用于在固體或半固體介質(zhì)上表征微生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用內(nèi)熒光(IF)測(cè)量結(jié)果在固體介質(zhì)或半固體介質(zhì)上掃描、檢測(cè)和監(jiān)測(cè)微生物的方法和系統(tǒng)。該方法進(jìn)一步涉及利用微生物特有的內(nèi)熒光(IF)測(cè)量結(jié)果在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)、表征和/或鑒定微生物。
【專利說(shuō)明】用于在固體或半固體介質(zhì)上表征微生物的方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年12月15日,申請(qǐng)?zhí)枮?00980156509. 2,發(fā)明名稱為"用 于在固體或半固體介質(zhì)上表征微生物的方法"的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2008年12月16日提交的標(biāo)題為"Methods for Qiaracterization of Microorganisms on Solid or Semi-Solid Media(用于在固體或半固體介質(zhì)上表征微 生物的方法)"、編號(hào)為61/122, 925的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的權(quán)益,其被并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及用于在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、表征、和/或鑒定微生物的方 法和系統(tǒng)。
[000引發(fā)明背景
[0006] 為了臨床診斷目的而分離出來(lái)的微生物W及用W監(jiān)測(cè)食品、醫(yī)療組織(medical tissues)或環(huán)境的污染而分離出來(lái)的那些微生物通常需要被表征,W確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)來(lái) 應(yīng)對(duì)所發(fā)現(xiàn)的生物的存在。傳統(tǒng)的自動(dòng)化表型鑒定分析法,例如Vitek"'、Phoenix?、和 MicroscaiiK系統(tǒng),或者例如API的人工表型試驗(yàn),要求微生物處于適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)階段且無(wú)干 擾介質(zhì)和血液制品,W提供穩(wěn)健的結(jié)果。該些系統(tǒng)使用在鋪板的介質(zhì)上生長(zhǎng)16 - 24小時(shí) 的菌落,之后從所述菌落制備標(biāo)準(zhǔn)化懸浮液,隨后實(shí)際的表征試驗(yàn)要求進(jìn)一步解育4 - 24 小時(shí)來(lái)完成。
[0007] 光學(xué)光譜學(xué)方法例如內(nèi)巧光(intrinsic fluorescence, IF)、紅外光譜(FTIR) 或拉曼光譜具有允許非??焖俚罔b定微生物的潛能,但是僅被證明對(duì)"潔凈的"微生物懸 浮液起作用。出版物已經(jīng)描述了用于微生物表征的IF法,其僅適用于有限的生物組,或 其要求另外的測(cè)量例如特異性結(jié)合事件W滿足功能性表征。由于介質(zhì)自身對(duì)分光鏡圖案 (pattern)的假定的大量影響,直接檢查生長(zhǎng)介質(zhì)上的微生物被認(rèn)為是存在問(wèn)題的。
[000引本發(fā)明通過(guò)提供W下方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題,所述方法能夠?qū)υ谇晒獾墓?體和/或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)、包括高巧光介質(zhì)上直接進(jìn)行分光鏡探測(cè)(interrogate)的微生 物進(jìn)行區(qū)分。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明提供用于在固體和/或半固體介質(zhì)上檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、表征、和/或鑒定微生物 的方法。表征包括廣泛的微生物的分類或分級(jí),W及單一物種的實(shí)際鑒定。