本發(fā)明涉及一種檢測雌三醇的試紙條及其應(yīng)用，具體涉及一種用于檢測雌三醇的膠體金試紙條，其特別適用于魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉等動(dòng)物源性食品中雌三醇?xì)埩舻臋z測。

背景技術(shù)：

雌三醇是體內(nèi)雌二醇的代謝物，為主要存在于尿中的一種天然雌激素。然而，在養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)常存在濫用抗生素和激素等現(xiàn)象，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中殘留一定量的雌三醇激素，食用后可能導(dǎo)致人類與激素相關(guān)性疾病容易發(fā)生，如乳腺、卵巢、前列腺腫瘤、內(nèi)分泌相關(guān)的腫瘤、出生缺陷和生育缺陷等，還會(huì)對(duì)嬰兒和青少年的生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響。

基于以上原因，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種用膠體金免疫層析技術(shù)檢測魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉等動(dòng)物源性食品中雌三醇的方法，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足我國食品企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展檢測工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、操作簡單、成本低、檢測時(shí)間短的雌三醇?xì)埩魴z測試紙條。

本發(fā)明所提供的檢測雌三醇?xì)埩舻脑嚰垪l，包括樣品吸收墊(1)、結(jié)合物釋放墊(2)、反應(yīng)膜(3)、吸水墊(4)和底板(7)；所述反應(yīng)膜上具有包被有雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線(5)和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線(6)，所述結(jié)合物釋放墊(2)噴涂有雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。

所述雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由雌三醇半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。

所述雌三醇單克隆抗體是以雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得，是由雌三醇單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得；所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到。

所述樣品吸收墊(1)、結(jié)合物釋放墊(2)、反應(yīng)膜(3)、吸水墊(4)依次粘貼在底板(7)上，所述結(jié)合物釋放墊1/3～1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。

所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或?yàn)V油紙；所述結(jié)合物釋放墊可為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟：

1)制備噴涂有雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；

2)制備具有包被有雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì) 控線的反應(yīng)膜；

3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙條。

具體地說，步驟包括：

1)半抗原制備：將雌三醇與氯乙酸反應(yīng)得到雌三醇半抗原；

2)將雌三醇半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；

3)用雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到雌三醇單克隆雜交瘤細(xì)胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；

5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；

6)將步驟3)制備的雌三醇單克隆抗體加入步驟5)制備的膠體金中，得到雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；

7)將雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物噴涂在結(jié)合物釋放墊上，37℃烘1h后取出，置于干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?/p>

8)將雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線；

9)將樣品吸收墊用含0.5％牛血清白蛋白(體積分?jǐn)?shù))、pH為7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊，樣品吸收墊蓋住結(jié)合物釋放墊，最后切成3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝，4～30℃條件下可保存12個(gè)月。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉中雌三醇?xì)埩舻姆椒?，它包括步驟：

(1)樣品前處理；

(2)用試紙條進(jìn)行檢測；

(3)分析檢測結(jié)果。

本發(fā)明的雌三醇快速檢測試紙條采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，將雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物固定于結(jié)合物釋放墊上，樣品中的雌三醇在流動(dòng)過程中，與結(jié)合物釋放墊上的雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物結(jié)合，形成藥物-抗體-膠體金標(biāo)記物。樣本中的藥物與反應(yīng)膜檢測線上的雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物競爭結(jié)合雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，根據(jù)檢測線紅色條帶有無或顏色深淺來判斷待測樣品液中是否含有雌三醇?xì)埩簟?/p>

檢測時(shí)，樣品經(jīng)處理后滴入試紙條卡孔內(nèi)，當(dāng)雌三醇在樣品中的濃度低于檢測限或?yàn)榱銜r(shí)，單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物在層析過程中會(huì)與固定在反應(yīng)膜上的雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，在檢測線(T)和質(zhì)控線(C)內(nèi)各出現(xiàn)一條紅色條帶；如果雌三醇在樣品中的濃度等于或高于檢測限，單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物會(huì)與雌三醇全部結(jié)合，從而在T線處因?yàn)楦偁幏磻?yīng)不會(huì)與雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。如圖2所示。

