本發(fā)明涉及納米醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體為一種具有惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視納米微粒制備方法。

背景技術(shù)：

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。手術(shù)切除是臨床上普遍采用的治療手段，由于手術(shù)切除率直接影響其預(yù)后結(jié)果，因而術(shù)前術(shù)中精確的腫瘤定位和邊緣勾勒對于多形性膠質(zhì)瘤的治療極其重要，設(shè)計并研發(fā)出能夠精確定位腫瘤并引導(dǎo)手術(shù)切除的導(dǎo)航探針對盡可能徹底的切除病灶并最大程度保留腦組織具有十分重要的意義。

多形性膠質(zhì)瘤術(shù)前術(shù)中定位手段有組織活檢、核磁共振、CT及熒光介導(dǎo)成像等。組織活檢是臨床上常用的腫瘤定性方法，誤差小但耗時長達(dá)30-40min。核磁共振及CT具有放射性小、分辨率高、成像清晰等優(yōu)勢，但是他們提供的是“偽實時”信號，術(shù)中組織移動會造成成像偏差。近年熒光顯影技術(shù)對腦瘤邊界的判定越來越受重視，如熒光素鈉及5-氨基乙酰丙酸鹽(5-ALA)，但是488nm激發(fā)光穿透組織功能僅有1毫米，術(shù)中滲血完全遮擋來自腫瘤的熒光信號，并且由于“光漂白”的發(fā)生光敏劑會隨著時間延長熒光光強降低，此外熒光劑缺乏靶向性，難以靶向修飾，同時暗室條件操作會給手術(shù)帶來不便。

“裸眼可視”是利用肉眼可見染料進(jìn)行腫瘤染色實現(xiàn)無需借助儀器腫瘤裸眼就可以區(qū)分腫瘤組織與正常組織的一種方法。該方法具有簡便、快捷、經(jīng)濟的特點，并且可以避免使用大型設(shè)備、較強的激光光源激發(fā)、熒光淬滅等問題。生物活性染料在臨床上已有所應(yīng)用和發(fā)展，例如美藍(lán)、專利藍(lán)可用于淋巴組織染色、支氣管肺癌血管染色，亞甲藍(lán)用于黑色素瘤染色等。1990年evan’s blue被用于檢驗?zāi)X瘤患者血腦屏障完整性，后續(xù)吲哚菁綠、熒光素鈉、溴酚藍(lán)及考馬斯亮藍(lán)用于腦瘤染色，這些染料能夠?qū)δ[瘤染色效果都很好，裸眼能夠清楚地區(qū)分出腫瘤組織與正常組織，但是靜脈注射后小分子染料易和血清蛋白結(jié)合，被快速排出體外，并且還存在缺乏特異靶向性，使用劑量大等缺點，因而限制了其臨床上的應(yīng)用。納米微粒相比小分子染料具有增強阻滯效應(yīng)(EPR)、大的比表面積、表面基團(tuán)可特異性修飾、降低使用劑量降低毒性等優(yōu)點，2009年聶國朝等人研究納米微粒包裹不同染料用于腫瘤染色，實驗結(jié)果表明與考馬斯亮藍(lán)共價結(jié)合的聚丙烯酰胺納米微粒體外細(xì)胞染色功能最強，體內(nèi)腫瘤染色劑量可降低至35mg/mL。然而該納米微粒的制備方法較為繁瑣，需要多次合成，并且聚丙烯酰胺材料有較強的神經(jīng)毒性，所以研究和開發(fā)具有較強腫瘤細(xì)胞染色功能、低毒、特異靶向及制備方法簡單的納米微粒是惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞染色裸眼可視一大發(fā)展方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種具有腫瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視納米微粒的制備方法及其應(yīng)用。所述納米微粒與小分子染料相比，同等濃度下有較強的紫外可見光吸收，顏色較深，可肉眼觀察。所述靶向納米微粒具有特異性識別膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞染色功能。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供的一種具有腫瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視的納米微粒的制備方法，以伯氨基化合物及其修飾合成產(chǎn)物為骨架材料，京尼平為交聯(lián)劑，利用反相微乳液方法制備所得的納米微粒。