如本文所用,"鑒 定"是指測(cè)定先前未知的微生物屬于哪一科、屬、種、和/或菌株。例如,鑒定一個(gè)先前未知 的微生物到科、屬、種、和/或菌株級(jí)別。本文公開的方法允許微生物的檢測(cè)、表征和/或鑒 定比先前技術(shù)更快速,促成了更快速的診斷(例如,在感染或疑似感染的受試者中)和受污 染材料的鑒定(例如,食品和藥品)。包括在本發(fā)明方法中的步驟可W在短時(shí)帖內(nèi)執(zhí)行,W 產(chǎn)生臨床相關(guān)的可操作的信息。在某些實(shí)施方式中,快速生長(zhǎng)的生物可W僅在數(shù)小時(shí)內(nèi)檢 測(cè)和鑒定。較慢生長(zhǎng)的生物可W比先前技術(shù)更快速地檢測(cè)和鑒定,在有用的時(shí)帖內(nèi)提供結(jié) 果。單獨(dú)的鑒定/表征步驟可w在幾分鐘或更少時(shí)間內(nèi)執(zhí)行。該方法也允許同時(shí)(例如, 在混合培養(yǎng)物中)檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、表征、和/或鑒定多種類型的微生物(例如,不同的綱和/或 種)。有益地,在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的方法可W原位完成,而不用破壞菌落,由此保存 了所述菌落進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)或使用。另外,本發(fā)明的方法可W部分或完全自動(dòng)化,由此降 低了操作傳染性材料的風(fēng)險(xiǎn)和/或污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。
[0011] 本發(fā)明的第一方面設(shè)及在固體或半固體介質(zhì)上表征和/或鑒定微生物的方法,包 括:
[0012] (a)在固體或半固體介質(zhì)上探測(cè)一個(gè)或多個(gè)菌落W生成菌落中的微生物特有的內(nèi) 巧光(I巧測(cè)量結(jié)果;和
[0013] 化)基于內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果表征和/或鑒定菌落中的微生物。
[0014] 在一些實(shí)施方式中,其中所述菌落可W是具有小于50 ym的直徑的微菌落。
[0015] 在一些實(shí)施方式中,其中,可W在探測(cè)步驟(a)之前,使已知含有或疑似含有微生 物的樣品在所述固體或半固體介質(zhì)上生長(zhǎng),W生成至少一個(gè)菌落。
[0016] 在一些實(shí)施方式中,其中所述探測(cè)步驟可W是非侵入性的。
[0017] 在一些實(shí)施方式中,其中所述微生物可被表征到一個(gè)或多個(gè)分類模型,所述分類 模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組、功能組、和天然內(nèi)巧光組組成的組。
[0018] 在一些實(shí)施方式中,其中所述微生物可被鑒定到屬級(jí)別、種級(jí)別、或菌株級(jí)別。
[0019] 在一些實(shí)施方式中,其中所述IF測(cè)量結(jié)果可通過(guò)光譜法產(chǎn)生,并且所述光譜法包 括測(cè)定激發(fā)一發(fā)射矩陣巧EM)。優(yōu)選地,其中可將所述邸1與已知微生物的邸1的數(shù)據(jù)庫(kù)相 比較。優(yōu)選地,其中所述可包括至少2個(gè)不同的波長(zhǎng)對(duì)。優(yōu)選地,其中所述ffiM可使用 多變量分析進(jìn)行比較。
[0020] 在一些實(shí)施方式中,所述方法還可包括添加鑒定劑到所述介質(zhì)或樣品中,并且其 中所述鑒定部分地基于所述鑒定劑在所述菌落或從所述菌落回收的微生物中的存在和/ 或數(shù)量。優(yōu)選地,其中所述鑒定劑可W是親和配體、抗體或其片段、核酸探針、抗生素、適體、 膚模擬物、瞻菌體來(lái)源的結(jié)合蛋白、凝集素、宿主防御膚、細(xì)菌素、瞻菌體、染料,或其任何組 厶 口 〇
[0021] 在一些實(shí)施方式中,其中所述固體或半固體介質(zhì)可包括一種或多種對(duì)所述微生物 的生長(zhǎng)有用的營(yíng)養(yǎng)素W及一種或多種添加劑,其中所述一種或多種添加劑增強(qiáng)在所述固體 或半固體介質(zhì)上的所述微生物菌落的所述內(nèi)巧光測(cè)量結(jié)果。優(yōu)選地,其中所述一種或多種 添加劑可選自由W下組成的組;蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、肉類和蔬菜提取物、糖源、緩沖 劑、復(fù)蘇劑、生長(zhǎng)因子、酶輔因子、礦物鹽、金屬補(bǔ)充物、還原化合物、馨合劑、光敏化劑、巧滅 劑、還原劑、氧化劑、洗漆劑、表面活性劑、消毒劑、選擇劑和代謝抑制劑。
