shù)據(jù)說服力強(qiáng)。

(3)對(duì)其進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過計(jì)算，實(shí)驗(yàn)的相對(duì)偏差為0.09％，即實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為精確，重復(fù)性較好。

附圖說明

圖1為牡丹根的FTIR光譜圖；

圖2為牡丹根氨基I區(qū)域(1600-1700cm^-1)的擬合曲線圖。A，高斯多峰5個(gè)分峰擬合曲線圖；B，高斯多峰4個(gè)分峰擬合曲線圖。注：灰色實(shí)線為原始數(shù)據(jù)，黑色實(shí)線為非線性曲線單峰擬合圖譜，黑色虛線為高斯多峰擬合結(jié)果。L、T、α、β和S分別代表環(huán)(loop)、轉(zhuǎn)角(turn)、α-螺旋(α-helical)、β-折疊(β-sheet)和側(cè)鏈(side chain)。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。并且，以下提到的牡丹根樣品可根據(jù)實(shí)驗(yàn)換成牡丹植株的任何一個(gè)組織器官。

實(shí)施例1：牡丹體內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定分析

將干燥的牡丹根樣品磨成粉末，采用溴化鉀壓片方法進(jìn)行FTIR的掃描。對(duì)原始圖譜進(jìn)行高斯單峰擬合，再依據(jù)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征峰峰位對(duì)擬合單峰進(jìn)行高斯多峰擬合，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中各種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比。

具體操作方法如下：

(1)即取干燥牡丹根1-2mg與200mg干燥的KBr研成均一細(xì)粉(直徑約2μm)，以免散射光影響。底模裝入模膛(注意拋光面向上)，加入少量樣品于模心，用藥匙將模具中的樣品刮平，并使其中心略高，然后將頂模放入模心，用(5-10)×10⁷Pa壓力在液壓機(jī)上壓成透明薄片(約1-2min)，將KBr壓片夾放入紅外光譜儀中(Bruker vertex 70)的透射配件中，以KBr空白片(或空氣)為參比，選用4cm^-1的分辨率，掃描128次；波數(shù)范圍是400-4000cm^-1，掃描后獲得FTIR的原始數(shù)據(jù)。

(2)借助Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)FTIR原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，得到牡丹根的原始FTIR圖譜。

(3)在原始圖譜中選取氨基I區(qū)域(1600-1700cm^-1)的曲線并對(duì)其進(jìn)行高斯單峰正態(tài)分布的曲線擬合。

(4)再根據(jù)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的FTIR峰位，對(duì)高斯單峰擬合曲線再次進(jìn)行高斯多峰擬合，根據(jù)擬合結(jié)果判定多峰擬合所需的分峰數(shù)。

實(shí)施例2：牡丹根中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

選用實(shí)施例1中描述的操作步驟，對(duì)牡丹根進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。牡丹根的FTIR曲線圖如圖1所示，表明牡丹根存在氨基I的峰，即在1600-1700cm^-1處存在紅外吸收峰。對(duì)1600-1700cm^-1譜圖(圖2中圖A和圖B中灰色實(shí)線)進(jìn)行高斯單峰擬合，結(jié)果如圖2中圖A和圖B中黑色實(shí)線所示，擬合方程為：

$y=y_0+{\left(\frac{A}{w\×\sqrt{\frac{\mathrm{\π}}{2}}}\right)}^{-2\×{\left(\frac{x-x_c}{w}\right)}^2}$

