本發(fā)明屬于醫(yī)藥分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物、制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
達(dá)托霉素(Daptomycin)是一類稱為環(huán)酯肽類新抗生素家族的第一個(gè)產(chǎn)品。達(dá)托霉素除了能作用于大多數(shù)臨床相關(guān)革蘭氏陽性菌外，更重要的是它在體外對已呈現(xiàn)甲氧西林(Methicillin)、萬古霉素和利奈唑烷等耐藥性質(zhì)的分離菌株具有強(qiáng)力活性，這個(gè)特性對于危重感染患者具有非常重要的臨床意義。達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物結(jié)構(gòu)式如下：達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物結(jié)構(gòu)式中國發(fā)明專利CN01805212.6公開了達(dá)托霉素的14個(gè)雜質(zhì)，如脫水達(dá)托霉素、異構(gòu)達(dá)托霉素、達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物等雜質(zhì)，并未具體涉及達(dá)托霉素雜質(zhì)分離方法。中國抗生素雜志2013年10月第38卷第10期，760～764中公開了達(dá)托霉素在不同酸堿條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)及其結(jié)構(gòu)研究，其中雜質(zhì)4為達(dá)托霉素的內(nèi)酯開環(huán)產(chǎn)物CB-131012，該雜質(zhì)4在pH近中性至堿性條件下產(chǎn)生，但是制備方法是利用HPLC對轉(zhuǎn)化液進(jìn)行雜質(zhì)制備，需要消耗大量的流動(dòng)相、收率低、制備成本高。達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物是達(dá)托霉素主要降解雜質(zhì)，是達(dá)托霉素質(zhì)量控制中重點(diǎn)關(guān)注的雜質(zhì)，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，為此尋找一種制備方法簡單、周期短、成本低并且能夠單獨(dú)分離純化出該雜質(zhì)并對其穩(wěn)定性等相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行研究是非常必要的，對達(dá)托霉素的質(zhì)量提升意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、成本低廉且能快速地從達(dá)托霉素成品制備高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：一種達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物制備方法，包括如下步驟：1)堿破壞：取達(dá)托霉素樣品于室溫加入堿性溶液中，待樣品完全溶解，加入酸性溶液進(jìn)行中和，加乙腈-水混合液稀釋；2)稀釋液冷藏過夜、結(jié)晶沉淀，過濾；3)水洗濾餅；4)濾餅30℃真空烘干，獲得達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物純品。作為優(yōu)選，步驟1)中達(dá)托霉素樣品為達(dá)托霉素粗品、達(dá)托霉素成品或達(dá)托霉素粉針中任一種或其混合物。作為優(yōu)選，步驟1)中堿性溶液的PH值為12～14；更優(yōu)選堿性溶液為NaOH或KOH溶液，最優(yōu)選NaOH或KOH溶液摩爾濃度為0.5mol/L。進(jìn)一步的，步驟1)中堿性溶液與達(dá)托霉素樣品的重量體積比為10～50ml/g，優(yōu)選20～30ml/g。作為優(yōu)選，步驟1)中酸性溶液的PH值為0～2；更優(yōu)選酸性溶液為HCl溶液，最優(yōu)選HCl的摩爾濃度為0.5mol/L。作為優(yōu)選，步驟1)中乙腈-水混合液中乙腈含量為30％～70％；乙腈-水混合液加入量為中和液體積的10～25倍。作為優(yōu)選，步驟2)中結(jié)晶沉淀溫度為2～8℃。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本方法無需通過使用價(jià)格昂貴的制備色譜柱，也無需使用大量含有有機(jī)溶媒的流動(dòng)相，成本低，方法環(huán)保。只需一次性處理，無需反復(fù)多次處理。且對起如物料來源要求低，易于獲得，可以是達(dá)托霉素成品、達(dá)托霉素粗品、達(dá)托霉素粉針樣品。同時(shí)本方法可以獲得足夠量的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物，可以根據(jù)需要進(jìn)行放大制備，可以獲得克級雜質(zhì)，甚至十克級以上雜質(zhì)，滿足研究、生產(chǎn)需要。本發(fā)明還提供了按照上述制備方法制備的高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物在檢測達(dá)托霉素中內(nèi)酯水解物含量的應(yīng)用。