[0022] 在一些實(shí)施方式中,其中探測(cè)菌落可包括測(cè)量落射巧光。
[0023] 在一些實(shí)施方式中,其中探測(cè)菌落可包括測(cè)量反射光。
[0024] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)和鑒定微生物的方法,包括:
[0025] (a)掃描已知含有或可能含有一個(gè)或多個(gè)微生物菌落的介質(zhì)W定位存在于介質(zhì)上 的所述菌落;
[0026] 化)探測(cè)一個(gè)或多個(gè)步驟(a)中定位的菌落W生成所述菌落中的微生物特有的內(nèi) 巧光(I巧測(cè)量結(jié)果;和
[0027] (c)基于所述內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果檢測(cè)、表征和/或鑒定菌落中的微生物。
[002引本發(fā)明的另一方面設(shè)及表征和/或鑒定樣品中微生物的方法,包括:
[0029] (a)使樣品中存在的微生物在固體或半固體介質(zhì)上生長(zhǎng),W產(chǎn)生至少一個(gè)菌落;
[0030] 化)探測(cè)介質(zhì)上一個(gè)或多個(gè)菌落,W生成微生物特有的內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果;和
[0031] (C)基于生成的測(cè)量結(jié)果,表征和/或鑒定菌落中的微生物。
[0032] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及檢測(cè)樣品中存在的微生物的方法,包括:
[0033] (a)獲得已知含有或可能含有微生物的樣品;
[0034] 化)使樣品中存在的微生物在固體或半固體介質(zhì)上生長(zhǎng);和
[0035] (C)通過(guò)進(jìn)行所述固體或半固體介質(zhì)的逐點(diǎn)掃描W生成內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果,定 位存在于介質(zhì)上的任一菌落;其中,如通過(guò)生成的測(cè)量結(jié)果定位的一個(gè)或多個(gè)菌落的存在 表明在樣品中存在微生物。
[0036] 在一些實(shí)施方式中,其中所述IF測(cè)量結(jié)果可通過(guò)光譜法產(chǎn)生,并且所述光譜法包 括測(cè)定激發(fā)一發(fā)射矩陣巧EM)。優(yōu)選地,其中所述ffiM可包括至少2個(gè)不同的波長(zhǎng)對(duì)。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明設(shè)及用于在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)、表征和/或鑒 定微生物的系統(tǒng),該系統(tǒng)包括分光光度計(jì)和聚焦光學(xué)部件(focusing optics),例如透鏡系 統(tǒng)或顯微鏡。在其他實(shí)施方式中,該系統(tǒng)還包括用于掃描介質(zhì)表面的機(jī)械裝置和/或用于 控制介質(zhì)的環(huán)境(例如,解育介質(zhì)的環(huán)境)的機(jī)械裝置。
[003引在另一個(gè)實(shí)施方式中,可W探測(cè)菌落W產(chǎn)生測(cè)量結(jié)果,該測(cè)量結(jié)果可W用于檢測(cè)、 表征和/或鑒定該菌落的微生物(例如,可W使用光譜法探測(cè)該菌落)??蒞通過(guò)將所述菌 落的測(cè)量結(jié)果(例如,光譜)與源自已知微生物的相似測(cè)量結(jié)果(例如,一種或多種光譜) 進(jìn)行比較,來(lái)表征和/或鑒定微生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,可W非侵入性地探測(cè)菌落(例 如,在密封平板中)。直接(例如,在密封平板中)表征和/或鑒定菌落中含有的微生物而 不用進(jìn)一步處理的能力增強(qiáng)了微生物鑒定的安全性。