所述骨架材料為賴氨酸、聚賴氨酸、殼聚糖、聚乙烯亞胺、牛血清白蛋白及其修飾物。

所述反相微乳液方法中的反相微乳液體系以環(huán)己烷為油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一種或者多種為表面活性劑，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一種或者多種以上為助表面活性劑，以水溶液分散體系為水相。

所述納米微粒反相微乳體系中，伯氨基化合物濃度為1-100mg/mL，與京尼平摩爾比為8:1-1:2，反相微乳液外超聲交聯(lián)反應(yīng)0-60min。

所述納米微粒粒徑大小受伯氨基化合物濃度、伯氨基化合物與京尼平摩爾比及加入微乳液前超聲交聯(lián)時間影響，伯氨基化合物濃度為1-60mg/mL，與京尼平摩爾比為2:1-1:2，超聲交聯(lián)時間為0-1h。

所述納米微粒動態(tài)光散射檢測粒徑為50-200nm，透射電鏡觀察形貌粒徑大小為5-50nm。

所述納米微粒表面帶有大量負(fù)電荷，表面電勢不受上述伯氨基化合物濃度、與京尼平摩爾比及交聯(lián)時間影響，馬爾文激光粒度儀檢測為﹣25-﹣30mV。

所述靶向納米微粒的靶向分子是葉酸和RGD等，靶向分子與納米顆粒的連接是通過酰胺鍵實現(xiàn)的。

所述靶向納米微粒，葉酸修飾化合物合成葉酸與伯氨化合物投料比為1:1。

所述納米微粒經(jīng)由靶向分子葉酸修飾后，特異靶向膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞染色的濃度為0.12-2mg/mL。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：反相微乳液中利用京尼平交聯(lián)伯氨基化合物形成納米微粒，借助反應(yīng)生成藍(lán)色梔子化合物的特點賦予納米微粒深藍(lán)色，避免直接超大劑量使用染料分子，以及納米微粒包裹染料分子的繁瑣過程。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的賴氨酸京尼平納米微粒動態(tài)光散射粒徑、電勢隨賴氨酸濃度、賴氨酸京尼平摩爾比以及超聲交聯(lián)時間的變化(a.b.c分別為納米粒動態(tài)光散射粒徑隨賴氨酸濃度、賴氨酸京尼平摩爾比以及超聲交聯(lián)時間的變化；a’.b’.c’分別為納米粒表面電勢隨賴氨酸濃度、賴氨酸京尼平摩爾比以及超聲交聯(lián)時間的變化)；

圖2為本發(fā)明實施例提供的賴氨酸葉酸化合物質(zhì)譜圖；

圖3為本發(fā)明實施例提供的靶向賴氨酸京尼平納米微粒紫外近紅外可見光光譜(FA：葉酸，Lys-g：賴氨酸京尼平納米微粒，Lys-g-FA：賴氨酸葉酸京尼平納米微粒)；

圖4為本發(fā)明實施例提供的賴氨酸葉酸京尼平納米微粒透射電鏡形貌觀察結(jié)果；

圖5為本發(fā)明實施例提供的賴氨酸葉酸京尼平納米微粒與其他染料相比，同等濃度下裸眼可視顏色(插圖，樣品濃度為50ug/mL)，紫外近紅外可見光吸光度值(Lys-g-FA：賴氨酸葉酸京尼平納米微粒，ICG：吲哚菁綠，BB：溴酚藍(lán)，CB：考馬斯亮藍(lán)G250，樣品濃度為5ug/mL)；

圖6為本發(fā)明實施例提供的靶向賴氨酸京尼平納米微粒細(xì)胞染色效果圖(納米粒濃度為0.00-2.00mg/mL)。

具體實施方式

本發(fā)明基于伯氨基化合物賴氨酸及其改造產(chǎn)物葉酸賴氨酸為骨架材料，京尼平為交聯(lián)劑，利用反相微乳液的方法制備生物相容性好、自身帶深藍(lán)色的納米微粒，并進(jìn)行腫瘤細(xì)胞染色。

