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發(fā)明領(lǐng)域

本公開內(nèi)容涉及鑒定可用于開發(fā)免疫治療劑的突變體肽的方法。

發(fā)明背景

牽涉細胞介導(dǎo)的免疫的細胞毒性t淋巴細胞(細胞毒性t細胞或cd8t細胞)通過在細胞表面上掃描肽表位或抗原監(jiān)測細胞健康的變化。肽表位源自細胞蛋白，并且充當允許細胞呈現(xiàn)當前細胞過程的證據(jù)的顯示機制。處理天然的和非天然的蛋白質(zhì)(通常分別稱為自身和非自體)進行肽表位呈遞。自天然蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和有缺陷的核糖體產(chǎn)物衍生大多數(shù)自身肽?？梢宰允录?諸如病毒性和細菌性感染、疾病和癌癥)過程中生成的蛋白質(zhì)衍生非自身肽。

人腫瘤在特征上含有大量的體細胞突變。繼而，含有突變的肽的表達可以由適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識別為非自身新表位。在識別非自身抗原時，細胞毒性t細胞會觸發(fā)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致展示非自身新表位的細胞的凋亡。細胞毒性t細胞免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的高度特異性機制，并且是用于消除感染的、患病的和癌性的細胞的有效手段。在鑒定免疫原性表位中具有較大的治療價值，因為可以使用經(jīng)由疫苗接種對免疫原性表位的暴露觸發(fā)期望的細胞毒性t細胞免疫應(yīng)答。幾十年來，科學(xué)和醫(yī)學(xué)界中已經(jīng)知道了免疫原性表位的作用，但是鑒定驅(qū)動有效抗腫瘤cd8t細胞應(yīng)答的抗原仍然在很大程度上是未知的。牽涉表位呈現(xiàn)和細胞毒性t細胞活化的復(fù)雜性已經(jīng)使它們的發(fā)現(xiàn)和治療用途陷入困境。

主要組織相容性復(fù)合體(mhc)i類分子負責(zé)肽表位呈遞給細胞毒性t細胞。在人中，人白細胞抗原(hla)系統(tǒng)是編碼mhci類和ii類分子的基因的基因座。hla-a、-b和-c基因編碼mhci類(mhci)蛋白質(zhì)。長度通常為8-11個氨基酸的肽經(jīng)由與由位于反平行β片層上方的兩個α螺旋形成的溝的相互作用結(jié)合mhci分子。肽-mhc類i(pmhci)分子的加工和呈遞牽涉一系列序貫階段，其包括：a)蛋白質(zhì)酶介導(dǎo)的對蛋白質(zhì)的消化；b)與抗原加工有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白(tap)介導(dǎo)的將肽轉(zhuǎn)運入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中；c)使用新合成的mhci分子形成pmhci；和d)將pmhci轉(zhuǎn)運至細胞表面。

在細胞表面上，pmhci會經(jīng)由t細胞受體(tcr)與細胞毒性t細胞相互作用。在復(fù)雜的pmhci-tcr相互作用后，非自身抗原的鑒定可以經(jīng)由由關(guān)聯(lián)的酶、共受體、銜接頭分子、和轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的一系列生物化學(xué)事件而導(dǎo)致細胞毒性t細胞活化?；罨募毎拘詔細胞將會增殖以生成表達對鑒定的免疫原性肽表位特異性的tcr的效應(yīng)t細胞群體。對鑒定的非自身表位具有tcr特異性的t細胞的擴增導(dǎo)致展示活化的非自身表位的細胞的免疫介導(dǎo)的凋亡。

目前正在研究使用免疫原性表位激活免疫系統(tǒng)以用于癌癥療法。雖然癌細胞源自正常組織，但是體細胞突變會驅(qū)動癌癥蛋白酶體的大量變化。繼而，所得的mhci呈遞的肽表位，稱為腫瘤相關(guān)抗原(taa)或新表位，允許正常和癌組織之間的細胞毒性t細胞分化。最近的工作已經(jīng)證實，突變體肽可以充當由cd4或cd8t細胞識別為非自身的表位，但是從此以后已經(jīng)很少描述突變體新表位。

基于肽的免疫療法的使用取決于會刺激期望的細胞毒性t細胞應(yīng)答的肽表位的選擇。具體地，腫瘤抗原可以分成兩類：腫瘤相關(guān)自身抗原(例如癌-睪丸抗原，分化抗原)和自共享的或患者特異性的突變體蛋白衍生的抗原。由于胸腺中自身抗原的呈現(xiàn)可以導(dǎo)致高親合力t細胞的消除，突變體新抗原可能更具免疫原性。此類免疫治療性表位的開發(fā)是一項有挑戰(zhàn)性的追求，并且可用于鑒定有效表位的有效方法尚有待開發(fā)。

在免疫原性肽表位的鑒定和驗證中牽涉的時間和成本密集性性質(zhì)妨礙了有效的基于肽的癌癥疫苗的開發(fā)。為了使鑒定免疫原性表位中牽涉的問題進一步復(fù)雜化，癌細胞中的突變的排列經(jīng)常是患者特異性的。突變體新表位的發(fā)現(xiàn)需要對患者的腫瘤浸潤淋巴細胞費力篩選它們識別抗原的能力，所述抗原來自基于來自所述患者的腫瘤外顯子組序列的信息構(gòu)建的文庫?；蛘?，可以通過質(zhì)譜術(shù)檢測突變體新表位。然而，突變序列已經(jīng)逃避檢測，因為使用不含有患者特異性突變的公共蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫不允許其鑒定。使用諸如肽-mhci結(jié)合或肽免疫原性的預(yù)測算法可以在鑒定個性化免疫原性表位中具有潛在的應(yīng)用。但是，癌細胞中含有的大量體細胞突變和表達水平變化導(dǎo)致預(yù)測的免疫原性表位的量級對于高通量免疫原性篩選而言太大。此外，預(yù)測表位的較差的免疫原性的證據(jù)使當前方法的效用受到質(zhì)疑。

本領(lǐng)域中需要鑒定適合于用于基于肽的免疫療法的免疫原性表位。具體地，本領(lǐng)域中需要鑒定用于基于肽的癌癥療法中的免疫原性表位。此外，本領(lǐng)域中需要用于基于個性化遺傳和/或蛋白質(zhì)組學(xué)分析預(yù)測免疫原性表位的高通量方法。

在此通過提及收錄本文中引用的所有參考文獻。

發(fā)明概述

在一方面，本申請?zhí)峁┝髓b定疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)提供個體中的疾病組織的變體編碼序列組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；并且b)自所述變體編碼序列組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由所述變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，所述方法包括a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中的疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列編碼的肽結(jié)合mhci類分子(mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組；并且d)自第三組選擇免疫原性變體編碼序列，包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性；由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，依照上文描述的任何方法，方法還包括i)自疾病組織獲得多個與mhci分子結(jié)合的肽；ii)使mhci結(jié)合肽受到基于質(zhì)譜術(shù)的測序；iii)將mhci結(jié)合肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與免疫原性變體編碼序列關(guān)聯(lián)。

在另一方面，本申請?zhí)峁┝髓b定疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)自個體的患病組織獲得與mhc分子結(jié)合的多個肽；b)使mhc結(jié)合的肽經(jīng)受基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且c)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與個體中的疾病組織的變體編碼序列組關(guān)聯(lián)，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，所述方法包括a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中的疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列編碼的肽結(jié)合mhci類分子(mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組；d)自疾病組織獲得與mhci分子結(jié)合的多個肽；e)使mhci結(jié)合肽經(jīng)受基于質(zhì)譜術(shù)的測序；f)將mhci結(jié)合肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第三組關(guān)聯(lián)；由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括預(yù)測疾病特異性免疫原性突變體肽的免疫原性，其中疾病特異性免疫原性突變體肽包含變體氨基酸。

依照包括預(yù)測免疫原性的步驟的任何上文描述的方法，預(yù)測免疫原性基于下列一項或多項參數(shù)：i)肽對mhci分子的結(jié)合親和力；ii)含有肽的肽前體的蛋白質(zhì)水平；iii)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達水平；iv)通過免疫蛋白酶體對肽前體的加工效率；v)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達時機；vi)肽對tcr分子的結(jié)合親和力；vii)變體氨基酸在肽內(nèi)的位置；xiii)在與mhci分子結(jié)合時肽的溶劑暴露；ix)在與mhci分子結(jié)合時變體氨基酸的溶劑暴露；和x)肽中芳香族殘基的含量；xi)在與野生型殘基相比時變體氨基酸的特性；xii)肽前體的性質(zhì)。在一些實施方案中，預(yù)測免疫原性進一步基于hla分型分析。

在一些實施方案中，依照包括自疾病組織獲得與mhci分子結(jié)合的多個肽的步驟的上文描述的方法之任一種，通過自疾病組織分離mhci/肽復(fù)合物并且自mhci洗脫肽獲得與mhci結(jié)合的肽。在一些實施方案中，通過免疫沉淀實施mhci/肽復(fù)合物的分離。在一些實施方案中，使用對mhci特異的抗體實施免疫沉淀。在一些實施方案中，在進行質(zhì)譜術(shù)分析前通過層析進一步分開所分離的肽。

在一些實施方案中，依照包括獲得變體編碼序列的第一組的步驟的上文描述的方法之任一種，獲得變體編碼序列的第一組包括i)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得變體序列的第一組，每種變體序列與參照樣品相比具有序列中的變異；并且ii)自變體序列的第一組鑒定變體編碼序列。

在一些實施方案中，依照上文描述的任何方法，其中方法還包括基于鑒定的疾病特異性免疫原性突變體肽的序列合成肽。在一些實施方案中，依照上文描述的任何方法，方法還包括基于鑒定的疾病特異性免疫原性突變體肽的序列合成編碼肽的核酸。在一些實施方案中，方法還包括在體內(nèi)對合成的肽測試免疫原性。

在一些實施方案中，依照上文描述的任何方法，疾病是癌癥。在一些實施方案中，依照上文描述的任何方法，個體是人。

在另一方面，本申請還提供了通過本文中描述的任何方法鑒定的疾病特異性突變體肽或疾病特異性突變體肽的組合物。在一些實施方案中，組合物包含兩種或更多種本文中描述的疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，組合物還包含佐劑。

在又一方面，本申請還提供了治療個體中的疾病的方法，其包括對個體施用有效量的組合物，所述組合物包含用本文中公開的用于鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽的任何方法鑒定的疾病特異性突變體肽。在一些實施方案中，個體是鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽的同一個體。

本申請還提供了免疫原性組合物，其包含至少一種疾病特異性肽或此類疾病特異性肽的前體，其中通過本文中描述的任何方法鑒定所述疾病特異性肽。在一些實施方案中，免疫原性組合物包含多種疾病特異性肽。

本申請還提供了包含至少一種編碼疾病特異性肽的核酸的免疫原性組合物，其中通過本文中描述的任何方法鑒定所述疾病特異性肽。在一些實施方案中，免疫原性組合物包含多種各自編碼至少一種疾病特異性肽的核酸。在一些實施方案中，免疫原性組合物包含編碼兩種或更多種(諸如3、4、5、6、7、8、9或更多種)疾病特異性肽的核酸。

在又一方面，本申請還提供了在具有疾病的個體中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括施用本文中描述的任何免疫原性組合物。在一些實施方案中，方法還包括施用另一種藥劑。在一些實施方案中，另一種藥劑是免疫調(diào)節(jié)劑。在一些實施方案中，另一種藥劑是檢查點蛋白。在一些實施方案中，其它藥劑是pd-1的拮抗劑(諸如抗pd1抗體)。在一些實施方案中，其它藥劑是pd-l1的拮抗劑(諸如抗pd-l1抗體)。

在另一方面，本申請還提供了在具有疾病的個體中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括：a)依照上文描述的鑒定方法之任一種自個體中的疾病組織鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽，b)基于鑒定的疾病特異性免疫原性突變體肽的序列生成包含肽或編碼肽的核酸的組合物；c)對個體施用組合物。在一些實施方案中，方法還包括對個體施用pd-1拮抗劑(諸如抗pd1抗體)。在一些實施方案中，方法還包括對個體施用pd-l1拮抗劑(諸如抗pd-l1抗體)。