[0039] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,分光鏡的探測(cè)是基于微生物的內(nèi)在特性(例如,內(nèi)巧光)。 在另一個(gè)實(shí)施方式中,分光鏡的探測(cè)部分上基于從附加試劑獲得的信號(hào),該試劑在本發(fā)明 方法過(guò)程中添加,并與特定的微生物或微生物組相互作用。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括回收菌落、重懸浮菌落和執(zhí)行進(jìn)一步 鑒定和/或表征試驗(yàn)的步驟(例如,耐藥性、毒力因子、抗菌譜)。
[0041] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及一種在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)和表征微生物的方法,該 方法包括:
[0042] (a)掃描已知含有或可能含有一個(gè)或多個(gè)微生物菌落的固體或半固體介質(zhì)W定位 存在于所述介質(zhì)上的任何菌落;
[0043] 化)探測(cè)在步驟(a)中定位的一個(gè)或多個(gè)菌落W生成所述菌落中微生物特有的內(nèi) 巧光(I巧測(cè)量結(jié)果;和
[0044] (C)基于所述內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果表征所述菌落中的微生物。
[0045] 在一些實(shí)施方式中,其中所述掃描可包括對(duì)所述固體或半固體介質(zhì)的表面的逐點(diǎn) 掃描。
[0046] 在一些實(shí)施方式中,其中所述菌落可W是具有小于50 ym的直徑的微菌落。
[0047] 在一些實(shí)施方式中,其中所述探測(cè)步驟可W是非侵入性的。優(yōu)選地,其中所述微生 物可被表征到屬級(jí)別或種級(jí)別。
[0048] 在一些實(shí)施方式中,其中所述微生物可被表征到一個(gè)或多個(gè)分類模型,所述分類 模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組、功能組、和天然內(nèi)巧光組組成的組。
[0049] 在一些實(shí)施方式中,其中所述IF測(cè)量結(jié)果可通過(guò)光譜法產(chǎn)生,并且所述光譜法包 括測(cè)定激發(fā)一發(fā)射矩陣巧EM)。優(yōu)選地,其中所述ffiM可包括至少2個(gè)不同的波長(zhǎng)對(duì)。優(yōu)選 地,其中可將所述與已知微生物的ffiM的數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。
[0化0] 在一些實(shí)施方式中,所述方法還可包括添加鑒定劑到所述介質(zhì)或樣品中,并且其 中所述鑒定部分地基于所述鑒定劑在所述菌落或從所述菌落回收的微生物中的存在和/ 或數(shù)量。優(yōu)選地,其中所述鑒定劑可W是親和配體、抗體或其片段、核酸探針、抗生素、適體、 膚模擬物、瞻菌體來(lái)源的結(jié)合蛋白、凝集素、宿主防御膚、細(xì)菌素、瞻菌體、染料,或其任何組 合。
[0051] 在一些實(shí)施方式中,其中所述固體或半固體介質(zhì)可包括一種或多種對(duì)所述微生物 生長(zhǎng)有用的營(yíng)養(yǎng)素和一種或多種添加劑,其中所述一種或多種添加劑增強(qiáng)在所述固體或半 固體介質(zhì)上的所述微生物菌落的所述內(nèi)巧光測(cè)量結(jié)果。優(yōu)選地,其中所述一種或多種添加 劑可選自由W下組成的組;蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、肉類和蔬菜提取物、糖源、緩沖劑、復(fù) 蘇劑、生長(zhǎng)因子、酶輔因子、礦物鹽、金屬補(bǔ)充物、還原化合物、馨合劑、光敏化劑、巧滅劑、還 原劑、氧化劑、洗漆劑、表面活性劑、消毒劑、選擇劑和代謝抑制劑。
[0化2] 在一些實(shí)施方式中,其中探測(cè)菌落可包括測(cè)量落射巧光。
[0化3] 在一些實(shí)施方式中,其中探測(cè)菌落可包括測(cè)量反射光。
[0054] 本發(fā)明在本文附圖中做更詳細(xì)的解釋,并且給出說(shuō)明如下。
[0化5] 附圖簡(jiǎn)述
[0056] 圖1A-1D顯示了來(lái)自未接種的沒(méi)有膜(A)的血瓊脂平板炬AP)或具有置于介質(zhì)表 面上的化11 Metricel Black網(wǎng)格聚離諷膜(Pall)炬)、Whatman黑色混合醋膜(WME) (C) 或Whatman徑跡蝕刻聚碳酸醋黑色膜(WPC)值)的BAP的光譜。
[0057] 圖2A-2C顯示了獲自EC3(A)和SA1炬)的BAP之上的WME膜上的菌落的光譜,W 及從SA1光譜減去EC3光譜的結(jié)果(C)。