陰性：當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示出紅色條帶，檢測線(T)顯色深或顯色一致，判為陰性。

陽性：當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示出紅色條帶，而檢測線(T)顯色淺或不顯色，判為陽性。

無效：當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙條均判為無效。

本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡單、檢測時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點(diǎn)。用本發(fā)明試紙條檢測雌三醇?xì)埩舻姆椒ê啽?、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。

附圖說明

圖1為試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為試紙條檢測結(jié)果判定圖。

圖3為雌三醇半抗原合成圖。

圖4為雌三醇半抗原核磁共振氫譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1雌三醇檢測試紙條的制備

該試紙條的制備方法主要包括以下步驟：

1)制備噴涂有雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；

2)制備具有包被有雌三醇半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；

3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和PVC底板組裝成試紙條。

下面分步詳細(xì)敘述：

1、雌三醇半抗原的制備

取雌三醇1.0g加乙腈溶解，加碳酸鉀0.62g，加氯乙酸0.47g，60℃攪拌6h。檢測，原料基本反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，旋蒸，加水，乙酸乙酯萃取，分去有機(jī)相，水相調(diào)節(jié)PH值到6，乙酸乙酯萃取，分去水相，無水硫酸鈉干燥，蒸干，加二氯甲烷/石油醚1∶1，重結(jié)晶得到半抗原 產(chǎn)物。合成路線如圖3。

取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖4所示，¹H NMR(CDCl₃，300MHZ)δ：11.0(s，1H，COOH)，6.78(d，2H，ArH)，6.44(d，1H，ArH)，4.66(s，2H，-CH2-)，3.58(s，2H，OH)，3.22(m，2H，-CH-)，2.90(m，2H，-CH2)，1.68-1.88(m，10H，-CH2-)，1.04(s，3H，-CH3)，圖譜中化學(xué)位移δ＝11的為羧基氫，4.66為間隔臂上亞甲基氫，除原料特有氫外，這些氫的共振吸收峰的存在說明間隔臂偶聯(lián)成功，即說明半抗原合成成功。

2、免疫原的制備

取15mg半抗原，溶解于1mL DMF中，得到溶液(1)；取30mg EDC和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入(1)中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A。稱取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(PH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天換3次透析液。分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、包被原的制備

取15mg半抗原，溶解于1mL DMF中，得到溶液(1)；取30mg EDC和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入(1)中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A。稱取OVA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(PH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天換3次透析液。分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、雌三醇單克隆抗體的制備

(1)動(dòng)物免疫

將步驟2得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。

(2)細(xì)胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8∶1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

(4)單克隆抗體的制備與純化

增量培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。

所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。

5、羊抗鼠抗抗體的制備

以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。

6、雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

(1)膠體金的制備

用雙蒸去離子水將1％氯金酸稀釋成0.01％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，取100ml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml 1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時(shí)停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。

(2)雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀溶液調(diào)膠體金的pH值至7.0，按每毫升膠體金溶液中加入20～50μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入雌三醇單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10％BSA，使其在膠體金溶液中的終濃度為1％(體積分?jǐn)?shù))，靜置10min。12000r/min、4℃離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)溶緩沖液：含酪蛋白0.02％～0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、吐溫-80 0.05％～0.2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。

7、結(jié)合物釋放墊的制備

將結(jié)合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的濃度為0.5％)、pH為7.2、0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液中，均勻浸濕1h，37℃烘3h備用。用Isoflow噴膜儀將制備好的雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物均勻噴涂在結(jié)合物釋放墊上，每1cm結(jié)合物釋放墊噴涂0.01ml雌三醇單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物后，置于37℃環(huán)境中(濕度＜20％)60min后取出，置于干燥環(huán)境(濕度＜20％)中保存?zhèn)溆谩?/p>

