一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種四倍體青貯玉米的倍性鑒定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

二、

背景技術(shù)：

玉米是重要的糧飼兼用型作物，以其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富而被譽(yù)為飼料之王。我國(guó)玉米總需求量的78％用作畜禽飼料。隨著人民生活水平提高，牛、羊等食草動(dòng)物產(chǎn)品受到人民的普遍青睞，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，對(duì)青貯飼料的需求量逐年上升。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和種植結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步調(diào)整，飼用玉米尤其是青貯玉米越來(lái)越受到人們的重視。四倍體玉米因其具有較大的株型、寬大肥厚的葉片、粗壯的莖和根以及多果穗等特性，是極佳的青貯飼料來(lái)源。然而，我國(guó)四倍體青貯玉米育種研究較少，檢測(cè)技術(shù)更是空白。

四倍體玉米形態(tài)學(xué)性狀與二倍體玉米有明顯差別，但是不能作為準(zhǔn)確鑒別二倍體和四倍體玉米的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)顯微觀察來(lái)鑒定個(gè)體的染色體倍性的主要方法包括：根尖染色體計(jì)數(shù)法、花粉粒大小判別法、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法、保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)量法等(劉仁樣，1998；王培，1989)。這些顯微觀察方法不但費(fèi)時(shí)，而且技術(shù)難度大。采用保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)量法，由于二倍體和四倍體的保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度重疊，會(huì)造成測(cè)量結(jié)果的不準(zhǔn)確。而采用花粉粒大小判別法需在開(kāi)花期進(jìn)行，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)工，還受花粉時(shí)間限制。

目前，流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，fcm)己普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，但在植物方面的應(yīng)用直到20世紀(jì)80年代中期才開(kāi)始。由于流式細(xì)胞儀可以直接測(cè)定細(xì)胞的dna含量，從而快速鑒定出植株倍性水平，不受植株生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和環(huán)境條件的影響，省時(shí)、高效，還可以檢測(cè)出非整倍體以及混倍體。并已被成功地用于大白菜(韓陽(yáng)，2006)、水稻(金亮，2007)、黑麥草(劉祎，2011)、葡萄(郭印山，2014)倍性鑒別上，但至今還未見(jiàn)該方法用于玉米倍性鑒定的報(bào)道。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行玉米苗期倍性分析將提高鑒定效率。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明涉及一種玉米苗期倍性的鑒定方法，現(xiàn)有技術(shù)不能有效、快速鑒定四倍體青貯玉米，建立四倍體青貯玉米的流式細(xì)胞儀倍性鑒定體系，可以在苗期有效去除雜株，加速育種材料的選育。

1.鑒定方法：

(1)細(xì)胞核分離緩沖液制備及待測(cè)樣品的處理

ottobuffers分離緩沖液配置：ottoi：100mmol/l檸檬酸，0.5％(v/v)tween20(ph2.3)；ottoii：400mmol/lna2hpo4·12h2o(ph8.9)。

取100mg葉片加入1mlottoi中，用剪刀將葉片剪碎，冰孵5-10min，8000r/min離心5min，棄上清，加入1mlottoi1000r/min離心5min，棄上清，加入100μlottoi和200μlottoii混合液，過(guò)300目篩子，加入終濃度為50μg/mlpi染液，暗處理染色15min，過(guò)500目篩子，上機(jī)檢測(cè)。

(2)流式細(xì)胞儀倍性鑒定

采用美國(guó)becton-dickinson公司的facscalibur流式細(xì)胞儀，其激發(fā)光源為488nm氬離子藍(lán)色激光；經(jīng)激發(fā)，染色的dna分子促發(fā)熒光，檢測(cè)器測(cè)定熒光強(qiáng)度，光信號(hào)到達(dá)檢測(cè)器生成電脈沖信號(hào)，電子系統(tǒng)對(duì)電脈沖信號(hào)進(jìn)一步處理得到圖像信號(hào)；用儀器附帶軟件獲取數(shù)據(jù)并顯示直方圖，計(jì)算g0/1峰的變異系數(shù)(cv(％)＝標(biāo)準(zhǔn)差/平均數(shù)×100)，一般cv值小于3％表示結(jié)果準(zhǔn)確，cv值小于5％基本準(zhǔn)確。將對(duì)照二倍體植株主峰熒光強(qiáng)度調(diào)至200通道處，如待測(cè)植株主峰值處在200通道處視為二倍體，而處在400通道處視為四倍體。