其中y₀為0.08，x_c為1631.94，w為67.17，A為11.97，該擬合方程的R²為0.99。

根據(jù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰位(表1所示)對(duì)擬合單峰(圖1及如圖2中A和B黑色實(shí)線)進(jìn)行高斯多峰擬合。從表1可知，1600-1700cm^-1間存在5種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，波數(shù)從低到高依次為：β+S、β、α、L+T和β+T，其中L、T、α、β和S分別代表環(huán)(loop)、轉(zhuǎn)角(turn)、α-螺旋(α-helical)、β-折疊(β-sheet)和側(cè)鏈(side chain)。先對(duì)其進(jìn)行5個(gè)峰位的分峰，結(jié)果如圖2中A所示的黑色虛線所示，1615cm^-1處的β+T結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的峰面積為負(fù)值，即牡丹根的蛋白質(zhì)中不含有β+T的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，為避免蛋白質(zhì)的β+T二級(jí)結(jié)構(gòu)影響分析結(jié)果，再次對(duì)擬合單峰進(jìn)行其它4個(gè)峰位的分峰(圖2中B所示的黑色虛線部分)。結(jié)果顯示高斯多峰擬合方程的R²為1，每種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的峰面積如表1所示，根據(jù)峰面積可以看出：牡丹根的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β+S(45.98％)>α(27.59％)>β(19.09％)>L+T(7.34％)。

表1牡丹根中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的高斯多峰擬合峰位及所占百分比

實(shí)施例3：牡丹枝干中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

將干燥的牡丹枝干磨成粉末，具體操作方法按照實(shí)施例1的操作方法。牡丹枝干FTIR結(jié)果顯示在1600-1700cm^-1處存在紅外吸收峰，其高斯單峰擬合方程為：

$y=y_0+{\left(\frac{A}{w\×\sqrt{\frac{\mathrm{\π}}{2}}}\right)}^{-2\×{\left(\frac{x-x_c}{w}\right)}^2}$

其中y₀為0.34，x_c為1633.71，w為84.47，A為10.58，該擬合方程的R²為0.99。

結(jié)果顯示，高斯多峰(4個(gè)分峰)擬合方程的R²為1，如表2所示，牡丹枝干中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為β+S、β、α和L+T。牡丹枝干的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β+S(44.32％)>α(29.65％)>β(13.22％)>L+T(12.81％)。

表2牡丹枝干中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的高斯多峰擬合峰位及所占百分比

實(shí)施例4：牡丹葉片中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

將干燥的牡丹葉片磨成粉末，具體操作方法按照實(shí)施例1的操作方法。牡丹葉片F(xiàn)TIR結(jié)果顯示在1600-1700cm^-1處存在紅外吸收峰，其高斯單峰擬合方程為：

$y=y_0+{\left(\frac{A}{w\×\sqrt{\frac{\mathrm{\π}}{2}}}\right)}^{-2\×{\left(\frac{x-x_c}{w}\right)}^2}$

其中y₀為0.10，x_c為1639.93，w為85.15，A為20.52，該擬合方程的R²為0.97。

結(jié)果顯示，高斯多峰(5個(gè)分峰)擬合方程的R²為1，如表3所示，牡丹葉片中含有5種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：β+S、β、α、L+T和β+T。牡丹葉片的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β+S(33.79％)>β(24.39％)>α(22.22％)>L+T(17.49％)>β+T(2.11％)。

表3牡丹葉片中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的高斯多峰擬合峰位及所占百分比

實(shí)施例5：牡丹花瓣中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

將干燥的牡丹花瓣磨成粉末，具體實(shí)施方法參照按照實(shí)施例1的操作方法。牡丹花瓣FTIR結(jié)果顯示在1600-1700cm^-1處存在紅外吸收峰，其高斯單峰擬合方程為：

$y=y_0+{\left(\frac{A}{w\×\sqrt{\frac{\mathrm{\π}}{2}}}\right)}^{-2\×{\left(\frac{x-x_c}{w}\right)}^2}$

其中y₀為-0.06，x_c為1639.73，w為107.46，A為35.29，該擬合方程的R²為0.98。

結(jié)果顯示，高斯多峰(4個(gè)分峰)擬合方程的R²為1，如表4所示，牡丹花瓣中含有4種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：β+S、β、α、L+T。牡丹花瓣的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β+S(37.74％)>α(28.11％)>L+T(18.38％)>β(15.77％)。

表4牡丹花瓣中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的高斯多峰擬合峰位及所占百分比