附圖簡述

圖1顯示了免疫原性肽鑒定的例示性方法。

圖2a顯示了相對于測量的每百萬個定位讀段每千堿基外顯子模型的讀段(rpkm)，鑒定為mc-38細胞系的mhc分子上呈遞的表位的鑒定基因的分布。

圖2b顯示了相對于測量的rpkm，鑒定為tramp-c1細胞系的mhc分子上呈遞的表位的鑒定基因的分布。

圖3顯示了與mhc分子結(jié)合的肽的結(jié)構(gòu)建模。

圖4a顯示了用選擇肽免疫的野生型c57bl/6小鼠中肽特異性cd8t細胞的百分比。

圖4b顯示了脾和腫瘤中dextramer陽性cd8t細胞的百分比。

圖4c顯示了相對于腫瘤體積的cd8t細胞和cd45t細胞的測量。

圖4d顯示了在總cd8til群體和adpgk陽性cd8til群體中共表達pd-1和tim-3的腫瘤特異性cd8til的百分比。

圖5a顯示了用mc-38腫瘤細胞的腫瘤攻擊后用對照和免疫原性疫苗處理的小鼠的腫瘤體積，和疫苗接種后adpgk陽性cd8t細胞的百分比。箭標示來自單一動物的測量。

圖5b顯示脾和腫瘤中肽特異性cd8t細胞的百分比。

圖5c顯示了以表達cd45的t細胞和表達cd8的t細胞測量的腫瘤中活細胞的百分比。

圖5d顯示了疫苗接種后總cd8t細胞群體中共表達pd-1和tim-3的adgpk特異性cd8til的百分比。

圖5e顯示了疫苗接種后pd-1和tim-3表面表達水平。

圖5f顯示了疫苗接種后腫瘤和脾臟中表達ifn-γ的cd8和cd4til的百分比。

圖5g顯示了疫苗接種后腫瘤體積的測量。

發(fā)明詳述

本申請?zhí)峁┝擞糜阼b定疾病特異性免疫原性突變體肽的高效率篩選平臺。通過將基于序列的變體鑒定方法與免疫原性預(yù)測和/或質(zhì)譜術(shù)組合，本文中描述的方法允許自個體的疾病組織(諸如腫瘤細胞)有力且有效鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。這些肽或基于核苷酸的前體(例如dna或rna)可用于多種不同的應(yīng)用，諸如疫苗的開發(fā)、突變體肽特異性治療劑(諸如抗體治療劑或基于t細胞受體(“tcr”)的治療劑)的開發(fā)、以及用于監(jiān)測t細胞應(yīng)答的動力學(xué)和分布的工具的開發(fā)。例如，可以利用個別的肽或肽組進行比較結(jié)合親和力測量或?qū)€別的肽或肽組多聚化以通過mhc多聚體流式細胞術(shù)測量抗原特異性t細胞應(yīng)答。本文中描述的方法在個性化醫(yī)學(xué)的背景中是特別有用的，其中可以使用自患病個體鑒定的突變體肽開發(fā)用于治療相同個體的治療劑(例如基于肽、dna、或rna的疫苗)。

如此，在一方面，本申請?zhí)峁┝俗詡€體的疾病組織鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其通過組合基于序列的變體鑒定方法與免疫原性預(yù)測進行。

在另一方面，本申請?zhí)峁┝俗詡€體的患病組織鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其通過將基于序列的變體鑒定方法與質(zhì)譜術(shù)組合進行。

還提供了可用于本文中描述方法的試劑盒和系統(tǒng)。進一步包括免疫原性組合物，其包含肽、呈遞此類肽的細胞、和編碼鑒定的此類肽的核酸。

定義

如本公開內(nèi)容中使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述/該”具體還涵蓋它們所指的術(shù)語的復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確規(guī)定。本文中提及“約”數(shù)值或參數(shù)包括(并且描述)針對所述數(shù)值或參數(shù)本身的變化。例如，提及“約x”的描述包括“x”的描述。

應(yīng)當理解，本文中描述的本發(fā)明的方面和實施方案包括“由方面和實施方案組成”和/或“基本上由方面和實施方案組成”。

如本文中使用的，“疾病特異性突變體肽”是指包含存在于疾病組織中但不在正常組織中的至少一種突變氨基酸的肽?！凹膊√禺愋悦庖咴酝蛔凅w肽”是指能夠在個體中引發(fā)免疫應(yīng)答的疾病特異性突變體肽。疾病特異性突變體肽可以源自例如：導(dǎo)致蛋白質(zhì)中不同氨基酸的非同義突變(例如點突變)；連讀突變，其中修飾或刪除終止密碼子，導(dǎo)致在c端具有新的腫瘤特異性序列的較長蛋白質(zhì)的翻譯；剪接位點突變，其導(dǎo)致成熟mrna中的內(nèi)含子納入，并且如此產(chǎn)生獨特的腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列；染色體重排，其產(chǎn)生在2種蛋白質(zhì)的接合處具有腫瘤特異性序列的嵌合蛋白(即基因融合)；和移碼突變或刪除，其導(dǎo)致具有新腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列的新可讀框。參見例如sensi和anichini,clincancerres,2006,v.12,5023-5032。

如本文中使用的，“變體編碼序列”是指與參照樣品中的序列相比具有變異的序列，其中序列變異導(dǎo)致變體編碼序列中含有的或由變體編碼序列編碼的氨基酸序列的變化。變體編碼序列可以是具有導(dǎo)致編碼氨基酸序列中的氨基酸變化的突變的核酸序列?；蛘?，變體編碼序列可以是含有氨基酸突變的氨基酸序列。

“表達變體編碼序列”是指在個體的疾病組織中表達的變體編碼序列。

“編碼”肽的核酸序列是指含有肽的編碼序列的核酸?！熬幋a”肽的氨基酸序列是指含有肽序列的氨基酸序列。

“表位變體編碼序列”是指編碼結(jié)合或預(yù)測結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的肽的變體編碼序列。

“免疫原性變體編碼序列”是指編碼預(yù)測為免疫原性的肽的變體編碼序列。

如本文中使用的，術(shù)語“疾病組織”是指與個體中的疾病相關(guān)的組織，并且包括多個細胞?！凹膊〗M織樣品”是指疾病組織的樣品。

本文中使用的“肽前體”是指存在于包含感興趣肽的個體的疾病組織中的多肽。例如，肽前體可以是存在于疾病組織中的多肽，其可以通過免疫蛋白酶體加工以生成感興趣的肽。

鑒定免疫原性突變體肽的方法

在一方面，本申請的方法將序列特異性變體鑒定方法與免疫原性預(yù)測方法組合。例如，在一些實施方案中，提供了自個體中的疾病組織鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)提供個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；并且b)自變體編碼序列的第一組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，所述疾病特異性免疫原性突變體肽充當疾病組織中的新表位。在一些實施方案中，變體編碼序列組包含超過1、10、100、1000或10,000種不同變體編碼序列。在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；并且b)自變體編碼序列的第一組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，選擇步驟包括基于一項或多項(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一種)參數(shù)預(yù)測肽的免疫原性：i)肽對mhci分子的結(jié)合親和力；ii)含有肽的肽前體的蛋白質(zhì)水平；iii)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達水平；iv)通過免疫蛋白酶體對肽前體的加工效率；v)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達時機；vi)肽對tcr分子的結(jié)合親和力；vii)變體氨基酸在肽內(nèi)的位置；xiii)在與mhci分子結(jié)合時肽的溶劑暴露；ix)在與mhci分子結(jié)合時變體氨基酸的溶劑暴露；和x)肽中芳香族殘基的含量；xi)在與野生型殘基相比時變體氨基酸的特性(例如自帶電荷變化至疏水性或者反之亦然)；xii)肽前體的性質(zhì)。

在一些實施方案中，可以首先過濾變體編碼序列的第一組以獲得編碼預(yù)測結(jié)合mhc分子的肽的變體編碼序列(稱為“表位變體編碼序列”)的較小組，然后基于免疫原性的預(yù)測對變體編碼序列的較小組進行選擇。在此類實施方案中，方法可以包括：a)提供個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，并且c)自表位變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，并且c)自表位變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；并且b)自變體編碼序列的第一組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，通過全基因組測序獲得基因組序列。在一些實施方案中，通過全外顯子組測序獲得基因組序列。在一些實施方案中，通過靶向基因組或外顯子組測序獲得基因組序列。例如，可以首先通過探針組(例如對疾病關(guān)聯(lián)基因特異性的探針)富集疾病組織和/或參照樣品中的基因組序列，之后加工以進行變體鑒定。在一些實施方案中，可以首先過濾變體編碼序列的第一組以獲得表位變體編碼序列的較小組，然后基于免疫原性的預(yù)測對變體編碼序列的較小組進行選擇。例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，并且c)自表位變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，該疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；并且b)自變體編碼序列的第一組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，通過全轉(zhuǎn)錄物組rna-seq測序獲得轉(zhuǎn)錄物組序列。在一些實施方案中，通過靶向轉(zhuǎn)錄物組測序獲得轉(zhuǎn)錄序列。例如，可以首先通過探針組(例如對疾病關(guān)聯(lián)基因特異性的探針)富集疾病組織和/或參照樣品中的rna或cdna序列，然后加工以進行變異鑒定。在一些實施方案中，可以首先過濾變體編碼序列的第一組以獲得表位變體編碼序列的較小組，然后對變體編碼序列的較小組進行免疫原性的預(yù)測。例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由表位變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，并且c)自變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；并且c)自表達變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表達變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)基于個體中疾病組織的基因組序列獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；并且c)自表達變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表達變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，可以過濾表達變體編碼序列的第二組以獲得表位變體編碼序列的較小組，然后對變體編碼序列的較小組進行免疫原性的預(yù)測。如此，例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中疾病組織的基因組序列，提供個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列的第二組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組；并且d)自表位變體編碼序列的第三組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)基于個體中疾病組織的基因組序列獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列的第二組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組，并且d)自表位變體編碼序列的第三組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由表位變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，通過將變體編碼序列信息與同mhc分子物理結(jié)合的肽的信息關(guān)聯(lián)進一步驗證通過本文中描述的方法鑒定的疾病特異性免疫原性突變體肽。例如，方法可以還包括：自疾病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與預(yù)測為免疫原性變體編碼序列的肽關(guān)聯(lián)。在下文部分中進一步描述質(zhì)譜術(shù)和關(guān)聯(lián)方法。

另一方面，提供了將序列特異性變體鑒定方法與質(zhì)譜術(shù)分析組合的方法。例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；b)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且c)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與個體中疾病組織的變體編碼序列的組關(guān)聯(lián)，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，通過自疾病組織分離mhc/肽復(fù)合物(例如通過免疫沉淀)并且自mhc洗脫肽獲得與mhc結(jié)合的多個肽。在一些實施方案中，對肽進行串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)。在一些實施方案中，基于質(zhì)譜術(shù)的測序包括對肽進行質(zhì)譜術(shù)，并且將質(zhì)譜術(shù)譜與參照譜(諸如由參照樣品中的序列編碼的推定蛋白質(zhì)的假設(shè)的質(zhì)譜術(shù)譜)比較。在一些實施方案中，在關(guān)聯(lián)步驟前通過肽長度和/或錨基序的存在過濾質(zhì)譜術(shù)序列信息。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；c)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且d)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與變體編碼序列的第一組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，可以過濾變體編碼序列的第一組以獲得編碼預(yù)測結(jié)合mhc分子的肽的變體編碼序列(下文稱為“表位變體編碼序列”)的較小組，然后對變體編碼序列的較小組進行關(guān)聯(lián)分析。在此類實施方案中，方法可以包括：a)提供個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列，獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；c)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且d)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與變體編碼序列的第一組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，通過全基因組測序獲得基因組序列。在一些實施方案中，通過全外顯子組測序獲得基因組序列。在一些實施方案中，通過靶向基因組或外顯子組測序獲得基因組序列。例如，可以首先通過探針組(例如對疾病關(guān)聯(lián)基因特異性的探針)富集疾病組織和/或參照樣品中的基因組序列，之后加工以進行變體鑒定。

在一些實施方案中，可以過濾變體編碼序列的第一組以獲得編碼預(yù)測結(jié)合mhc分子的肽的變體編碼序列(下文稱為“表位變體編碼序列”)的較小組，然后對變體編碼序列的較小組進行免疫原性的預(yù)測。例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列，獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；c)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且d)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與變體編碼序列的第一組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，通過全轉(zhuǎn)錄物組rna-seq測序獲得轉(zhuǎn)錄物組序列。在一些實施方案中，通過靶向轉(zhuǎn)錄物組測序獲得轉(zhuǎn)錄物組序列。例如，可以首先通過探針組(例如對疾病關(guān)聯(lián)基因特異性的探針)富集疾病組織和/或參照樣品中的rna序列或cdna序列，之后加工以進行變體鑒定。在一些實施方案中，可以過濾變體編碼序列的第一組以獲得表位變體編碼序列的較小組，然后對變體編碼序列的較小組進行免疫原性的預(yù)測。例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表達變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)基于個體中疾病組織的基因組序列獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表達變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。

在一些實施方案中，可以過濾表達變體編碼序列的第二組以獲得表位變體編碼序列的較小組，然后對變體編碼序列的較小組進行免疫原性的預(yù)測。如此，例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中疾病組織的基因組序列，提供個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列的第二組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組，d)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；e)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且f)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第三組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)基于個體中疾病組織的基因組序列獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列的第二組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組，d)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；e)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且f)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第三組關(guān)聯(lián)，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，通過預(yù)測肽的免疫原性進一步選擇通過本文中描述的基于質(zhì)譜術(shù)的方法鑒定的疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，選擇步驟包括基于一項或多項(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一種)參數(shù)預(yù)測肽的免疫原性：i)肽對mhci分子的結(jié)合親和力；ii)含有肽的肽前體的蛋白質(zhì)水平；iii)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達水平；iv)通過免疫蛋白酶體對肽前體的加工效率；v)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達時機；vi)肽對tcr分子的結(jié)合親和力；vii)變體氨基酸在肽內(nèi)的位置；xiii)在與mhci分子結(jié)合時肽的溶劑暴露；ix)在與mhci分子結(jié)合時變體氨基酸的溶劑暴露；和x)肽中芳香族殘基的含量；和xi)肽前體的性質(zhì)。

