本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種擬海桑提取物的生物活性srb測定方法。
背景技術(shù)：
擬海桑(sonneratiaparacaseolaris)屬于海?？坪Ｉ?，為我國稀有瀕危紅樹植物，僅天然分布于海南島，分布范圍狹窄，個體數(shù)量稀少。正處于瀕危狀態(tài)，被列入《中國生物多樣性國情研究報告》中國被子植物瀕危及稀有種名錄。在前期的生物活性篩選實驗中，擬海桑的甲醇提取物對小鼠白血病腫瘤細胞株p-388和人肝癌細胞株bel-7402顯示較強的細胞毒活性。因此，本項目選擇擬海桑進行細致的化學(xué)成分研究，期望發(fā)現(xiàn)海洋來源活性先導(dǎo)化合物。
擬海桑化學(xué)成分的研究只有一篇報道，2012年郭躍偉課題組對采自廣東湛江的擬海桑進行化學(xué)成分研究，從中分離得到一個新骨架化合物paracaseolidea(69)是一個二聚-烷基丁內(nèi)酯類化合物內(nèi)酯甲素，體外藥理活性篩選顯示該化合物對細胞周期分裂蛋白25b具有顯著的抑制活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在為擬海桑的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。
一種擬海桑提取物的生物活性srb測定方法，步驟如下：
(1)取對數(shù)期的腫瘤細胞，用新鮮的rpmi-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μl加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μl；
(2)37oc培養(yǎng)17h；
(3)離心3min(4oc、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μl預(yù)冷的80%tca溶液，移入4oc冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；
(5)每孔加入0.5%srb染液(1%的tca溶液)50μl，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%tca水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；
(6)每孔加入150μl非緩沖tris溶液溶解(10mm，ph=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標儀在520nm下測定每孔吸光度od值。在96孔板中每個樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對照3孔，取3孔平均值，按公式ir(%)=(od空白-od樣品)/od空白×100%計算細胞增殖抑制率(ir%)，再利用bliss方法由各種濃度的ir求出半數(shù)抑制濃度(ic50)的標準差和平均值。
本發(fā)明的測定原理：磺酰羅丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。srb是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合；在520nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細胞量成線性正相關(guān)，故可用作細胞數(shù)的定量檢測。
本發(fā)明的測定方法相對于現(xiàn)有技術(shù)簡單快速、而且檢測結(jié)果可靠，適于推廣應(yīng)用。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
選擇hela和a549腫瘤細胞株用srb法對從擬海桑分離得到的三萜類化合物(sp-1~sp-17)進行了體外抗腫瘤活性篩選，包括如下步驟：
(1)取對數(shù)期的腫瘤細胞，用新鮮的rpmi-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μl加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μl；
(2)37oc培養(yǎng)17h；
(3)離心3min(4oc、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μl預(yù)冷的80%tca溶液，移入4oc冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；
(5)每孔加入0.5%srb染液(1%的tca溶液)50μl，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%tca水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；
(6)每孔加入150μl非緩沖tris溶液溶解(10mm，ph=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標儀在520nm下測定每孔吸光度od值。在96孔板中每個樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對照3孔，取3孔平均值，按公式ir(%)=(od空白-od樣品)/od空白×100%計算細胞增殖抑制率(ir%)，再利用bliss方法由各種濃度的ir求出半數(shù)抑制濃度(ic50)的標準差和平均值。
測定結(jié)果表1-2，分析表中數(shù)據(jù)可以看出在濃度為50μm濃度水平，除了化合物sp-16所有進行活性的測定的化合物均對腫瘤細胞株hela有抑制作用，化合物sp-2~4，sp-6，sp-8~9，sp-12，sp-14~15對hela表現(xiàn)中等強度的抑制活性，抑制率在50%以上。在濃度為50μm濃度水平，化合物sp-7~11對a549細胞表現(xiàn)出中等強度的細胞毒活性，抑制率50%~70%之間，其余化合物對a549細胞株的抑制活性較弱。
表1擬海桑中三萜化合物sp-1~sp-17對hela腫瘤細胞株的抑制率(%)
表2擬海桑中三萜化合物sp-1~sp-17對a549腫瘤細胞株的抑制率(%)