利用高純度的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物可以利用外標(biāo)法準(zhǔn)確的測定達(dá)托霉素中的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的含量，而外標(biāo)法是目前測定達(dá)托霉素中的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物含量最可靠、最準(zhǔn)確、最接近于真實(shí)值的方法。外標(biāo)法需要達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的含量為95％以上，以滿足達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物結(jié)構(gòu)確定條件。由于制備了高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物，能進(jìn)行系統(tǒng)的、完整的測定方法學(xué)驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證，該內(nèi)酯水解物溶液的穩(wěn)定性良好，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性，保證藥物質(zhì)量。這是藥物質(zhì)量研究所必需的。當(dāng)沒有高純度的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物雜質(zhì)時(shí)，只能采用自身對照法對達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物進(jìn)行測定，方法的可靠性、準(zhǔn)確度難以保證，也無法進(jìn)行系統(tǒng)、完整的測定方法學(xué)驗(yàn)證，從而難以保證檢測結(jié)果的可靠性，無法保證藥物質(zhì)量。應(yīng)用如上所述的制備方法制備的高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物檢測達(dá)托霉素中內(nèi)酯水解物含量的方法，步驟如下：1)流動(dòng)相的配制：取磷酸二氫銨9g，加水溶解并稀釋至2000ml，用1M磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，再加入乙腈，磷酸二氫銨與乙腈的體積比為60:40，獲得流動(dòng)相磷酸二氫銨-乙腈緩沖液；2)供試品溶液的配制：取達(dá)托霉素適量，用pH3.5的磷酸二氫銨溶液-乙腈以體積比為80:20的溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中含2mg的溶液，作為供試品溶液；3)以辛烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，色譜柱為C8常規(guī)柱；流速為每分鐘1.5ml/min，柱溫30℃，檢測波長214nm，進(jìn)樣盤溫度為3℃～7℃，優(yōu)選5℃。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明帶來的有益技術(shù)效果如下：1、本發(fā)明所提供制備高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的方法簡單，對起始物料要求低，重現(xiàn)性好，易于連續(xù)生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)量大。且所制備得到的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物水解完全、內(nèi)酯水解物收率高，收率超過50％，純度高、歸一化含量高達(dá)97％以上。2、本發(fā)明提供了高純度達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物在檢測達(dá)托霉素中內(nèi)酯水解物含量的應(yīng)用，可更便捷、可靠的檢測達(dá)托霉素成品質(zhì)量，提供更安全用藥。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的HPLC譜圖。具體實(shí)施方式1、儀器：檢測儀器及方法：高效液相色譜(HPLC)譜圖數(shù)據(jù)采自于高效液相色譜儀：Agilent1260；色譜柱：C8常規(guī)柱；流動(dòng)相：磷酸二氫銨溶液-乙腈緩沖液；該緩沖液配制方法如下：取磷酸二氫銨9g，加水溶解并稀釋至2000ml，用1M磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，然后加入乙腈，二者體積比為60:40；紫外檢測波長：214nm；柱溫：30℃；流速：1.5ml/min；進(jìn)樣量：10ul。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實(shí)施例11)堿破壞：取達(dá)托霉素粗品1g，加25ml0.5mol/LNaOH，室溫待樣品完全溶解，再加入25ml0.5mol/LHCl中和，再加入500ml乙腈含量為50％的乙腈-水混合液稀釋。2)稀釋液冷藏至2～8℃，過夜結(jié)晶沉淀，過濾；3)水洗濾餅；4)濾餅30℃真空烘干，獲得達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物純品530mg，歸一化含量97.16％，見圖1。