如此，例如，在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；b)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且c)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與個體中疾病組織的變體編碼序列的組關(guān)聯(lián)，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異，以獲得變體編碼序列的第二組，并且d)自變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第二組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；c)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；d)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與變體編碼序列的第一組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第二組，并且e)自變體編碼序列的第二組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第二組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)提供個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第三組，并且f)自變體編碼序列的第三組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第三組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)獲得個體中疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于由變體編碼序列的第一組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第一組選擇表位變體編碼序列的第二組，c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第三組，并且f)自變體編碼序列的第三組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第三組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列提供個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽，d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第三組，并且g)自變體編碼序列的第三組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第三組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽，d)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且e)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表達變體編碼序列的第二組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第三組，并且g)自變體編碼序列的第三組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第三組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

在一些實施方案中，提供了鑒定來自個體中的疾病組織的疾病特異性免疫原性突變體肽的方法，其包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列提供個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列的第二組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組，d)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；e)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且f)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第三組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第四組，并且g)自變體編碼序列的第四組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第四組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法包括：a)基于個體中的疾病組織的基因組序列獲得個體中的疾病組織的變體編碼序列的第一組，每種變體編碼序列與參照樣品相比具有序列中的變異；b)基于個體中疾病組織的轉(zhuǎn)錄物組序列，自第一組選擇表達變體編碼序列的第二組；c)基于由表達變體編碼序列的第二組編碼的肽結(jié)合mhc分子(諸如mhci類分子或mhci)的預(yù)測能力，自第二組選擇表位變體編碼序列的第三組，d)自個體的患病組織獲得多個與mhc分子結(jié)合的肽；e)對mhc結(jié)合的肽進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序；并且f)將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與表位變體編碼序列的第三組關(guān)聯(lián)，以獲得變體編碼序列的第四組，并且g)自變體編碼序列的第四組選擇免疫原性變體編碼序列，其中選擇步驟包括預(yù)測包含由變體編碼序列的第四組編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性，由此鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，方法還包括通過功能性分析驗證疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，疾病是癌癥。在一些實施方案中，個體是人個體(諸如具有癌癥的人個體)。

本文中還提供通過本文中描述的任一種方法獲得的疾病特異性免疫原性突變體肽。例如，可以使用疾病特異性免疫原性突變體肽生成用于治療疾病的組合物(諸如疫苗組合物)。或者，可以使用疾病特異性免疫原性突變體肽生成突變體肽特異性治療劑，諸如治療性抗體。

本文中描述的方法在個性化醫(yī)學(xué)背景下是特別有用的，其中使用通過本文中描述的任一種方法獲得的疾病特異性免疫原性突變體肽開發(fā)用于同一個體的治療劑(諸如疫苗或治療性抗體)。如此，例如，在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括：a)鑒定個體中疾病特異性免疫原性突變體肽；并且b)合成肽；并且c)對個體施用肽。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括：a)自個體獲得疾病組織樣品；b)鑒定個體中的疾病特異性免疫原性突變體肽；并且c)合成肽；并且d)對個體施用肽。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括：a)鑒定個體中的疾病特異性免疫原性突變體肽；b)生成特異性識別突變體肽的抗體(或tcr類似物，諸如可溶性tcr)；并且c)對個體施用肽。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括：a)自個體獲得疾病組織樣品；b)鑒定個體中的疾病特異性免疫原性突變體肽；c)生成特異性識別突變體肽的抗體(或tcr類似物，諸如可溶性tcr)；并且d)對個體施用肽。在一些實施方案中，鑒定步驟將序列特異性變體鑒定方法與免疫原性預(yù)測方法組合。在一些實施方案中，鑒定步驟將序列特異性變體鑒定方法與質(zhì)譜術(shù)組合?？梢詫⒈疚闹忻枋龅蔫b定疾病特異性免疫原性突變體肽的任何方法用于本文中描述的治療方法。

獲得變體編碼序列

本文中在各種實施方案中描述的方法包括提供和/或獲得變體編碼序列。一般可以例如通過對個體的疾病組織樣品中的基因組或rna序列測序，并將序列與自參照樣品獲得的序列進行比較來獲得變體編碼序列。

在一些實施方案中，疾病組織是血液。在一些實施方案中，疾病組織是固體組織(諸如實體瘤)。在一些實施方案中，疾病組織是細胞的集合(例如血液中的循環(huán)癌細胞)。在一些實施方案中，疾病組織是淋巴細胞的集合。在一些實施方案中，疾病組織是白細胞的集合。在一些實施方案中，疾病組織是上皮細胞的集合。在一些實施方案中，疾病組織是結(jié)締組織。在一些實施方案中，疾病組織是生殖細胞和/或多能細胞的集合。在一些實施方案中，疾病組織是胚細胞的集合。

合適的疾病組織樣品包括但不限于腫瘤組織、與腫瘤相鄰的正常組織、腫瘤遠端的正常組織、或外周血淋巴細胞。在一些實施方案中，疾病組織樣品是腫瘤組織。在一些實施方案中，疾病組織樣品是含有癌細胞的活檢，諸如癌細胞(例如胰腺癌細胞)的細針抽吸或腹腔鏡檢查獲得的癌細胞(例如胰腺癌細胞)。在一些實施方案中，將活檢的細胞離心成團粒，固定，并且在石蠟中包埋，之后分析。在一些實施方案中，在分析前快速冷凍活檢的細胞。

在一些實施方案中，疾病組織樣品包含循環(huán)轉(zhuǎn)移癌細胞。在一些實施方案中，通過自血液分選循環(huán)腫瘤細胞(ctc)獲得疾病組織樣品。在另一個實施方案中，ctc已經(jīng)自原發(fā)性腫瘤脫離并在體液中循環(huán)。在又一個實施方案中，ctc已經(jīng)自原發(fā)性腫瘤脫離并在血流中循環(huán)。在另一個實施方案中，ctc是轉(zhuǎn)移的指示。在一些實施方案中，ctc是胰腺癌細胞。在一些實施方案中，ctc是結(jié)腸直腸癌細胞。在一些實施方案中，ctc是非小細胞肺癌細胞。

可以基于個體中的疾病組織中的基因組序列鑒定變異。例如，可以自個體的疾病組織獲得基因組dna并進行測序分析。然后，將如此獲得的序列與自參照樣品獲得的序列比較。在一些實施方案中，對疾病樣品進行全基因組測序。在一些實施方案中，將疾病樣品進行全外顯子組測序，即僅對基因組序列中的外顯子測序。在一些實施方案中，在與參照樣品比較前，對基因組序列“富集”特定序列。例如，可以設(shè)計特異性探針以在進行測序分析前富集某些期望的序列(例如疾病特異性序列)。全基因組測序、全外顯子組測序和靶向測序的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且報告于例如bentley,d.r.etal.,accuratewholehumangenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry,nature,2008,v.456,53-59；choi,m.etal.,geneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparalleldnasequencing,proceedingsofthenationalacademyofsciences,2009,ν.106(45),19096-19101；及ng,s.b.etal.,targetedcaptureandmassivelyparallelsequencingof12humanexomes,nature,2009,v.461,272-276，在此通過提及收錄它們。

在一些實施方案中，基于個體中疾病組織中的轉(zhuǎn)錄物組序列鑒定變異。例如，可以自個體中的疾病組織獲得全部或部分轉(zhuǎn)錄物組序列(例如通過諸如rna-seq的方法)并進行測序分析。然后，將如此獲得的序列與自參照樣品獲得的序列比較。在一些實施方案中，將疾病樣品進行全轉(zhuǎn)錄物組rna-seq測序。在一些實施方案中，在與參照樣品比較前，對轉(zhuǎn)錄物組序列“富集”特定序列。例如，可以設(shè)計特異性探針以在進行測序分析前富集某些期望的序列(例如疾病特異性序列)。全轉(zhuǎn)錄物組測序和靶向測序的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且報告于例如tang,f.etal.,mrna-seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell,naturemethods,2009,v.6,377-382；ozsolak,f.,rnasequencing:advances,challengesandopportunities,naturereviews,2011,v.12,87-98；german,m.aetal.,globalidentificationofmicrorna-targetrnapairsbyparallelanalysisofrnaends,naturebiotechnology,2008,v.26,941-946；及wang,z.etal.,rna-seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics,naturereviews,2009,v.10,p.57-63。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)錄物組測序技術(shù)包括但不限于rna聚(a)文庫、微陣列分析、平行測序、大規(guī)模平行測序、pcr和rna-seq。rna-seq是一種用于對部分或基本上整個轉(zhuǎn)錄物組測序的高通量技術(shù)。簡言之，用與一個或兩個末端附著的銜接頭將轉(zhuǎn)錄物組序列的分離的群體轉(zhuǎn)化成cdna片段的文庫。在擴增或不擴增的情況中，然后分析每種cdna分子以獲得序列信息的短區(qū)段，通常為30-400個堿基對。然后，將序列信息的這些片段與參照基因組、參照轉(zhuǎn)錄物比對或者從頭裝配以揭示轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)(即轉(zhuǎn)錄邊界)和/或表達水平。

一旦獲得，可以將疾病組織中的序列與參照樣品中的相應(yīng)序列比較?？梢栽诤怂崴竭M行序列比較，其通過將疾病組織中的核酸序列與參照樣品中的相應(yīng)序列比對進行。然后，鑒定導(dǎo)致編碼氨基酸的一種或多種變化的序列變異?；蛘撸梢栽诎被崴竭M行序列比較，也就是說，在實施比較前首先在計算機上將核酸序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列。

在一些實施方案中，可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，諸如手動比對、fast-a11(fasta)和基本局部比對搜索工具(blast)完成來自疾病組織的序列與參照的序列的比較。通過blast完成的序列比較需要疾病序列的輸入和參照序列的輸入。blast通過首先鑒定兩種序列之間的短序列匹配(稱為接種的過程)將疾病序列與參照數(shù)據(jù)庫比較。一旦找到序列匹配，則使用評分矩陣實施序列比對的擴展。

在一些實施方案中，參照樣品是匹配的無疾病的組織樣品。如本文中使用的，“匹配的”無疾病的組織樣品是選自與疾病組織相同或相似組織類型的組織樣品。在一些實施方案中，匹配的無疾病的組織和疾病組織可以源自同一個體。在一些實施方案中，本文中描述的參照樣品是來自同一個體的無疾病的樣品。在一些實施方案中，參照樣品是來自不同個體(例如沒有疾病的個體)的無疾病的樣品。在一些實施方案中，參照樣品是自不同個體的群體獲得的。在一些實施方案中，參照樣品是與生物體相關(guān)的已知基因的數(shù)據(jù)庫。在一些實施方案中，參照樣品可以是與生物體相關(guān)的已知基因和來自匹配的無疾病的組織樣品的基因組信息的組合。在一些實施方案中，變體編碼序列可以編碼或包含氨基酸序列中的點突變。在一些實施方案中，變體編碼序列可以編碼或包含氨基酸刪除或插入。

在一些實施方案中，首先基于基因組序列鑒定變體編碼序列的組。然后，進一步過濾此初始組，以基于轉(zhuǎn)錄物組測序數(shù)據(jù)庫中變體編碼序列的存在獲得較窄的表達變體編碼序列組(并且如此視為“表達的”)。在一些實施方案中，通過過濾通過轉(zhuǎn)錄物組測序數(shù)據(jù)庫將變體編碼序列的組減少至少約10、20、30、40、50或更多倍。

在一些實施方案中，變體編碼序列是源自導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的不同氨基酸的非同義突變(例如點突變)的序列。在一些實施方案中，變體編碼序列是源自連讀突變的序列，在所述連讀突變中修飾或刪除終止密碼子，導(dǎo)致在c端具有新的腫瘤特異性序列的較長蛋白質(zhì)的翻譯。在一些實施方案中，變體編碼序列是源自剪接位點突變的序列，所述剪接位點突變導(dǎo)致在成熟mrna中內(nèi)含子的納入，并且如此導(dǎo)致獨特的腫瘤特異性蛋白序列。在一些實施方案中，變體編碼序列是源自染色體重排的序列，所述染色體重排產(chǎn)生在2種蛋白質(zhì)的接合處具有腫瘤特異性序列的嵌合蛋白(即基因融合)。在一些實施方案中，變體編碼序列是源自導(dǎo)致具有新腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列的新可讀框的移碼突變或刪除的序列。在一些實施方案中，變體編碼序列是源自超過一種突變的序列。在一些實施方案中，變體編碼序列是源自超過一種突變機制的序列。

獲得表位變體編碼序列

過濾本文中在一些實施方案中描述的變體編碼序列以獲得編碼預(yù)測結(jié)合mhc分子的肽的變體編碼序列(“表位變體編碼序列”)的較小組。在一些實施方案中，通過過濾通過mhc結(jié)合預(yù)測過程將所述組的變體編碼序列減少至少約10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300或更多倍。