[0化引 圖3A-3D顯示了獲自EC1 (A)、SA1炬)、EF1似、和PA1值)的無(wú)膜BAP上的菌落的 光譜。
[0化9] 圖4A-4F顯示了運(yùn)行F的逐點(diǎn)IF捜尋掃描的S維圖,其中高度等于巧光強(qiáng)度。該 圖顯示了取自化(4)、她炬)、1011(〇、1化值)、1化巧)、和2化(。)的測(cè)量結(jié)果。
[0060] 圖5A-5B顯示了 2化后源自運(yùn)行F的BAP的特寫圖像(A),和顯示相應(yīng)菌落位點(diǎn)的 源自12h的捜尋掃描的巧光強(qiáng)度的等高曲線圖炬)。
[0061] 發(fā)明詳述
[0062] 本發(fā)明能夠W不同形式具體實(shí)施,并且不應(yīng)理解為被本文所述實(shí)施方式所限制。 另外,提供該些實(shí)施方式W使得本公開將是透徹和完整的,W及將完全地將本發(fā)明范圍傳 達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。例如,就一個(gè)實(shí)施方式闡述的特征可W引入到其他實(shí)施方式中,且就 一個(gè)特定的實(shí)施方式闡述的特征可W從該實(shí)施方式中刪除。另外,針對(duì)本文建議的實(shí)施方 式的多種變化和添加,從本公開文本的角度來(lái)說(shuō),將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的,并不背離 本發(fā)明。
[0063] 除非另外說(shuō)明,本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù) 人員通常理解的相同含義。在此用于描述本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)僅僅是用于描述特定的實(shí)施方式的 目的,而并非旨在限制本發(fā)明。
[0064] 定義
[0065] 如本文所用,"一"、"一個(gè)"或"該"可指一個(gè)或多于一個(gè)。例如,"一個(gè)"細(xì)胞可W 指一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞或是多個(gè)細(xì)胞。
[0066] 另如本文所用,"和/或"是指并且涵蓋所列相關(guān)事項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)的任何和所 有可能的組合,W及當(dāng)二選一說(shuō)明時(shí)的不組合("或")。
[0067] 此外,如本文所用的術(shù)語(yǔ)"大約"當(dāng)設(shè)及可測(cè)量的數(shù)值時(shí),例如化合物或試劑的量、 劑量、時(shí)間、溫度、等等,意在涵蓋指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0. 5%、或者甚 至±0. 1 %的變化。
[0068] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"微生物"旨在涵蓋可W在實(shí)驗(yàn)室中繁殖和處理的通常是 單細(xì)胞的生物,包括但不限于,革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母、霉菌、寄生蟲和 柔膜體。本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌的非限制性例子包括如下所示的屬的細(xì)菌:假單 胞菌屬(Pseudomonas)、埃希桿菌屬巧scherichia)、沙口氏菌屬(Salmonella)、志賀 氏菌屬(Shigella)、腸桿菌屬巧nterobacter)、克雷白氏桿菌屬化lebsiel la)、沙雷 氏菌屬(Serratia)、變形菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Camp}dobacte;r)、嗜血桿菌屬 (Haemo地ilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森菌屬(Yersinia)、 不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、募養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、短波單胞菌屬 炬revundimonas)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)、無(wú)色桿菌屬(Ac虹omobacter)、梭形桿菌 屬(F'usobacterium)、普氏菌屬(Prevotella)、布蘭漢氏球菌屬炬ranhamella)、奈瑟 菌屬(Neisseria)、伯克霍爾德菌屬炬urldiolderia)、巧樣酸桿菌屬(Citrobacter)、 哈夫巧菌屬(化化ia)、愛(ài)德華菌屬巧dwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、莫 拉菌屬(Moraxella)、布氏菌屬炬rucella)、己斯德菌屬(Pasteurella)、普羅威登 斯菌屬(Providencia)、和軍團(tuán)桿菌屬(Legionella)。