通過正離子模式質(zhì)譜法氨基酸全序列測試，結(jié)果達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的氨基酸全序列為：Dec-Trp(1)-Asn(2)-Asp(3)-Thr(4)-Gly(5)-Orn(6)-Asp(7)-Ala(8)-Asp(9)-Gly(10)-Ser(11)-3mGlu(12)-Kyn(13)。本實(shí)施例制備的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物核磁共振氫譜為：(1H-NMR)(600MHz，DMSO-d6+D2O)：δ7.67(d，J＝7.9Hz，1H)，7.21(dd，J＝7.6Hz，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，1H)，7.09(1H)，7.29(d，J＝7.8Hz，1H)，7.02(dd，J＝7.2Hz，1H)，6.94(dd，J＝7.2Hz，1H)，6.68(d，J＝8.4Hz，1H)，6.53(dd，J＝7.6Hz，1H)，4.70-2.82(22H)，2.82-1.40(19H)，1.40-0.62(26H)。實(shí)施例21)堿破壞：取達(dá)托霉素成品10g，加150ml1mol/LNaOH，室溫待樣品完全溶解，再加入150ml1mol/LHCl中和，再加入3800ml乙腈含量為70％的乙腈-水混合液稀釋。2)稀釋液冷藏至2～8℃，過夜結(jié)晶沉淀，過濾。3)水洗濾餅。4)濾餅30℃真空烘干，獲得達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物純品5.02g，歸一化含量96.15％。本實(shí)施例制備的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的氨基酸全序列和核磁共振氫譜同實(shí)施例1。實(shí)施例31)堿破壞：取達(dá)托霉素粉針1g，加50ml0.01mol/LKOH，室溫待樣品完全溶解，再加入50ml0.01mol/LHCl中和，再加入500ml乙腈含量為30％的乙腈-水混合液稀釋。2)稀釋液冷藏至2～8℃，過夜結(jié)晶沉淀，過濾。3)水洗濾餅。4)濾餅30℃真空烘干，獲得達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物純品503mg，歸一化含量96.65％。本實(shí)施例制備的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物的氨基酸全序列和核磁共振氫譜同實(shí)施例1。實(shí)施例4達(dá)托霉素中內(nèi)酯水解物含量檢測1)流動(dòng)相的配制：取磷酸二氫銨9g，加水溶解并稀釋至2000ml，用1M磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，再加入乙腈，磷酸二氫銨與乙腈的體積比為60:40，獲得流動(dòng)相磷酸二氫銨-乙腈緩沖液；2)供試品溶液的配制：取達(dá)托霉素適量，用pH3.5的磷酸二氫銨溶液-乙腈以體積比為80:20的溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中含2mg的溶液，作為供試品溶液；3)以辛烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，色譜柱為C8常規(guī)柱；流速為每分鐘1.5ml/min，柱溫30℃，檢測波長214nm，進(jìn)樣盤溫度為5℃。采用本實(shí)施例的檢測方法，對3批達(dá)托霉素原料進(jìn)行內(nèi)酯水解物測定結(jié)果見下表1：表1：達(dá)托霉素原料中內(nèi)酯水解物含量批號150402150406150501內(nèi)酯水解物(％)0.120.140.12實(shí)施例5達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施例1至3所制備的達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物溶液穩(wěn)定性均較好，以本發(fā)明實(shí)施例1制備的內(nèi)酯水解物為例，具體步驟和結(jié)果如下：稱取4.5g磷酸二氫銨加入1000ml水溶解，用1M磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5溶液，加入乙腈，按照磷酸二氫銨與乙腈體積比為20:80配制成磷酸二氫銨-乙腈的緩沖鹽溶液，備用；取內(nèi)酯水解物適量，精密稱定，加入上述磷酸二氫銨-乙腈的緩沖鹽溶液溶解并稀釋制成含29.98μg/ml的溶液，精密量取10μl注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣12h，結(jié)果見下表2。表2：內(nèi)酯水解物溶液的穩(wěn)定性結(jié)果表明，12h內(nèi)進(jìn)樣操作內(nèi)酯水解物溶液穩(wěn)定。其中RSD是相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的英文簡稱。以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。