可以通過預(yù)測算法(諸如netmhc)評估由變體編碼序列編碼的肽結(jié)合mhc(諸如mhci)的能力。簡言之，netmhc是一種使用來自免疫表位數(shù)據(jù)庫和分析資源(iedb)的親和力數(shù)據(jù)和來自syfpeithi的洗脫數(shù)據(jù)兩者對定量肽數(shù)據(jù)訓(xùn)練的算法?？梢詫﹂L度為8和14個之間的氨基酸的肽進行mhci結(jié)合的預(yù)測。netmhc使用對來自55種mhc等位基因(43種人和12種非人)的9聚體氨基酸序列訓(xùn)練的預(yù)測器。為了允許預(yù)測較短的輸入序列，netmhc實際上會擴展8聚體氨基酸序列。對于長于9聚體的輸入序列，netmhc會產(chǎn)生輸入序列內(nèi)含有的所有可能的9聚體氨基酸序列。netmhc然后使用訓(xùn)練的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和位置特定評分矩陣來預(yù)測mhc結(jié)合。

選擇免疫原性變體編碼序列

本文中在一些實施方案中提供的方法還包括選擇免疫原性變體編碼序列，其包括預(yù)測包含由變體編碼序列編碼的變體氨基酸的肽的免疫原性?？梢岳缤ㄟ^考慮肽和相應(yīng)的肽前體的一種或多種參數(shù)預(yù)測肽為免疫原性的可能性的方法(諸如在計算機程序中)實施免疫原性的預(yù)測。這些參數(shù)包括但不限于i)肽對mhci分子的結(jié)合親和力；ii)含有肽的肽前體的蛋白質(zhì)水平；iii)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達水平；iv)通過免疫蛋白酶體對肽前體的加工效率；v)編碼肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達時機；vi)肽對tcr分子的結(jié)合親和力；vii)變體氨基酸在肽內(nèi)的位置；xiii)在與mhci分子結(jié)合時肽的溶劑暴露；ix)在與mhci分子結(jié)合時變體氨基酸的溶劑暴露；和x)肽中芳香族殘基的含量；和xi)肽前體的性質(zhì)。在一些實施方案中，免疫原性基于本文中描述的參數(shù)的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10項。

在一些實施方案中，使用肽對mhc分子的結(jié)合親和力預(yù)測免疫原性。肽對mhc分子的結(jié)合親和力可以預(yù)測pmhc的穩(wěn)定性，其繼而可以允許pmhc的延長呈現(xiàn)，如此增加細胞表面暴露以與免疫細胞潛在相互作用?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)預(yù)測結(jié)合親和力，諸如rankpep、mhcbench、nhlapred、svmhc、netmhcpan和popi，其基于諸如人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、平均相對結(jié)合矩陣、定量矩陣和穩(wěn)定化矩陣法的方法。在一些實施方案中，肽對mhc的結(jié)合親和力基于位于已知錨定位置中的特定氨基酸殘基(牽涉mhc結(jié)合的氨基酸)的存在。在一些實施方案中，對肽中的每個殘基評估其對結(jié)合的貢獻。在一些實施方案中，用已知結(jié)合mhc的肽訓(xùn)練分析系統(tǒng)。在一些實施方案中，計算肽-mhc分子的結(jié)合能。在一些實施方案中，使用結(jié)合閾值評估肽結(jié)合mhc的預(yù)測親和力，例如ic50值<500nm。

在一些實施方案中，使用疾病組織中肽前體的表達水平預(yù)測免疫原性。在一些實施方案中，以生物化學(xué)法(諸如western印跡和elisa)測量蛋白質(zhì)水平。在一些實施方案中，可以通過已知的定量質(zhì)譜術(shù)技術(shù)測量蛋白質(zhì)水平。如lagruta等人證明的，疾病組織中肽前體的高表達水平可以與預(yù)測的免疫原性關(guān)聯(lián)。如描述的，補料入表位加工途徑中的較大量的肽前體的利用度與增加的表位呈遞和免疫原性應(yīng)答正相關(guān)(lagruta,n.l.etal.,avirus-specificcd8+tcellimmunodominancehierarchydeterminedbyantigendoseandprecursorfrequencies,proceedingsofthenationalacademyofsciences,2006,v.103,994-999，在此通過提及將其收錄)。

在一些實施方案中，可以使用編碼疾病組織中的肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達水平預(yù)測免疫原性。在一些實施方案中，通過rt-pcr測量rna表達水平。在一些實施方案中，通過測序分析測量rna表達水平。如上文討論，增加肽前體對表位加工途徑的利用度與源自所述肽前體的所述表位相關(guān)的免疫原性應(yīng)答正相關(guān)。此外，已經(jīng)觀察到mrna水平和蛋白質(zhì)豐度之間的正關(guān)聯(lián)(ghaemmaghami,s.etal.,globalanalysisofproteinexpressioninyeast,nature,2003,v.425,737-741，在此通過提及將其收錄)。因此，可以使用編碼疾病組織中的肽前體的轉(zhuǎn)錄物的表達水平預(yù)測免疫原性。

在一些實施方案中，使用通過免疫蛋白酶體對肽前體的加工效率預(yù)測免疫原性。如本文中使用的，肽前體的“加工效率”是指表達、翻譯、轉(zhuǎn)錄、消化、轉(zhuǎn)運來源氨基酸序列(即較大的肽或蛋白質(zhì))以及在結(jié)合mhci分子前的任何進一步加工的效率?！懊庖叩鞍酌阁w”是蛋白酶的集合，其將肽和/或蛋白質(zhì)前體酶促消化成小的氨基酸序列，用于表位形成的最終目的。例如，如由chen等人證明的，免疫蛋白酶體產(chǎn)生表位前體的能力與免疫原性直接相關(guān)(chen,w.etal.,immunoproteasomesshapeimmunodominancehierarchiesofantiviralcd8+tcellrepertoireandpresentationofviralantigens,thejournalofexperimentalmedicine,2001,v.193,1319-1326，在此通過提及將其收錄)?？梢允褂脿可姹砦患庸さ牟襟E的知識預(yù)測所得表位的免疫原性。特別地，關(guān)于免疫蛋白酶體的研究提示它有效生成mhc表位，并且對免疫蛋白酶體機制的了解會有助于預(yù)測免疫原性肽。

在一些實施方案中，可以使用肽前體的表達時機預(yù)測免疫原性。在疾病進展中較早期表達的蛋白質(zhì)更可能呈現(xiàn)為mhc表位(moutaftsi,m.etal.,aconsensusepitopepredictionapproachidentifiesthebreadthofmurinetcd8+-cellresponsestovaccinavirus,naturebiotechnology,2006,v.24,817-819，在此通過提及將其收錄)。在一些實施方案中，可以使用疾病組織的比較分析測定基因產(chǎn)物的時間表達模式。在一些實施方案中，時間表達模式的外推可以允許鑒定與其它鑒定的表達基因產(chǎn)物相比在早期時間點以更大的豐度呈現(xiàn)的表達基因產(chǎn)物。

在一些實施方案中，可以使用肽表位與t細胞受體(tcr)的結(jié)合親和力預(yù)測免疫原性。預(yù)測肽表位與tcr的結(jié)合親和力的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且報告于例如tung,c.-w.etal.,popisk:t-cellreactivitypredictionusingsupportvectormachinesandstringkernels,bmcbioinformatics,2011,v.12,446，在此通過提及將其收錄。

在一些實施方案中，使用變體氨基酸在肽中的位置預(yù)測免疫原性。肽表位在兩個獨特的錨定位置處結(jié)合mhci分子。錨定位置之間的跨度以約6-7個氨基酸分開，如通過表位肽序列測量的，不包括占據(jù)錨定位置的氨基酸。已經(jīng)報告了，兩個mhci錨定位置間的氨基酸跨度(即4-6位的氨基酸)中的突變更可能與免疫原性應(yīng)答正相關(guān)(calis,j.j.a.etal.,propertiesofmhcclassipresentedpeptidesthatenhanceimmunogenicity,ploscomputationalbiology,2013,v.9,1-13，在此通過提及將其收錄)。通過開始對于末端氨基酸的序列位置計數(shù)1確定氨基酸的序列位置。

在一些實施方案中，在mhc呈遞表位上呈遞的肽的結(jié)構(gòu)特征可以預(yù)測免疫原性。可以通過計算機3維分析和/或蛋白質(zhì)?？砍绦蜻M行mhc結(jié)合的肽的結(jié)構(gòu)評估。預(yù)測pmhc分子的結(jié)構(gòu)的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且報告于例如在marti-renom,m.a.etal.,comparativeproteinstructuremodelingofgenesandgenomes,annualreviewofbiophysicsandbiomolecularstructure,2000,v.29,291-325,chivian,d.etal.,homologymodelingusingparametricalignmentensemblegenerationwithconsensusandenergy-basedmodelselection,nucleicacidsresearch,2006,v.34,el12,andmcrobb,f.m.etal.,homologymodelinganddocketingevaluationofaminergicgprotein-coupledreceptors,journalofchemicalinformationandmodeling,2010,v.50,626-637，在此通過提及將其收錄。當與mhc分子結(jié)合時預(yù)測的表位結(jié)構(gòu)(諸如自rosetta算法獲得)的使用可用于評估當表位與mhc分子結(jié)合時所述表位的氨基酸殘基的溶劑暴露程度。隨后，可以將此信息與肽的免疫原性關(guān)聯(lián)。例如，如park等人描述，突變體肽(其中與野生型序列相比，變體氨基酸殘基展現(xiàn)額外的溶劑暴露)與增加的免疫原性正相關(guān)(park,m.-s.etal.,accuratestructurepredictionofpeptide-mhccomplexesforidentifyinghighlyimmunogenicantigens,molecularimmunology,2013,v.56,81-90，在此通過提及將其收錄。)在一些實施方案中，使用在mhc復(fù)合物上呈遞時整個肽的溶劑暴露預(yù)測免疫原性。在一些實施方案中，使用肽上的變體氨基酸的溶劑暴露預(yù)測免疫原性。

在一些實施方案中，可以使用肽中的大的和/或芳香族的殘基的表位含量預(yù)測免疫原性。calis等人觀察到表位氨基酸序列內(nèi)的大的和/或芳香族的氨基酸殘基的存在與免疫原性之間的聯(lián)系。具體地，報告了苯丙氨酸和異亮氨酸含量與表位免疫原性正相關(guān)。如上文討論，可以使用變體氨基酸的位置和結(jié)構(gòu)評估兩者預(yù)測表位免疫原性。除了此討論之外，假設(shè)可以預(yù)測表位4-6位內(nèi)的大的和/或芳香族的殘基具有較大程度的溶劑暴露。

在一些實施方案中，可以使用肽前體的性質(zhì)預(yù)測變體編碼氨基酸序列的免疫原性。例如，當疾病組織是腫瘤時，已知與癌癥相關(guān)的肽前體序列在預(yù)測免疫原性時可以是有用的。然而，來自不與癌癥直接相關(guān)的蛋白質(zhì)的肽前體序列(例如當突變時)在本發(fā)明的方法內(nèi)也是有用的。

在一些實施方案中，可以使用本文中描述的至少兩種(諸如3、4、5、6、7、8、9或10中的至少任一)參數(shù)預(yù)測肽的免疫原性。在一些實施方案中，可以使用第一預(yù)測性評估選擇一組變體編碼氨基酸序列，其隨后通過第二預(yù)測性評估加工，導(dǎo)致表位免疫原性的累積預(yù)測。作為本公開內(nèi)容的一部分意圖可以使用多輪評估預(yù)測表位免疫原性?；蛘撸叫性u估多項參數(shù)，并且可以獲得基于各種參數(shù)的評估的綜合得分。例如，可以為每項參數(shù)計算得分，并且可以為每項參數(shù)分配百分比權(quán)重。然后，可以基于評估的每項參數(shù)的得分和百分比權(quán)重計算綜合范圍。也可以使用與平行參數(shù)評估偶聯(lián)的序貫評估的組合。

對于變體編碼序列中的給定變異，可以產(chǎn)生各種長度的多個重疊推定突變體肽。在一個實施方案中，可以基于免疫原性對這些多個重疊推定突變體肽排序，其可以涵蓋如本文中描述的一種或多種分析。此外，可以通過本領(lǐng)域中公知的任一種或多種手段實現(xiàn)推定的突變體肽的排序，所述手段可以包括在免疫原性測定中或者根據(jù)進行排序過程的那些的偏愛而認為是分開的分析。這些手段的一些非限制性例子包括前體蛋白的豐度、加工的蛋白質(zhì)組內(nèi)的肽的豐度，包括此加工的效率，和肽-mhc復(fù)合物內(nèi)肽的豐度。潛在排序分析的其它例子包括但不限于肽的結(jié)合親和力、肽-mhc復(fù)合物的穩(wěn)定性、和肽與自身肽的相似性或差異?；蛘撸梢曰谂c測量普通技術(shù)人員公知的或本文中描述的這些或其它特征的質(zhì)譜術(shù)方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)對肽排序。一些代表性特征包括增加免疫原性的大的或芳香族的氨基酸的存在或缺乏和在肽內(nèi)找到這些氨基酸的特定位置，對于在肽的中間位置中找到的那些氨基酸給予免疫原性影響偏愛，例如肽4到6(見例如calisetal.plos,9(10):el003266(2013))。