具體實施例如下：

實施例1

1)具有腫瘤細(xì)胞染色裸眼可視的納米微粒是以伯氨基化合物為骨架材料，京尼平為交聯(lián)劑，利用反相微乳液方法制備。伯氨基化合物為小分子賴氨酸、聚賴氨酸、殼聚糖、聚乙烯亞胺、牛血清白蛋白及改造修飾物。

2)具有腫瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視納米微粒以反相微乳液法制得，反相微乳液體系以環(huán)己烷為油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一種或者多種為表面活性劑，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一種或者多種以上為助表面活性劑，以水溶液分散體系為水相。

3)具有腫瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視納米微粒是在伯氨基化合物濃度為30mg/mL，與京尼平摩爾比為1:1，反相微乳液外超聲交聯(lián)反應(yīng)2min得到的。

4)具有腫瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視納米微粒的靶向性是靶向分子和伯氨基化合物羧基酰胺化得到的，并以10％伯氨基化合物的濃度進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。

5)制備具有腫瘤細(xì)胞染色功能的裸眼可視納米微粒的的反相微乳液體系中，體積比：油相：助表面活性劑：水相＝16.5:4:1，表面活性劑在油相、助表面活性劑以及水相組成的混合液中的濃度為0.17g/mL。

實施例2：賴氨酸-京尼平納米微粒制備

1)以18.15mL環(huán)己烷為油相、4.47g tritonX-100為表面活性劑，4.41mL正辛醇為助表面活性劑，混合攪拌超聲均勻。

2)按照權(quán)利要求4描述將賴氨酸溶解在1.1mL去離子水中，形成1、5、30、60、100mg/mL賴氨酸水溶液，按照特定賴氨酸京尼平摩爾比1.5:1稱取京尼平溶解于200uL乙醇中，上述兩種溶液首先混合超聲交聯(lián)反應(yīng)5min，得到水相。水相溶液添加至油相中，攪拌反應(yīng)12h，向混合體系中加入15mL丙酮，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min破乳，收集沉淀，用乙醇洗滌2-3次；然后8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min，得到藍(lán)色產(chǎn)物。測定動態(tài)光散射粒徑及表面電勢考察賴氨酸濃度對納米微粒的影響。

3)4按照權(quán)利要求4描述將賴氨酸溶解在1.1mL去離子水中形成30mg/mL賴氨酸水溶液，根據(jù)賴氨酸京尼平摩爾比8:1、4:1、2:1、1.5:1、1:1稱取一定量的京尼平并溶解于200uL乙醇中，上述兩種溶液首先混合超聲交聯(lián)反應(yīng)5min，得到水相。水相溶液添加至油相中，攪拌反應(yīng)12h，向混合體系中加入15mL丙酮，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min破乳，收集沉淀，用乙醇洗滌2-3次；然后8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min，得到藍(lán)色產(chǎn)物。測定動態(tài)光散射粒徑及表面電勢考察賴氨酸濃度對納米微粒的影響。

4)按照權(quán)利要求4描述將賴氨酸溶解在1.1mL去離子水中形成30mg/mL賴氨酸水溶液，根據(jù)賴氨酸京尼平摩爾比1.5:1稱取一定量的京尼平并溶解于200uL乙醇中，上述兩種溶液首先混合超聲交聯(lián)反應(yīng)0.03、0.5、1、5、12h，得到水相。水相溶液添加至油相中，攪拌反應(yīng)12h，向混合體系中加入15mL丙酮，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min破乳，收集沉淀，用乙醇洗滌2-3次；然后8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min，得到藍(lán)色產(chǎn)物。測定動態(tài)光散射粒徑及表面電勢考察賴氨酸濃度對納米微粒的影響。

5)實驗結(jié)果如圖1所示，納米微粒粒徑受上述賴氨酸濃度、賴氨酸京尼平摩爾比及交聯(lián)時間影響，賴氨酸濃度為30mg/mL、賴氨酸與京尼平摩爾比為1.5:1及交聯(lián)時間為1h時所得納米微粒的粒徑較小且分布較窄，納米微粒表面電勢維持在-25--30mV幾乎不受上述賴氨酸濃度、賴氨酸京尼平摩爾比及交聯(lián)時間影響。故而下述葉酸靶向賴氨酸納米粒選擇以30mg/mL、賴氨酸與京尼平摩爾比為1.5:1及交聯(lián)時間為1h時制備。