2.有益效果

本發(fā)明將流式細(xì)胞儀應(yīng)用于玉米幼苗倍性的鑒定，建立四倍體青貯玉米的流式細(xì)胞儀倍性鑒定體系。與目前技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是：

(1)該方法不受細(xì)胞所處時(shí)期限制，玉米幼苗長(zhǎng)至4～5葉，取100mg玉米新鮮葉片，不需要過(guò)多的處理步驟，即可檢測(cè)；

(2)測(cè)試速度快，僅用幾分鐘就可以分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，測(cè)定出單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)dna含量，并且dna含量變異可在分布圖上直觀地看出；

(3)靈敏度、分辨率及準(zhǔn)確性較高，數(shù)據(jù)的可重復(fù)性好，特別適合于樣品較多的玉米倍性檢測(cè)分析。

四、附圖說(shuō)明

圖1為以普通二倍體玉米為對(duì)照葉片的dna含量直方圖

圖2為二倍體青貯玉米葉片的dna含量直方圖。

圖3為四倍體青貯玉米葉片的dna含量直方圖。

圖4為二倍體與四倍體的嵌合體青貯玉米葉片的dna含量直方圖。

五、具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種四倍體青貯玉米倍性的鑒定方法，包括：

1.單細(xì)胞懸浮液的制備

ottobuffers分離緩沖液配置：ottoi：100mmol/l檸檬酸，0.5％(v/v)tween20(ph2.3)；ottoii：400mmol/lna2hpo4·12h2o(ph8.9)。

2.待測(cè)樣品的制備

大田或盆栽種植玉米，待玉米幼苗長(zhǎng)至4～5葉，取100mg玉米新鮮葉片，加入1mlottoi中，用剪刀將葉片剪碎，冰孵5-10min，8000r/min離心5min，棄上清，加入1mlottoi1000r/min離心5min，棄上清，加入100μlottoi和200μlottoii混合液，過(guò)300目篩子，加入終濃度為50μg/mlpi染液，暗處理染色15min，過(guò)500目篩子，上機(jī)檢測(cè)。

3.流式細(xì)胞儀倍性分析

測(cè)定前調(diào)校流式細(xì)胞儀使管道暢通，噴嘴清潔，儀器處于最佳狀態(tài)，進(jìn)行flowcheck校正，使各通道的變異系數(shù)(cv)穩(wěn)定在3％以下，熒光強(qiáng)度由儀器自動(dòng)檢出。通過(guò)控制流速保持細(xì)胞分離純度。以普通二倍體玉米遼單527(2n＝20)為對(duì)照，峰值位置與對(duì)照相近的為二倍體，為對(duì)照2倍的為四倍體，從而確定出樣品的倍性水平。

4.結(jié)果與分析

采用ottobuffers制備細(xì)胞核懸液，以二倍體幼嫩葉片材料為對(duì)照，對(duì)青貯玉米幼嫩葉片進(jìn)行了細(xì)胞dna含量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照二倍體植株主峰熒光強(qiáng)度位于約200通道處(圖1)，所以青貯玉米主峰熒光強(qiáng)度與對(duì)照一致(圖2)，為二倍體植株；而青貯玉米主峰熒光強(qiáng)度位于約400通道處(圖3)，這說(shuō)明該株細(xì)胞dna含量為對(duì)照植株的2倍，為四倍體植株。而有些植株，在2處均出現(xiàn)峰值，則說(shuō)明植株體內(nèi)含有2種dna含量的體細(xì)胞，即二倍體和四倍體的嵌合體(圖4)。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種四倍體青貯玉米的倍性鑒定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。利用OTTO?buffers制備細(xì)胞核懸液，采用美國(guó)Becton-Dickinson公司的流式細(xì)胞儀，發(fā)光源為488nm氬離子藍(lán)色激光；測(cè)定DNA分子熒光強(qiáng)度，對(duì)照二倍體植株主峰熒光強(qiáng)度調(diào)至200通道處，如待測(cè)植株主峰值處在200通道處視為二倍體，而處在400通道處視為四倍體。流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)結(jié)果與顯微鏡檢測(cè)及成株期形態(tài)鑒別相一致。應(yīng)用此法，可在幼苗期快速鑒定出四倍體青貯玉米的倍性，提高育種效率。

技術(shù)研發(fā)人員：姜敏;齊欣;劉祥久;王金君;馬駿;弓雪;劉欣芳;李明;李泉木;孟慶國(guó);王金燕;孫甲;孫麗慧;劉鳳寶
受保護(hù)的技術(shù)使用者：遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所;姜敏;齊欣
技術(shù)研發(fā)日：2016.01.28
技術(shù)公布日：2017.08.04