在一些實施方案中，免疫原性的預(yù)測還包括hla(人白細胞抗原)分型分析。由于mhc的多基因性(polygeny)，每個人將在他或她的細胞上表達至少三種不同的抗原呈遞mhci類分子和三種(或有時四種)mhcii類分子。事實上，由于mhc的極端多態(tài)性和mhc基因產(chǎn)物的共顯性表達，在大多數(shù)人的細胞上表達的不同mhc分子的數(shù)目是較大的。一些人mhci類和ii類基因有超過200種等位基因，每種等位基因在群體中以相對高的頻率存在。因此，僅有較小的下述幾率，即在個體的兩條同源染色體上相應(yīng)的mhc位點會具有相同的等位基因；大多數(shù)個體會在mhc基因座處是雜合的。在單個染色體上找到的mhc等位基因的特定組合稱為mhc單倍型。mhc等位基因的表達是共顯性的，在細胞中表達一種基因座處的兩種等位基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，并且兩種基因產(chǎn)物都能夠?qū)⒖乖蔬f給t細胞。如此，每種基因座上的廣泛多態(tài)性具有將個體中表達的不同mhc分子的數(shù)目倍增，由此增加已經(jīng)經(jīng)由多基因性可得的多樣性的潛力(關(guān)于一般概述，見例如janeway’simmunobiology，murphy，kenneth編，garlandscience，newyork，ny(2011))?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的幾種方法中的任一種，諸如基于dna的組織相容性測定法完成hla分型。本領(lǐng)域中的方法的具體例子牽涉進一步分析的聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)產(chǎn)物，諸如pcr-rflp(限制性片段長度多態(tài)性)、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)、pcr-ssp(序列特異性引物)、和pcr-sbt(基于序列的分型)技術(shù)。如此，測定牽涉感興趣的肽呈遞的特定基因多態(tài)性類型可以提供關(guān)于突變體肽的免疫原性的進一步信息。

獲得與mhc分子結(jié)合的肽

本文中在一些實施方案中提供的方法包括自個體的疾病組織獲得與mhc分子結(jié)合的肽。在一些實施方案中，通過免疫親和技術(shù)分離mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，通過親和層析分離mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，通過免疫親和層析分離mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，通過免疫沉淀技術(shù)分離mhc結(jié)合的肽。

在一些實施方案中，使用抗mhc抗體捕捉mhc/肽分子。在一些實施方案中，可以使用任選具有不同親和力和/或結(jié)合特征的多種抗mhc抗體捕捉mhc/肽復(fù)合物。合適的抗體包括但不限于對hlai類特異性的單克隆抗體w6/32，和對hla-a2特異性的單克隆抗體bb7.2。

在一些實施方案中，可以首先分離mhc/肽復(fù)合物，隨后將mhc結(jié)合的肽與mhc分子分開。在一些實施方案中，通過酸洗脫將mhc結(jié)合的肽與mhc分子分開。在一些實施方案中，可以對完整的全細胞，任選地在存在裂解的細胞和/或細胞殘留物的情況中實施酸介導(dǎo)的與mhc分子分開mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以在將pmhc暴露于具有酸性ph的緩沖液后與mhc分子分開mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以通過溫和酸洗脫(mae)將mhc結(jié)合的肽與mhc分子分開。在一些實施方案中，可以通過胞外表面的溫和酸洗脫(mae)將mhc結(jié)合的肽與mhc分子分開。在一些實施方案中，可以通過pmhc分子的變性將mhc結(jié)合的肽與mch分子分開。

在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前進一步加工mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前將mhc結(jié)合的肽濃縮。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前純化mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前將mhc結(jié)合的肽分級。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前將mhc結(jié)合的肽富集。在一些實施方案中，可以在進行基于質(zhì)譜術(shù)的測序前將mhc結(jié)合的肽進一步酶促消化。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前更換可以含有mhc結(jié)合的肽的緩沖液。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前標記mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前共價標記mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前酶促標記mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前化學(xué)標記mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，可以標記mhc結(jié)合的肽以允許在基于質(zhì)譜術(shù)的測序期間增強離子化。在一些實施方案中，可以標記mhc結(jié)合的肽以允許在基于質(zhì)譜術(shù)的測序期間進行定量。在一些實施方案中，分離的mhc結(jié)合的肽可以源自多種來源和/或富集方法，并且任選地可以在基于質(zhì)譜術(shù)的測序前共同合并。

基于質(zhì)譜術(shù)的肽測序

對在本文中描述的方法中與mhc分子結(jié)合的肽進行質(zhì)譜測序。如本文中使用的，“基于質(zhì)譜術(shù)的測序”是指通過使用質(zhì)譜術(shù)鑒定肽和/或蛋白質(zhì)的氨基酸序列的技術(shù)。質(zhì)譜儀是能夠測量個別的離子化分子的質(zhì)荷(m/z)比的儀器，使研究人員能夠鑒定未知化合物，量化已知化合物，并且闡明分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)?？梢允褂帽疚闹刑峁┑姆椒ǐ@得與mhci分子結(jié)合的肽表位的序列信息。在一些實施方案中，可以測定肽表位的整個序列。在一些實施方案中，可以測定肽表位的部分序列。在一些實施方案中，對肽進行串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)，諸如串聯(lián)層析質(zhì)譜術(shù)(例如lc-ms或lc-ms-ms)。

在一些實施方案中，通過將樣品分離并且加載入儀器上開始質(zhì)譜術(shù)分析。在一些實施方案中，可以在質(zhì)譜術(shù)分析前層析加工mhc結(jié)合的肽。在一些實施方案中，層析法是液相層析。在一些實施方案中，層析是反相層析。在一些實施方案中，可以將mhc結(jié)合的肽層析分開，并且同時濃縮，之后導(dǎo)入質(zhì)譜儀中。在一些實施方案中，層析分開可以是在線的，其中自層析源洗脫的肽直接進入質(zhì)譜儀中。在一些實施方案中，層析分開可以是離線的。在一些實施方案中，可以使用離線層析分開分級分離mhc結(jié)合的肽。離線層析分開通常牽涉質(zhì)譜術(shù)樣品的分開和/或分級，其中在樣品離開層析系統(tǒng)時，不將所得的分開和/或分級的樣品立即導(dǎo)入質(zhì)譜儀中。

在一些實施方案中，可以使用已知的質(zhì)譜術(shù)離子化技術(shù)(諸如基質(zhì)輔助激光解吸/離子化、電噴霧離子化和/或納米電噴霧離子化、大氣壓化學(xué)離子化)對mhc結(jié)合的肽測序。在一些實施方案中，mhc結(jié)合的肽可以在質(zhì)譜儀外部、內(nèi)部和/或在它們進入質(zhì)譜儀時離子化。在一些實施方案中，可以在質(zhì)譜儀中分析mhc結(jié)合的肽的正離子。隨后，經(jīng)由暴露于磁場，離子依照其質(zhì)荷比分開。在一些實施方案中，使用扇形儀器，并且離子依照在它通過儀器的電磁場時離子軌跡的偏轉(zhuǎn)幅度量化，所述電磁場與離子質(zhì)荷比正相關(guān)。在其它實施方案中，當離子通過四極體時，或者基于它們在三維或線性離子阱或orbitrap中的運動，或在傅立葉變換離子回旋加速器共振質(zhì)譜儀的磁場中，測量離子質(zhì)荷比。儀器記錄每個離子的相對豐度，其用于測定初始樣品的化學(xué)、分子和/或同位素組成。在一些實施方案中，使用飛行時間儀器，并且利用電場加速離子通過相同的電勢，并且測量每個離子到達檢測器花費的時間。此方法取決于均勻的每個離子的電荷，使得每個離子的動能會是相同的。在此情況中影響速度的唯一變量是質(zhì)量，較輕的離子以較大的速度行進并且因此較快到達檢測器。以質(zhì)譜或直方圖、強度對質(zhì)荷比呈現(xiàn)所得的數(shù)據(jù)，峰表示離子化化合物或片段。

可以通過串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在一些實施方案中，用于獲得關(guān)于mhc結(jié)合的肽的肽測序的信息的質(zhì)譜術(shù)獲得技術(shù)可以是數(shù)據(jù)依賴性的。在一些實施方案中，用于獲得關(guān)于mhc結(jié)合的肽的肽測序的信息的質(zhì)譜術(shù)獲得技術(shù)可以是數(shù)據(jù)非依賴性的。在一些實施方案中，用于獲得關(guān)于mhc結(jié)合的肽的肽測序的信息的質(zhì)譜術(shù)獲得技術(shù)可以基于測量的精確質(zhì)量質(zhì)譜術(shù)。在一些實施方案中，用于獲得關(guān)于mhc結(jié)合的肽的肽測序的信息的質(zhì)譜術(shù)獲得技術(shù)可以是肽質(zhì)量指紋法?？梢酝ㄟ^肽質(zhì)量指紋法獲得本發(fā)明中有用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。肽質(zhì)量指紋法牽涉將來自通過蛋白水解消化產(chǎn)生的肽混合物的譜的觀察質(zhì)量輸入數(shù)據(jù)庫中，并且將觀察到的質(zhì)量與計算機上的源自已知蛋白質(zhì)的消化的預(yù)測片段質(zhì)量關(guān)聯(lián)。與樣品質(zhì)量對應(yīng)的已知質(zhì)量提供了已知蛋白質(zhì)存在于測試樣品中的證據(jù)。

在一些實施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)包括使肽離子與氣體碰撞并且片段化(例如由于由碰撞賦予的振動能量)的過程。片段化過程產(chǎn)生在沿著蛋白質(zhì)的各個位點處的肽鍵處斷裂的斷裂產(chǎn)物。觀察到的片段質(zhì)量可以與許多給定肽序列之一的預(yù)測質(zhì)量數(shù)據(jù)庫匹配，并且可以預(yù)測蛋白質(zhì)的存在。在一些實施方案中，質(zhì)譜術(shù)采集技術(shù)可以利用片段化技術(shù)(諸如碰撞誘導(dǎo)的解離、脈沖q解離、高能碰撞解離、電子轉(zhuǎn)移解離和電子轉(zhuǎn)移解離、紅外多光子解離)。

在一些實施方案中，可以使用從質(zhì)譜儀獲得的數(shù)據(jù)鑒定肽序列。在一些實施方案中，可以使用搜索算法(諸如sequest和mascot)將肽序列分配給獲得的質(zhì)譜。在一些實施方案中，分配的肽序列可以具有小于約5％的錯誤發(fā)現(xiàn)率。在一些實施方案中，分配的肽序列可以具有小于約1％的錯誤發(fā)現(xiàn)率。在一些實施方案中，分配的肽序列可以具有小于約0.5％的錯誤發(fā)現(xiàn)率。在一些實施例中，可以通過搜索算法使用數(shù)據(jù)庫進行獲得譜的肽序列分配。在一些實施方案中，通過搜索算法使用以進行獲得譜的肽序列分配的數(shù)據(jù)庫可以是生物體的已知序列的數(shù)據(jù)庫。在一些實施方案中，通過搜索算法使用以進行獲得譜的肽序列分配的數(shù)據(jù)庫可以是生物體的已知蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫。在一些實施方案中，通過搜索算法使用以進行獲得譜的肽序列分配的數(shù)據(jù)庫可以是生物體的已知基因組序列的數(shù)據(jù)庫。在一些實施方案中，通過搜索算法使用以進行獲得譜的肽序列分配的數(shù)據(jù)庫可以包括自疾病組織獲得的序列信息。在一些實施方案中，通過搜索算法使用以進行獲得譜的肽序列分配的數(shù)據(jù)庫可以包括自無疾病的組織獲得的序列信息。

在一些實施方案中，可以手動驗證序列分配譜以通過算法確認正確的片段離子分配。在一些實施方案中，可以使用合成肽標準品確認算法分配的序列。在一些實施方案中，可以將自mhc結(jié)合的肽產(chǎn)生的譜與自肽標準品產(chǎn)生的譜比較。例如，比較可以牽涉將片段離子的模式，和任選地片段豐度或強度(基于自疾病組織來源獲得的譜的m/z值)與參照匹配。在一些實施方案中，手動驗證可以確認完整肽序列的序列分配。在一些實施方案中，手動驗證可以確認肽序列的部分片段的序列分配。

質(zhì)譜術(shù)與基因組數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)

本文中在一些實施方案中提供的方法包括將mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)衍生的序列信息與一組變體編碼序列關(guān)聯(lián)，以鑒定疾病特異性免疫原性突變體肽。例如，可以使用mhc結(jié)合的肽的質(zhì)譜術(shù)序列進一步選擇預(yù)測的疾病特異性免疫原性突變體肽的群體。在一些實施方案中，基于質(zhì)譜術(shù)的表位鑒定可以補充基于基因組的免疫原性表位鑒定和/或預(yù)測。在一些實施方案中，基于質(zhì)譜術(shù)的表位鑒定可以確認基于基因組的免疫原性表位鑒定和/或預(yù)測。