實施例3：靶向賴氨酸-京尼平納米微粒的制備

1)葉酸分子羧基活化，通過酰胺化反應(yīng)結(jié)合N-芴甲氧羰基-L-賴氨酸(Fmoc-Lys)的裸露氨基，純化干燥后利用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脫掉N-芴甲氧羰基(Fmoc)，純化得到賴氨酸-葉酸(Lys-FA)化合物，質(zhì)譜分析如圖2所示。

2)以18.15mL環(huán)己烷為油相、4.47g tritonX-100為表面活性劑，4.41mL正辛醇為助表面活性劑，混合攪拌超聲均勻。

3)賴氨酸和葉酸賴氨酸分子溶解在去離子水中超聲漩渦震蕩形成賴氨酸30mg/mL，葉酸賴氨酸分子9mg/mL，按照賴氨酸與京尼平摩爾比1.5:1稱取京尼平溶解于200uL乙醇中，上述兩種溶液混合超聲交聯(lián)反應(yīng)1h制備水相。

4)步驟3)水相添加至步驟2)油相中攪拌超聲，攪拌反應(yīng)12h，向混合體系中加入15mL丙酮，8000rpm，離心5min破乳，收集沉淀，用乙醇洗滌2-3次；然后8000rpm，離心5min，得到藍(lán)色產(chǎn)物。

5)所得產(chǎn)物溶解分散在去離子水中，利用截留分子量為3000Da的纖維素透析袋透析3d，每2h換一次液以除去多余的有機試劑及表面活性劑。

6)進(jìn)行紫外近紅外全波長掃描分析(圖3)產(chǎn)物L(fēng)ys-g-FA納米微粒在285nm有葉酸特殊吸收峰，Lys-g納米微粒沒有，證實了葉酸成功接枝在納米微粒上。

7)如圖4所示，透射電鏡觀察靶向賴氨酸-京尼平納米微粒粒徑為5-10nm。

實施例4：靶向賴氨酸-京尼平納米微粒與商業(yè)染料顏色對比

1)稱取上述靶向賴氨酸-葉酸納米微粒、考馬斯亮藍(lán)、吲哚菁綠及溴酚藍(lán)于去離子水中，形成相同濃度的終溶液。

2)觀察同等濃度下(0.1-1mg/mL)顏色區(qū)別變化，并拍照記錄，如圖5A插圖所示，在50ug/mL下納米微粒顏色最深。

3)在濃度為5ug/mL下進(jìn)行紫外近紅外全波譜掃描，如圖5A所示，靶向賴氨酸-葉酸納米微粒、考馬斯亮藍(lán)、吲哚菁綠及溴酚藍(lán)最大吸收峰分別為584、597、779及594nm。定量分析吸光度值如圖5B所示，在其最大吸收峰下吸光度值分別為0.57±0.00，0.132±0.00，0.534±0.00和0.128±0.00，說明在各自最大吸收峰下，賴氨酸-葉酸納米微粒有最大吸光度值。

實施例5：靶向賴氨酸-京尼平納米微粒的腫瘤細(xì)胞染色功能考察

1)收取U87細(xì)胞3×10⁴個/孔接種到24孔板中，長滿待用。

2)分為空白組及實驗組，每組三個孔，棄去培養(yǎng)基，空白組加入1mL培養(yǎng)基，實驗組分別加入100μL納米微粒溶液及900uL培養(yǎng)基，所得溶液納米微粒終濃度為2.00、1.00、0.50、0.25、0.12、0.06mg/mL。

3)37℃，5％CO₂條件下孵育24h，棄去納米微粒溶液，PBS清洗，加入胰酶100μL消化1min，加入500μL培養(yǎng)液中和，并轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，900rpm×5min得到細(xì)胞沉淀，PBS清洗再次沉淀。實驗結(jié)果即細(xì)胞染色效果圖如圖6所示，靶向納米微粒在上述染色方法下，可進(jìn)行膠質(zhì)瘤細(xì)胞染色，裸眼可視臨界濃度為0.12mg/mL。