本發(fā)明的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 的非限制性例子包括如下所示的屬的細(xì)菌:腸球菌屬巧nterococcus)、鏈球菌屬 (Str巧tococ州S)、葡萄球菌屬(Staphylococ州S)、芽抱桿菌屬炬acillus)、類芽抱桿 菌屬(Paenibacillus)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、消化鏈球 菌屬(P巧tostreptococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、梭菌屬(Clostridium)、 擬桿菌屬炬acteroides)、加德納菌屬(Gar化erella)、庫(kù)克菌屬化0州ria)、乳球菌 屬(Xactococcus)、明串珠菌屬(Xeuconostoc)、微球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌 屬(Mycobacteria)和椿狀桿菌屬(Corynebacteria)。本發(fā)明的酵母和霉菌的非限 制性例子包括如下所示的屬的該些:念珠菌屬(Candida)、隱球菌屬(化yptococ州S)、 諾卡氏菌屬(Nocardia)、青霉屬(Penicillium)、鏈格抱屬(Alternaria)、赤釀母屬 巧hodotorula)、曲霉屬(Aspergillus)、梭霉菌屬(F'usarium)、酵母屬(Saccharomyces) 和毛抱子菌屬(Trichosporon)。本發(fā)明的寄生蟲的非限制性例子包括如下所示的屬的該 些;錐蟲屬(Trypanosoma)、己貝蟲屬炬油esia)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、追原蟲屬 (Plasmodium)、吳策線蟲屬(Wucheria)、布魯絲蟲屬炬rugia)、盤尾屬(Onchocerca)、和耐 格里原蟲屬(化egleria)。本發(fā)明的柔膜體的非限制性例子包括如下所示的屬的該些:支 原體屬(Mycoplasma)和脈原體屬(Ureaplasma)。
[0069] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"菌落"和"微菌落"指的是彼此緊密靠近的、位于一個(gè)表面上的 并且是單個(gè)祖先微生物通過(guò)原位復(fù)制產(chǎn)生的克隆后代的大量微生物或微生物的種群。通 常,"菌落"對(duì)于人類眼睛是可見(jiàn)的,并且通常直徑大于約50 ym、60 ym、80 ym、或100 ym。 然而,如本文所用,除非另外說(shuō)明,術(shù)語(yǔ)"菌落"意在包括具有50 ym或W上直徑的菌落,W 及具有50 ym或W下直徑的"微菌落"。在其他實(shí)施方式中,本發(fā)明設(shè)及掃描、檢測(cè)、表征和 /或鑒定"微菌落"中的微生物。如本文所用,"微菌落"可W包括從約2 y m到50 y m或從 約10 ym到50 ym的范圍。"微菌落"通常對(duì)于肉眼來(lái)說(shuō)太小而看不到(例如,直徑小于約 50 y m)。
[0070] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"掃描"或"進(jìn)行掃描"指的是W系統(tǒng)的或預(yù)定的模式或隨機(jī)地 捜索預(yù)先定義的區(qū)域,W定位目標(biāo)物(例如,微生物菌落)。例如,可通過(guò)在一個(gè)表面上W系 統(tǒng)的或預(yù)定的模式或隨機(jī)地移動(dòng)集中的光束來(lái)"掃描"固體或半固體介質(zhì),W檢測(cè)、定位、或 W其他方式偵測(cè)微生物菌落。在可替代的實(shí)施方式中,固體或半固體介質(zhì)能夠相對(duì)于光束 W系統(tǒng)的或預(yù)定的模式或隨機(jī)地移動(dòng),W檢測(cè)、定位、或W其他方式偵測(cè)微生物菌落。根據(jù) 該實(shí)施方式,光源典型地具有小于約0. 