可以將自質(zhì)譜術(shù)分析獲得的數(shù)據(jù)與基于疾病組織的基因組和/或轉(zhuǎn)錄物組序列分析的免疫原性肽預(yù)測關(guān)聯(lián)。通常，將自基于質(zhì)譜術(shù)的測序鑒定的氨基酸序列與預(yù)測的免疫原性肽的氨基酸序列比較，以找到包含部分序列比對的區(qū)域。在一些實施方案中，經(jīng)由質(zhì)譜術(shù)鑒定的肽會是與預(yù)測的免疫原性肽的序列的精確序列匹配。在一些實施方案中，氨基酸序列的長度可以在經(jīng)由質(zhì)譜術(shù)鑒定的肽和預(yù)測的免疫原性肽的長度之間變化。例如，與預(yù)測的免疫原性肽相比，經(jīng)由質(zhì)譜術(shù)鑒定的肽可以含有對肽的c和/或n端修改的別的氨基酸?；蛘?，與預(yù)測的免疫原性肽相比，包含變體氨基酸的經(jīng)由質(zhì)譜術(shù)鑒定的肽可以在c和/或n端具有更少的氨基酸。在這些例示性實施方案中，變體氨基酸和變體氨基酸周圍的序列在經(jīng)由質(zhì)譜術(shù)鑒定的肽和預(yù)測為免疫原性的肽兩者中必須是相同的。在一些實施方案中，自將基于質(zhì)譜術(shù)的序列與免疫原性肽預(yù)測關(guān)聯(lián)獲得的結(jié)果將預(yù)測的免疫原性序列與經(jīng)由基于質(zhì)譜術(shù)的測序確認由mhc分子物理呈現(xiàn)的序列匹配。

在一些實施方案中，可以通過肽長度進一步過濾獲得的質(zhì)譜術(shù)序列鑒定。例如，在一些實施方案中，可以進一步過濾通過質(zhì)譜術(shù)鑒定的mhc結(jié)合的肽的群體以僅包括長度為8或9個氨基酸的那些鑒定的肽序列。

免疫原性突變體肽的功能性驗證

可以通過功能性研究進一步驗證通過本文中描述的方法鑒定的疾病特異性免疫原性突變體肽。例如，可以基于激活靶向免疫應(yīng)答(例如由細胞毒性t細胞介導(dǎo))的能力合成和測試肽。在一些實施方案中，化學(xué)合成肽。在一些實施方案中，通過重組方法合成肽。在一些實施方案中，如下合成肽，即首先表達肽前體分子，然后加工所述肽前體分子(例如通過免疫蛋白酶體)以生成感興趣的肽。可以在進行功能性分析前將合成的肽進行進一步純化。

在一些實施方案中，在體外使用預(yù)測的疾病特異性免疫原性合成肽來測試細胞毒性t細胞應(yīng)答。在一些實施方案中，在體內(nèi)使用預(yù)測的疾病特異性免疫原性合成肽來測試細胞毒性t細胞應(yīng)答。

在一些實施方案中，可以通過小鼠的免疫測試疾病特異性肽的免疫原性。在一些實施方案中，可以通過測量cd8t細胞應(yīng)答在免疫后測試疾病特異性肽的免疫原性。在一些實施方案中，可以使用mhci/肽特異性的dextramer測量cd8t細胞應(yīng)答。在一些實施方案中，可以通過分析腫瘤浸潤細胞(til)測試疾病特異性肽的免疫原性。

在一些實施方案中，可以測量特異性表位和/或細胞表面蛋白的存在。在一些實施方案中，可以測量源自疫苗接種的表位的存在。在一些實施方案中，可以測量干擾素γ(ifn-γ)。在一些實施方案中，可以測量程序性細胞死亡1(pd-1)。在一些實施方案中，可以測量t細胞免疫球蛋白粘蛋白-3(tim-3)。在一些實施方案中，可以測量表達特異性蛋白質(zhì)和/或表位的細胞毒性t細胞。在一些實施方案中，可以測量展現(xiàn)特異性表位的細胞毒性t細胞。

在一些實施方案中，可以如下測試疾病特異性肽的免疫原性，即首先在樹突細胞中表達肽，然后測試呈遞的抗原被t細胞識別的能力。在一些實施方案中，自患者獲得樹突細胞，其中在所述患者中鑒定疾病特異性肽。在一些實施方案中，可以如下測試疾病特異性肽的免疫原性，即首先在b淋巴細胞中表達肽，然后測試呈遞的抗原被t細胞識別的能力。在一些實施方案中，自患者獲得b淋巴細胞，其中在所述患者中鑒定疾病特異性肽。參見例如美國專利號8,349,558。

免疫原性肽的組成

本公開內(nèi)容提供了鑒定疾病特異性免疫原性肽的方法。可以基于激活靶向免疫應(yīng)答(諸如由細胞毒性t細胞介導(dǎo)的)的能力鑒定免疫原性肽。在一些實施方案中，可以使用所鑒定的疾病特異性免疫原性肽的氨基酸序列產(chǎn)生藥學(xué)上可接受的組合物。在一些實施方案中，組合物可以包含合成的疾病特異性免疫原性肽。在一些實施方案中，組合物可以包含合成的疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，組合物可以包含兩種或更多種疾病特異性免疫原性肽。在一些實施方案中，組合物可以包含兩種或更多種疾病特異性免疫原性突變體肽。在一些實施方案中，兩種或更多種疾病特異性免疫原性肽可以激活對兩個或更多個獨特表位的細胞毒性t細胞應(yīng)答。

在一些實施方案中，組合物可以包含疾病特異性免疫原性肽的前體(諸如蛋白質(zhì)、肽、dna和rna)。在一些實施方案中，疾病特異性免疫原性肽的前體可以產(chǎn)生鑒定的疾病特異性免疫原性肽或針對鑒定的疾病特異性免疫原性肽產(chǎn)生疾病特異性免疫原性肽的前體。在一些實施方案中，疾病特異性免疫原性肽的前體可以是前藥。

在一些實施方案中，包含疾病特異性免疫原性肽的組合物可以是藥學(xué)可接受的。在一些實施方案中，包含疾病特異性免疫原性肽的組合物可以進一步包含佐劑。例如，可以利用突變肽作為疫苗(參見sahinetal.,int.j.cancer,78:387-9(1998)；stumioloetal.,naturebiotechnol,17:555-61(1999)；rammenseeetal.,immunolrev188:164-76(2002)；及hannanietal.cancerj17：351-358(2011))。此外，依照特定患者的個人需要，疫苗可以含有個體化成分。在一些實施方案中，疫苗可能對特定患者中預(yù)測的免疫原性肽是特異性的。在一些實施方案中，疫苗會含有超過一種免疫原性肽或肽前體。在一些實施方案中，疫苗中使用的肽的長度可以在長度上變化。在一些實施方案中，肽的長度是約7至50個氨基酸(諸如約8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、22、25、30、35、40、45或50個氨基酸中的任一項)。在一些實施方案中，肽的長度是約8至12個氨基酸。在一些實施方案中，肽的長度是約8至10個氨基酸。肽可以以其分離的形式利用，或者備選可以將肽添加至mhc分離的肽的末端以生成可以證明更具免疫原性的“長肽”(參見例如castleetal.,cancerres72：1081-1091(2012))。在一些實施方案中，肽也可以是加標簽的，或者是融合蛋白，或者是雜合分子。在一些實施方案中，肽是藥學(xué)可接受鹽的形式。

在一些實施方案中，疫苗是核酸疫苗。在一些實施方案中，核酸編碼免疫原性肽或肽前體。在一些實施方案中，核酸疫苗包含編碼免疫原性肽或肽前體的序列側(cè)翼的序列。在一些實施方案中，核酸疫苗包含超過一種免疫原性表位。在一些實施方案中，核酸疫苗是基于dna的疫苗。在一些實施方案中，核酸疫苗是基于rna的疫苗。在一些實施方案中，基于rna的疫苗包含mrna。在一些實施方案中，基于rna的疫苗包含裸mrna。在一些實施方案中，基于rna的疫苗包含經(jīng)修飾的mrna(例如，使用魚精蛋白提供保護而免于降解的mrna、含有經(jīng)修飾的5’cap結(jié)構(gòu)的mrna、或含有經(jīng)修飾的核苷酸的mrna)。在一些實施方案中，基于rna的疫苗包含單鏈mrna。

多核苷酸可以是基本上純的，或包含在合適的載體或投遞系統(tǒng)中。合適的載體和投遞系統(tǒng)包括病毒，諸如基于腺病毒、痘苗病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒或含有超過一種病毒的元件的雜合物。非病毒投遞系統(tǒng)包括陽離子脂質(zhì)和陽離子聚合物(例如陽離子脂質(zhì)體)。在一些實施方案中，可以使用物理投遞，諸如用“基因槍”。

在一些實施方案中，可以使用本文中描述的肽生成突變體肽特異性治療劑，諸如抗體治療劑。例如，可以使用突變體肽制備和/或鑒定特異性識別突變體肽的抗體。可以使用這些抗體作為治療劑。已經(jīng)使用合成短肽生成蛋白質(zhì)反應(yīng)性抗體。用合成肽免疫的優(yōu)點是可以使用無限量的純穩(wěn)定抗原。此方法牽涉合成短肽序列，將它們與大載體分子偶聯(lián)，并且用肽-載體分子免疫選擇的動物?？贵w的性質(zhì)取決于一級序列信息。通?？梢酝ㄟ^仔細選擇序列和偶聯(lián)方法產(chǎn)生對期望肽的良好響應(yīng)。大多數(shù)肽可以引發(fā)良好的響應(yīng)。抗肽抗體的優(yōu)點是可以在測定突變體肽的氨基酸序列后立即制備它們，并且可以特異性靶向蛋白質(zhì)的特定區(qū)域以進行抗體生成。由于已經(jīng)對突變體肽篩選高免疫原性，存在有較高的下述幾率，即所得的抗體會識別腫瘤環(huán)境中的天然蛋白質(zhì)。如在疫苗情況中一樣，肽的長度是考慮的另一項重要的因素。大致上，10-15個殘基的肽對于抗肽抗體生產(chǎn)是最佳的；肽越長越好，因為可能的表位的數(shù)目隨肽長度而增加。然而，長肽增加了合成、純化和與載體蛋白偶聯(lián)的困難?？贵w的質(zhì)量依賴于肽的質(zhì)量。肽產(chǎn)物中含有的副產(chǎn)物可導(dǎo)致低質(zhì)量的抗體。

肽-載體蛋白偶聯(lián)是牽涉高滴度抗體生產(chǎn)的另一項因素。大多數(shù)偶聯(lián)方法依賴于氨基酸中的反應(yīng)性官能團，諸如-nh2、-cooh、-sh和酚-oh。定點偶聯(lián)是選擇的方法?？梢耘c通過本發(fā)明的方法鑒定的肽一起利用在抗肽抗體生成中使用的任何合適的方法。兩種此類已知的方法是多重抗原性肽系統(tǒng)(map)和脂質(zhì)核心肽(lcp法)。map的優(yōu)點是綴合方法不是必需的。不將載體蛋白或連接鍵引入免疫的宿主中。一項缺點是肽的純度更難以控制。另外，map可以繞過一些宿主中的免疫應(yīng)答系統(tǒng)。已知lcp方法提供比其它抗肽疫苗系統(tǒng)更高的滴度，如此可以是有利的。

本文還提供了包含本文中公開的疾病特異性免疫原性突變體肽的分離的mhc/肽復(fù)合物。例如，可以使用此類mhc/肽復(fù)合物鑒定抗體、可溶性tcr、或tcr類似物。這些抗體的一種類型已經(jīng)稱作tcr模擬物，因為它們是在特定hla環(huán)境的背景中結(jié)合來自腫瘤關(guān)聯(lián)抗原的肽的抗體。已經(jīng)顯示了此類型的抗體介導(dǎo)在其表面上表達復(fù)合物的細胞的裂解，以及保護小鼠免于表達復(fù)合物的植入的癌細胞系(參見例如wittmanetal.,j.ofimmunol.177：4187-4195(2006))。tcr模擬物作為iggmab的一項優(yōu)點是可以實施親和力成熟，并且經(jīng)由目前的fc域?qū)⒎肿优c免疫效應(yīng)器功能偶聯(lián)。也可以使用這些抗體將治療性分子靶向腫瘤，諸如毒素、細胞因子或藥物產(chǎn)品。已經(jīng)使用肽，諸如使用基于非雜交瘤的抗體生成或有結(jié)合能力的抗體片段，諸如噬菌體上的抗肽fab分子的生成使用本發(fā)明的方法選擇的那些肽開發(fā)出其它類型的分子。還可以將這些片段與用于腫瘤投遞的其它治療性分子綴合，諸如抗肽mhcfab-免疫毒素綴合物、抗肽mhcfab-細胞因子綴合物和抗肽mhcfab-藥物綴合物。