8、反應(yīng)膜的制備

將雌三醇半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物包被到反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線。

包被過程：用磷酸緩沖液將雌三醇半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T線)，包被量為0.8μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/ml，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(C線)，包被量為1.0μl/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

9、樣品吸收墊的制備

將樣品吸收墊置于含0.5％牛血清白蛋白(體積分?jǐn)?shù))、pH7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中 浸泡2h，37℃烘2h備用。

10、試紙條的組裝

將樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次按順序粘貼在PVC底板上；結(jié)合物釋放墊從起始端有1/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末端與反應(yīng)膜的始端連接，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與PVC底板的末端對(duì)齊；所述反應(yīng)膜上有檢測線和質(zhì)控線，檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)均為與所述試紙條的長相垂直的條狀帶；檢測線位于靠近結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；將試紙條用機(jī)器切成3mm寬的小條，裝在特制的塑料制卡中，4～30℃條件下可保存12個(gè)月。

實(shí)施例2樣品中雌三醇?xì)埩舻臋z測

1、樣品的前處理

取已去脂肪的組織樣本于均質(zhì)器中均質(zhì)1min(10000rpm)，或用剪刀剪碎；稱取2.0±0.05g均漿好的組織樣本至10ml聚苯乙烯離心管中，加入1ml樣本提取液，震蕩搖勻；在加入1ml樣本稀釋液于聚苯乙烯離心管中，震蕩搖勻。

2、用試紙條進(jìn)行檢測

用一次性吸管吸取待檢樣本溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔中，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5～10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果，其他時(shí)間判定無效。

3、分析檢測結(jié)果

陰性(-)：T線顯色比C線顯色深或顯色一致，表示樣品中雌三醇濃度低于檢測限，如圖2(a)、(b)。

陽性(+)：T線顯色比C線顯色淺或T線不顯色，表示樣品中雌三醇濃度等于或高于檢測限，如圖2(c)、(d)。

無效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)失效，如圖2(e)、(f)。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙條重新測試。

實(shí)施例3樣品檢測實(shí)例

1、檢測限試驗(yàn)

取空白魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉樣本，在其中分別添加雌三醇至終濃度為5、10、20μg/kg，取試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本重復(fù)測定三次。

用試紙條檢測魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉樣本時(shí)，當(dāng)其中雌三醇添加濃度為5μg/kg時(shí)，呈陰性；當(dāng)其中雌三醇添加濃度為10、20μg/kg時(shí)，呈陽性，表明本試紙條對(duì)魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉中雌三醇的檢測限為10μg/kg。

2、假陽性率、假陰性率試驗(yàn)

取已知雌三醇含量大于10μg/kg的魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉陽性樣本各20份(編號(hào)1-20)和含量小于10μg/kg的魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉陰性樣本各20份(編號(hào)21-40)，用三批試紙條進(jìn)行檢測，計(jì)算其陰陽性率。結(jié)果見表1-4。

表1檢測魚肉樣本結(jié)果

表2檢測雞肉樣本結(jié)果

表3檢測蝦肉樣本結(jié)果

表4檢測豬肉樣本結(jié)果

結(jié)果表明：用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙條檢測陽性魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉樣本時(shí)，結(jié)果全為陽性，可知陽性樣本符合率為100％，假陰性率為0；檢測20份陰性魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉樣本時(shí)，結(jié)果全為陰性，可知陰性符合率為100％，假陽性率為0。說明本發(fā)明的檢測雌三醇的試紙條可以對(duì)魚肉、雞肉、蝦肉、豬肉中雌三醇?xì)埩暨M(jìn)行快速檢測。

3、特異性試驗(yàn)

用雌三醇試紙條檢測1000μg/kg苯甲酸雌二醇、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、泰樂菌素等藥物。結(jié)果顯示，試紙條均呈陰性。說明本試紙條對(duì)1000μg/kg苯甲酸雌二醇、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、泰樂菌素等藥物無交叉反應(yīng)，特異性良好。