5mm、小于約0. 2mm或小于約0. 1mm的光束直徑。在 另一個(gè)實(shí)施方式中,光束直徑從約5 y m到約500 y m,從約10 y m到約100 y m或從約20 y m 到約80 y m。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施方式中,"進(jìn)行掃描"可能包括固體或半固體介質(zhì)的逐點(diǎn)"掃描"。根據(jù) 該實(shí)施方式,光源(例如,激光束)可W移動(dòng)到固體或半固體介質(zhì)上的第一點(diǎn),執(zhí)行掃描或 探測(cè)步驟,W檢測(cè)和/或表征任何可能存在的微生物菌落。可替代地,所述固體或半固體介 質(zhì)可W相對(duì)于光源移動(dòng),使得對(duì)該固體或半固體介質(zhì)進(jìn)行逐點(diǎn)掃描。隨后,可W移動(dòng)該光源 (例如,激光束)或該固體或半固體介質(zhì),使得可W掃描和/或探測(cè)介質(zhì)上的第二點(diǎn)。該種 逐點(diǎn)掃描過(guò)程可W-直持續(xù),直到完成給定的捜索區(qū)域的逐點(diǎn)掃描。該捜索區(qū)域可W是該 固體或半固體介質(zhì)(例如,介質(zhì)平板)的整個(gè)表面或其一部分。
[0072] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,逐點(diǎn)捜索可W沿著線性軌跡(例如,跨過(guò)介質(zhì)的長(zhǎng)直線)點(diǎn) 到點(diǎn)地執(zhí)行。隨后,光源或介質(zhì)可W移動(dòng)到第二線性行,并且沿著第二線性行的線性軌跡進(jìn) 行逐點(diǎn)捜索。該種逐點(diǎn)和逐行捜索模式(或網(wǎng)格型掃描)可W-直持續(xù),直到完成給定的 捜索區(qū)域。該捜索區(qū)域可W是固體或半固體介質(zhì)(例如,介質(zhì)平板)的整個(gè)表面或其一部 分。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述掃描是連續(xù)掃描(即,連續(xù)的逐點(diǎn)掃描)。
[0073] 本發(fā)明提供了用于在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、表征和/或鑒定微生物的 方法。該快速方法允許微生物的檢測(cè)、表征和/或鑒定比先前技術(shù)更快捷,形成更快速的診 斷(例如,在感染或疑似感染的受試者中),受污染材料(例如,食品、供水和藥品)的表征 和/或鑒定。包括在本發(fā)明的方法中的步驟,從獲得樣品到微生物的表征/鑒定,可W在短 時(shí)帖內(nèi)執(zhí)行,W獲得臨床相關(guān)的可操作信息。在某些實(shí)施方式中,本發(fā)明方法可W在少于約 72小時(shí)內(nèi)執(zhí)行,例如,少于約18、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時(shí)。在某些實(shí)施方式中, 鑒定步驟可W在少于60分鐘內(nèi)執(zhí)行,例如,少于約50、40、30、20、10、5、4、3、2或1分鐘。該 方法可W用于表征和/或鑒定本文所述的任何微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中,微生物為細(xì)菌。 在另一個(gè)實(shí)施方式中,微生物是酵母。在另一個(gè)實(shí)施方式中,微生物是霉菌。該方法可W用 于檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、表征和/或鑒定多種類型的微生物,例如,不同種、屬、科、目、綱、n和/或界 的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的方法容許例如在混合培養(yǎng)物中表征和/或鑒定樣 品中存在的某些類型的微生物或所有不同類型的微生物。在其他實(shí)施方式中,該方法可W 用于表征和/或鑒定兩種或多種不同類型的細(xì)菌,兩種或多種不同類型的酵母,兩種或多 種不同類型的霉菌,或兩種或多種不同類型的細(xì)菌、酵母、和/或霉菌的混合物。多種類型 微生物中的每一種的檢測(cè)可W同時(shí)或幾乎同時(shí)發(fā)生。另外,本發(fā)明的方法可W部分地或完 全地自動(dòng)化,由此降低了操作傳染性材料和/或污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。