包括免疫原性疫苗的治療方法

本公開內(nèi)容提供了包含免疫原性疫苗的治療方法。在一些實施方案中，提供了治療疾病(諸如癌癥)的方法，其可以包括對個體施用有效量的包含免疫原性肽的組合物。在一些實施方案中，提供了治療疾病(諸如癌癥)的方法，其可以包括對個體施用有效量的包含免疫原性肽的前體的組合物。在一些實施方案中，免疫原性疫苗可以包含藥學(xué)可接受的疾病特異性免疫原性肽。在一些實施方案中，免疫原性疫苗可以包含疾病特異性免疫原性肽的藥學(xué)可接受的前體(諸如蛋白質(zhì)、肽、dna和rna)。在一些實施方案中，提供了治療疾病(諸如癌癥)的方法，其可以包括對個體施用有效量的特異性識別疾病特異性免疫原性突變體肽的抗體。在一些實施方案中，提供了治療疾病(諸如癌癥)的方法，其可以包括對個體施用有效量的特異性識別疾病特異性免疫原性突變體肽的可溶性tcr或tcr類似物。

在一些實施方案中，癌癥是下列任一種：癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤(blastema)、肉瘤、白血病、鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和鱗狀肺癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌或胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌或腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝的癌、頭和頸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、軟組織肉瘤、卡波西(kaposi)氏肉瘤、b細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金淋巴瘤(nhl)、小淋巴細胞性(sl)nhl、中級/濾泡性nhl、中等級彌漫性nhl、高級成免疫細胞性nhl、高級成淋巴細胞性nhl、高級小非切割細胞nhl、大體積疾病nhl、套細胞淋巴瘤、aids相關(guān)淋巴瘤、和沃爾登斯特倫(waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(cll)、急性成淋巴細胞性白血病(all)、骨髓瘤，多毛細胞白血病、慢性成髓細胞白血病和移植后淋巴增殖性病癥(ptld)以及與斑痣性錯構(gòu)瘤病相關(guān)的異常血管增生、水腫(諸如與腦腫瘤相關(guān))和麥格氏(meigs)綜合征

本文中描述的方法在個性化醫(yī)學(xué)背景下是特別有用的，其中使用通過本文中描述的任一種方法獲得的疾病特異性免疫原性突變體肽開發(fā)用于同一個體的治療劑(諸如疫苗或治療性抗體)。因此，例如，在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括：a)鑒定個體中的疾病特異性免疫原性突變體肽；并且b)合成肽或肽前體；并且c)對個體施用肽。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括：1)鑒定個體中的疾病特異性免疫原性突變體肽；b)生成特異性識別突變體肽的抗體；并且c)對個體施用肽。在一些實施方案中，鑒定步驟將序列特異性變體鑒定方法與免疫原性預(yù)測方法組合。在一些實施方案中，鑒定步驟將序列特異性變體鑒定方法與質(zhì)譜術(shù)組合?？梢允褂帽疚闹忻枋龅蔫b定疾病特異性免疫原性突變體肽的任何方法進行本文中描述的治療方法。在一些實施方案中，方法還包括自個體獲得疾病組織的樣品。

可以使用本文中提供的方法治療已經(jīng)診斷具有或懷疑具有癌癥的個體(例如人)。在一些實施方案中，個體可以是人。在一些實施方案中，個體可以是至少約35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85歲齡的至少約任一項。在一些實施方案中，個體可以是男性。在一些實施例中，個體可以是女性。在一些實施例中，個體可以已經(jīng)拒絕手術(shù)。在一些實施方案中，個體可以是醫(yī)學(xué)上不能手術(shù)的。在一些實施方案中，個體可以處于ta、tis、t1、t2、t3a、t3b或t4的臨床階段。在一些實施方案中，癌癥可以是復(fù)發(fā)性的。在一些實施方案中，個體可以是展現(xiàn)出與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的人。在一些實施方案中，個體可以在遺傳上或在其它方面有形成癌癥的素因(例如具有風(fēng)險因素)。

可以在佐劑背景中實施本文中提供的方法。在一些實施方案中，在新輔助背景中實施方法，即可以在初步/確定性療法前實施方法。在一些實施方案中，使用方法治療先前已經(jīng)治療的個體?？梢允褂帽疚闹刑峁┑娜魏沃委煼椒ㄖ委熛惹吧形粗委煹膫€體。在一些實施方案中，使用該方法作為一線療法。在一些實施方案中，使用該方法作為二線療法。

在一些實施方案中，提供了降低個體中預(yù)先存在的癌癥腫瘤轉(zhuǎn)移(諸如肺轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié))的發(fā)生或負擔(dān)的方法，其包括對個體施用有效量的包含免疫原性疫苗的組合物。

在一些實施方案中，提供了延長個體中的癌癥疾病進展前時間的方法，其包括對個體施用有效量的包含免疫原性疫苗的組合物。

在一些實施方案中，提供了延長具有癌癥的個體的存活的方法，其包括對個體施用有效量的包含免疫原性疫苗的組合物。

在一些實施方案中，在包含免疫原性疫苗的組合物外，可以施用至少一種或多種化學(xué)治療劑。在一些實施方案中，一種或多種化學(xué)治療劑可以(但不一定)屬于不同類別的化學(xué)治療劑。

在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括施用：a)免疫原性疫苗，和b)免疫調(diào)節(jié)劑。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括施用：a)免疫原性疫苗，和b)檢查點蛋白的拮抗劑。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括施用：a)免疫原性疫苗，和b)程序性細胞死亡1(pd-1)的拮抗劑，諸如抗pd-1。在一些實施方案中，提供了治療個體中的疾病(諸如癌癥)的方法，其包括施用：a)免疫原性疫苗，和b)程序性死亡配體1(pd-l1)的拮抗劑，諸如抗pd-l1。在一些實施方案中，提供了治療個體中疾病(諸如癌癥)的方法，其包括施用：a)免疫原性疫苗，和b)細胞毒性t淋巴細胞相關(guān)蛋白4(ctla-4)拮抗劑，諸如抗ctla-4。

實施例1

此實施例演示了用于預(yù)測免疫原性肽表位的例示性方法。

對mc-38和tramp-c1小鼠腫瘤細胞系實施全外顯子組測序以鑒定腫瘤特異性點突變。相對于參照小鼠基因組調(diào)用編碼變體以分別鑒定mc-38和tramp-c1中的4285和949種非同義變體。隨后，通過rna-seq分析針對基因表達過濾數(shù)據(jù)，并且揭示了分別在mc-38和tramp-c1中表達1290和67種突變基因。使用netmhc-3.4算法鑒定出mc-38中170種預(yù)測的新表位和tramp-c1腫瘤中6種預(yù)測的新表位。

接著，使用轉(zhuǎn)錄物組生成的fasta數(shù)據(jù)庫的質(zhì)譜分析揭示了由mc-38細胞系呈現(xiàn)的797種獨特的h-2kb表位和725種獨特的h-2db表位，以及由tramp-c1細胞系呈現(xiàn)的477種獨特的h-2kb表位和332種獨特的h-2kb表位。觀察到自豐富的轉(zhuǎn)錄物衍生的肽更可能由mc-38(圖2a)和tramp-c1(圖2b)細胞中的mhci呈遞。

分別在mc-38和tramp-c1中的1290和67種氨基酸變化中，通過質(zhì)譜術(shù)僅發(fā)現(xiàn)在mhci上呈遞7種(mc-38中的7種和tramp-c1中的0種)(表1)。在mc-38細胞中通過質(zhì)譜術(shù)也檢測到自癌癥睪丸自身抗原mage-d1衍生的一種表位。手動驗證這些肽，并且與肽的合成生成型式比較以實現(xiàn)準確性。預(yù)測除了一種外的所有新表位結(jié)合mhci(ic50<500nm，表1)。野生型(wt)和突變體轉(zhuǎn)錄物兩者均由腫瘤細胞表達，并且雖然預(yù)測大多數(shù)相應(yīng)的wt肽也結(jié)合mhci，但是通過質(zhì)譜術(shù)僅檢測到它們中的三種。

雖然對mhci的肽結(jié)合親和力和免疫原性之間存在有關(guān)聯(lián)，但其它因素也有所貢獻。例如，突變氨基酸與tcr的相互作用可能對于將突變的肽識別為“非自身”是必需的。當相應(yīng)的wt肽也在mhci上呈現(xiàn)時尤其如此。7種新表位中的5種展現(xiàn)出高結(jié)合預(yù)測評分(根據(jù)netmhc3.4，ic50<50nm，表1)。其它新表位展現(xiàn)出較低的結(jié)合預(yù)測得分，這提示了它們可以是不太有免疫原性的。利用h-2db和h-2kb的發(fā)表的晶體結(jié)構(gòu)和基于rosetta的算法對與mhci的復(fù)合物中的每種突變體肽建模并且分析每種新表位中的突變體殘基與t細胞受體相互作用的潛力。通常，展示的肽的tcr識別由與肽殘基3到7的相互作用介導(dǎo)。僅在reps1和adpgk肽中具有高結(jié)合得分的肽在此范圍內(nèi)具有突變。結(jié)構(gòu)建模還預(yù)測突變的殘基朝向溶劑界面定向，并且如此判斷為具有呈免疫原性的良好潛力(表1和圖3)。另一方面，irgq、aatf、dpagt1新表位中的突變存在于肽的c末端附近，其可能落在tcr結(jié)合區(qū)外部，并且提示了這些新表位不可能是免疫原性的(表1和圖3)。

接著，通過與佐劑組合用編碼突變表位的長肽免疫野生型c57bl/6小鼠評估突變腫瘤抗原的免疫原性，并且使用mhci/肽特異性dextramer測量cd8t細胞應(yīng)答。如圖4a中顯示的，與僅佐劑的組相比，6種肽中的3種引發(fā)cd8t細胞應(yīng)答?；诮Y(jié)構(gòu)和結(jié)合親和力預(yù)測，預(yù)測reps1和adpgk是免疫原性的，并且兩者都引發(fā)強的cd8t細胞應(yīng)答。在預(yù)測為非免疫原性的4種肽中，僅dpagt1誘導(dǎo)弱的cd8t細胞應(yīng)答。

通過分析腫瘤浸潤細胞(til)在腫瘤的背景中確認了這些突變體肽的免疫原性。觀察到對reps1、adpgk和dpagt1特異性的t細胞在腫瘤床中是富集的(圖4b)。雖然存在有異質(zhì)性，但是adpgk特異性cd8t細胞在三種中是最豐富的，并且這對mc-38腫瘤是特異性的，因為在同基因tramp-c1腫瘤中檢測不到adpgk特異性cd8t細胞。令人感興趣地，通過質(zhì)譜術(shù)鑒定的自單一癌癥睪丸自身抗原(mage-d1)衍生的肽顯示較差的免疫原性，并且在腫瘤床中檢測不到對mage-d1特異性的cd8t細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。

通常分析體積til以監(jiān)測抗腫瘤應(yīng)答，這可以不提供真正的評估，因為僅一定分數(shù)的til是腫瘤特異性的。使用針對三種免疫原性肽的mhci/肽特異性dextramer檢查與體積til相比抗腫瘤til的頻率和表型。腫瘤特異性cd8t細胞浸潤腫瘤的頻率首先增加，并且隨腫瘤進一步增長而下降，這提示了腫瘤生長與腫瘤中腫瘤特異性cd8t細胞的頻率呈反相關(guān)(圖4c)。令人感興趣地，大多數(shù)(76.9±7.1％)腫瘤特異性cd8til共表達pd-1和tim-3，與體積til相比t細胞耗盡的標志物(52.6±3.6％)(圖4d)。腫瘤特異性cd8til也表達較高的表面pd-1水平。

為了測定針對新表位誘導(dǎo)的cd8t細胞是否能提供保護性抗腫瘤免疫，用突變的肽疫苗免疫健康的小鼠，隨后用mc-38腫瘤細胞攻擊。與單獨的佐劑相比，腫瘤生長在疫苗組中的大多數(shù)動物中受到完全抑制(圖5a)。在此實驗中生長出腫瘤的單一動物實際上不響應(yīng)疫苗，強烈支持對突變的肽特異性的cd8t細胞應(yīng)答賦予保護的可能性(圖5a)。

接著，評估新表位特異性cd8t細胞應(yīng)答以觀察它們是否可以在免疫后在攜帶腫瘤的小鼠中進一步擴增。在單次免疫后，與未免疫的健康動物相比，adpgk反應(yīng)性cd8t細胞的頻率在攜帶腫瘤的小鼠的脾中顯著增加(圖4b)。也觀察到在腫瘤中的總cd8til中adgpk特異性cd8t細胞的積累的幾乎三倍增加(圖5b)。肽疫苗接種還增加了腫瘤中cd45⁺細胞和cd8⁺t細胞的總體浸潤，這導(dǎo)致腫瘤中總活細胞中新表位特異性cd8t細胞的頻率的幾乎20倍增加(圖5c)。

此外，分析了通過疫苗接種誘導(dǎo)的肽特異性細胞的表型。發(fā)現(xiàn)tim-3⁺pd-1⁺adgpk特異性cd8til的頻率在疫苗接種后降低，并且這些細胞上pd-1和tim-3的表達表達也是降低的(圖5d和圖5e)。這可以是佐劑效應(yīng)，因為在僅佐劑的組中也看到它。此結(jié)果提示了，腫瘤特異性t細胞在疫苗接種后展現(xiàn)出消耗較少表型，并且這得到接種疫苗的腫瘤中較高的ifn-γ表達性cd8和cd4til的百分比進一步確認(圖5f)。

最后，評估這些疫苗誘導(dǎo)的腫瘤特異性cd8t細胞的定性和定量變化是否可以轉(zhuǎn)化為建立的腫瘤的消退。即使在此較為困難的治療背景中，與未處理的對照或僅佐劑的組相比，接種疫苗的小鼠顯示顯著的對腫瘤生長的抑制(圖5g)。如此，用具有預(yù)測的新表位的簡單肽疫苗接種產(chǎn)生了足夠的t細胞免疫以排斥以前建立的腫瘤。

方法

對h-2b-背景的兩種鼠細胞系：tramp-c1(atcc)和mc-38(academischziekenhuisleiden)的h-2kb和h-2db配體組進行mhci肽概況分析。如先前描述的那樣制備自c57bl/6小鼠衍生的細胞。關(guān)于制備細胞系的方法的完整描述，參照美國專利申請流水號13/087,948和美國專利申請流水號11/00,474。使用兩種不同的抗體免疫沉淀每份樣品的mhci分子，以分別提取h-2kb特異性和h-2db特異性肽。通過使用180分鐘梯度的反相層析(nanoacquityuplc系統(tǒng)，waters，milford，ma)分離肽。通過配備有電噴霧離子化(esi)源的ltq-orbitrapvelos雜合質(zhì)譜儀(thermofisherscientific，bremen，germany)中的數(shù)據(jù)依賴性獲得(dda)分析洗脫的肽。使用下述方法獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，所述方法包括在orbitrap(對于前3為r＝30,000，對于前5為r＝60,000)中的高質(zhì)量準確性的全掃描(調(diào)查掃描)，接著進行對5種最豐富的前體離子(前5)在orbitrap(r＝7500)中或者對3種最豐富的前體離子(前3)在ltq中的ms/ms(概況)掃描。對每套樣品進行7份重復(fù)試樣注射和分析。

在ltq-orbitrapelite質(zhì)譜儀(thermofisher，bremen，germany)上分析對應(yīng)于鑒定突變體mc-38和tramp-c1抗原肽的合成肽，并使用advance源(michrom-bruker，fremont，ca)以1.2kv的噴射電壓離子化。使用由以下組成的方法獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)：以60,000m/δm的分辨率在m/z400在orbitrap中的一次完全ms掃描(375-1600m/z)，接著是在肽片段離子的ltq中的ms/ms(形心)掃描。

使用來自mc-38和tramp-c1癌細胞系的1μg總rna使用truseqrna樣品制備試劑盒(illumina，ca)產(chǎn)生rna-seq文庫。自細胞系純化總rna，并將其片段化成200-300個堿基對(bp)，平均長度為260bp。將rna-seq文庫多路復(fù)用(每道兩種)，并且按照制造商的推薦(illumina，ca)在hiseq2000上測序。

每份樣品產(chǎn)生大于約5000萬個配對末端(2x100bp)測序讀段。使用sureselecthumanallexome試劑盒(50mb)(agilent，ca)實施外顯子組捕捉。然后，使用hiseq測序試劑盒(200個循環(huán))在hiseq2000(illumina，ca)上對外顯子組捕捉文庫測序。

自mc-38測序9290萬(m)個rna片段，并且自tramp-c1測序65.3m個rna片段。對于外顯子組測序，自每種細胞系測序60m個讀段。使用gsnap(wuandnacu,bioinformatics,2010,v.26,873-881)將讀段定位到小鼠基因組(ncbi37或mm9版本)。僅保留獨特定位的讀取以進一步分析。在mc-38樣品中獨特定位80.6m個rna片段，并且在tramp-c1樣品中定位57.6m個rna片段。獨特定位mc-38中的50.9m個外顯子片段和tramp-c1中的52m個片段。為了獲得小鼠基因模型，使用gmap將refseq小鼠基因定位至mm9基因組，然后使用基因組序列做出基因模型。

使用gatk1調(diào)用基于外顯子組-seq的變體。保留具有10％或更大的等位頻率的變體。使用變體效應(yīng)預(yù)測器工具2在對轉(zhuǎn)錄物的影響方面注釋變體。僅保留可以解讀氨基酸變化的變體。為了獲得具有表達證據(jù)的變體，用rna-seq讀取比對對基于外顯子組的變體位置檢查變異的證據(jù)。保留了變體，所述變體通過超過2個rna-seq讀段證實并且基于rna-seq以10％或更多的等位頻率表達。

對于每種氨基酸變異，產(chǎn)生變體全蛋白序列以形成一組推定蛋白，以充當用于搜索lc-ms譜的參照數(shù)據(jù)庫。在缺乏單體型信息的情況中，相同蛋白質(zhì)中的多種變異會以數(shù)據(jù)庫中的不同變體蛋白質(zhì)為特征。

使用mascot算法版本2.3.02(matrixscience，london，uk)針對多環(huán)靶物誘餌數(shù)據(jù)庫uniprot版本2011_12或轉(zhuǎn)錄物組生成的fasta數(shù)據(jù)庫提交串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果用于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索；包括鼠蛋白和常見的實驗室污染物，諸如胰蛋白酶。在無酶特異性、甲硫氨酸氧化(+15.995da)和20ppm前體離子質(zhì)量耐受性的情況下搜索數(shù)據(jù)。

對于在ltq或orbitrap中獲得的ms/ms數(shù)據(jù)，分別在0.8da或0.05da處規(guī)定片段離子質(zhì)量耐受性。使用線性判別算法(lda)將搜索結(jié)果過濾至5％的估計的肽假發(fā)現(xiàn)率(fdr)。為了突變體肽鑒定中較高的置信度，通過肽長度(對于h-2kb數(shù)據(jù)為8和對于h-2db為9)或者采用規(guī)則表達以分離具有以下充分表征的錨定基序h-2kb：xxxx[fy]xx[milv](seqidno.22)和h-2db：xxxx[n]xxx[mil](seqidno.23)的肽進一步過濾數(shù)據(jù)。產(chǎn)生合成肽以驗證序列。

為了產(chǎn)生第一模型，基于模型結(jié)構(gòu)中突變體肽和肽之間的序列相似性，自pdb選擇肽-mhc復(fù)合物結(jié)構(gòu)。對于每種突變體肽模型，使用以下pdb代碼：reps1、2zol4；adpgk、1hoc5；dpagt1、3p9l6；cpne1、1juf7；irgq、1ffn8；aatf，1bz9。由于缺乏可以作為合理起始模型使用的與10聚體肽的復(fù)合物中的發(fā)表的h-2kb晶體結(jié)構(gòu)，沒有對med12肽建模。然后，使用coot10將肽修飾為突變體形式。然后，使用rosettaflexpepdock網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器11優(yōu)化這些第一模型，并選擇最高評分模型進行展示。

還檢查了每種肽的頂部評分flexpepdock模型，并且發(fā)現(xiàn)主鏈定位對于產(chǎn)生的前10種模型是相似的。使用pymol(llc)產(chǎn)生肽-mhc圖像。

給齡期匹配的6-8周齡c57bl/6小鼠(thejacksonlaboratory)腹膜內(nèi)注射pbs中各自與佐劑(50μg抗cd40ab克隆fjk45加上100mg聚(i:c)(invivogen))組合的50mg長肽。在第0天和第14天以及最后一次注射后一周免疫小鼠，使用血液或脾細胞檢測ag特異性cd8t細胞。為了鑒定肽特異性t細胞，用pe綴合的dextramer(mhci/肽復(fù)合物；immudex，denmark)將細胞染色20分鐘，接著用細胞表面標志物cd3、cd4、cd8和b220(bdbiosciences)染色。肽序列如下

reps1：grvlelfraaqlandvvlqimelcgatr(seqidno.1)；

adpgk：gipvhlelasmtnmelmssivhqqvfpt(seqidno.2)；

dpagt1：eagqslvisasiivfnllelegdyr(seqidno.3)；

aatf：skllsfmapidhttmsddartelfrs(seqidno.4)；

irgq：kardetaallnsavlgaaplfvppad(seqidno.5)；

cpne1：dftgsngdpsspyslhylsptgvney(seqidno.6)；

med12：gpqekqqrvelssisnfqavselltfe(seqidno.7)。

給c57bl/6小鼠在右體側(cè)上皮下植入1x105個mc-38腫瘤細胞。分離整個腫瘤，并用膠原酶和dna酶消化以分離til。用dextramer(如上文描述)，接著是針對cd45、thy1.2、cd4、cd8(bdbiosciences)、pd-1(ebiosciences)和tim-3(r&dsystems)的抗體染色til。使用活/死染色對活細胞門控。

給所有動物皮下(右后體側(cè))接種漢克氏平衡鹽溶液(hbss)和無酚紅基質(zhì)膠(bectondickinsonbioscience，sanjose，ca)的懸浮液中1x10⁵個mc-38細胞。對于預(yù)防性研究，在腫瘤接種前3周用佐劑(50mg抗cd40加100mg聚(i:c)或佐劑與各50μgreps1、adpgk和dpagt1肽免疫小鼠。在用腫瘤細胞接種前一天，在血液中測量肽特異性cd8t細胞的誘導(dǎo)。對于攜帶腫瘤的小鼠中的疫苗接種，在用1x105個mc-38腫瘤細胞接種后10天(在研究中包括僅在第10天時具有約100-150mm³體積的腫瘤)，用佐劑或佐劑與各50μgreps1、adpgk和dpagt1肽注射小鼠。一周兩次收集測量和重量。每天稱重展現(xiàn)出動物的第一次體重的超過15％的重量減輕的動物，并且如果它們減輕其第一次體重的超過20％，那么實施安樂死。

較頻繁，根據(jù)嚴重性直至每天觀察到展現(xiàn)出不利臨床問題的動物，并且并且如果瀕死，那么實施安樂死。如果腫瘤體積超過3,000mm³，或在3個月后(若未形成腫瘤)，那么對小鼠實施安樂死。貫穿整個研究，一周兩次實施所有小鼠的臨床觀察。

表

表1：在mc-38細胞系中的mhci上呈遞的突變體肽的匯總。

*每種基因的頂部列出的序列是wt序列，并且每種基因的底部列出的序列是突變體序列。

序列表

<110>l·德拉馬爾（delamarre,leila）

p·盧帕杜斯（lupardus,patrick）

i·梅爾曼（mellman,ira）

m·亞達夫（yadev,mahesh）

s·瓊瓊瓦拉（jhunjhunwala,suchit）

j·萊爾（lill,jennie）

<120>免疫原性突變體肽篩選平臺

<130>146392027600

<140>未指派

<141>隨本文

<150>62/048,742

<151>2014-09-10

<160>23

<170>fastseqforwindowsversion4.0

<210>1

<211>28

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>1

glyargvalleugluleupheargalaalaglnleualaasnaspval

151015

valleuglnilemetgluleucysglyalathrarg

2025

<210>2

<211>28

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>2

glyileprovalhisleugluleualasermetthrasnmetgluleu

151015

metserserilevalhisglnglnvalpheprothr

2025

<210>3

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>3

glualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalpheasn

151015

leuleugluleugluglyasptyrarg

2025

<210>4

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>4

serlysleuleuserphemetalaproileasphisthrthrmetser

151015

aspaspalaargthrgluleupheargser

2025

<210>5

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>5

lysalaargaspgluthralaalaleuleuasnseralavalleugly

151015

alaalaproleuphevalproproalaasp

2025

<210>6

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>6

aspphethrglyserasnglyaspproserserprotyrserleuhis

151015

tyrleuserprothrglyvalasnglutyr

2025

<210>7

<211>27

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>7

glyproglnglulysglnglnargvalgluleuserserileserasn

151015

pheglnalavalsergluleuleuthrpheglu

2025

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>8

serileilevalpheasnleuval

15

<210>9

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>9

serileilevalpheasnleuleu

15

<210>10

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>10

alaglnleuproasnaspvalvalleu

15

<210>11

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>11

alaglnleualaasnaspvalvalleu

15

<210>12

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>12

alasermetthrasnarggluleumet

15

<210>13

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>13

alasermetthrasnmetgluleumet

15

<210>14

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>14

serserproaspserleuhistyrleu

15

<210>15

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>15

serserprotyrserleuhistyrleu

15

<210>16

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>16

alaalaleuleuasnseralaglyleu

15

<210>17

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>17

alaalaleuleuasnseralavalleu

15

<210>18

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>18

metalaproileasphisthralamet

15

<210>19

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>19

metalaproileasphisthrthrmet

15

<210>20

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>20

aspproserserservalleuphegluasp

1510

<210>21

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<400>21

aspproserserservalleupheglutyr

1510

<210>22

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<220>

<221>變體

<222>1,2,3,4,6,7

<223>xaa=任何氨基酸

<220>

<221>變體

<222>5

<223>xaa=phe或tyr

<220>

<221>變體

<222>8

<223>xaa=met,ile,leu或val

<400>22

xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa

15

<210>23

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成構(gòu)建物

<220>

<221>變體

<222>1,2,3,4,6,7,8

<223>xaa=asp或gly

<220>

<221>變體

<222>5

<223>xaa=asn

<220>

<221>變體

<222>9

<223>xaa=met,ile或leu

<400>23

xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa

15