[0074] 本發(fā)明的第一方面設(shè)及在固體或半固體介質(zhì)上表征和/或鑒定微生物的方法,包 括:
[0075] (a)在固體或半固體介質(zhì)上探測(cè)一個(gè)或多個(gè)菌落,W生成菌落中微生物特有的內(nèi) 巧光(I巧測(cè)量結(jié)果;和
[0076] 化)基于生成的測(cè)量結(jié)果,表征和/或鑒定菌落中的微生物。
[0077] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)、表征和/或鑒定微生物的方 法,包括:
[007引 (a)掃描已知含有或可能含有一個(gè)或多個(gè)微生物菌落的介質(zhì)W定位存在于介質(zhì)上 的所述菌落;
[0079] 化)探測(cè)一個(gè)或多個(gè)步驟(a)中定位的菌落,W生成菌落中微生特有的內(nèi)巧光 (I巧測(cè)量結(jié)果;和
[0080] (C)基于生成的測(cè)量結(jié)果,表征和/或鑒定菌落中的微生物。
[0081] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及表征和/或鑒定樣品中微生物的方法,包括:
[0082] (a)使樣品中存在的微生物在固體或半固體介質(zhì)上生長(zhǎng),產(chǎn)生至少一個(gè)菌落;
[0083] 化)探測(cè)介質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)菌落,W生成微生物特有的內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果; 和
[0084] (C)基于生成的測(cè)量結(jié)果,表征和/或鑒定菌落中的微生物。
[0085] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及檢測(cè)樣品中微生物的存在的方法,包括:
[0086] (a)獲得已知含有或可能含有微生物的樣品;
[0087] 化)使樣品中存在的微生物在固體或半固體介質(zhì)上生長(zhǎng)訊
[008引 (C)通過(guò)掃描介質(zhì)生成內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果,定位存在于介質(zhì)上的任一菌落;
[0089] 其中,就像生成的測(cè)量結(jié)果所定位的,一個(gè)或多個(gè)菌落的存在表明在樣品中存在 微生物。
[0090] 可W利用本發(fā)明方法試驗(yàn)的樣品包括臨床和非臨床的樣品,其中微生物的存在和 /或生長(zhǎng)是已知的或可疑的,另外還包括接受常規(guī)的或臨時(shí)的試驗(yàn)W確定微生物的存在的 材料樣品。由于本方法的通用性和/或靈敏度,所用樣品的量可W差別很大。樣品制備可 W按照任何數(shù)目的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)來(lái)完成。
[0091] 可W用于試驗(yàn)的臨床樣品包括通常在臨床實(shí)驗(yàn)室和/或研究實(shí)驗(yàn)里進(jìn)行試驗(yàn)的 任一類型樣品,包括但不限于,血液、血清、血漿、血液成分、關(guān)節(jié)液、尿液、精液、唾液、排泄 物、腦脊液、胃內(nèi)容物、陰道分泌物、組織勻漿、骨髓抽吸物、骨勻漿、疲、抽吸物、拭子和拭子 沖洗物、其他體液、等等。
[0092] 本發(fā)明應(yīng)用于研究中W及獸醫(yī)和醫(yī)療應(yīng)用。可W自其獲得臨床樣品的合適的受試 者通常為哺乳動(dòng)物受試者,但是可W是任何動(dòng)物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"包括但不 限于,人類、非人類的靈長(zhǎng)類、牛、綿羊、山羊、豬、馬、貓、狗、兔、曬齒類(例如,大鼠或小鼠) 等。人類受試者包括新生兒、嬰兒、未成年人、成人和老齡受試者??蒞自其獲得樣品的受 試者包括但不限于,哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、和魚類。
[0093] 可W用于試驗(yàn)的非臨床樣品包括如下物質(zhì),其包括但不限于,食品、飲料、藥品、化 妝品、水(例如,飲用水、非飲用水、和廢水)、海水壓載物(seawater ballasts)、空氣、± 壤、污水、植物材料(例如,種子、葉、莖、根、花、果實(shí))、血液制品(例如,血小板、血清、血漿、 白細(xì)胞成分,等等)、供體器官或組織樣品、生物武器化iowarfare)樣品等等。本方法還特 別適合實(shí)時(shí)試驗(yàn),W監(jiān)測(cè)污染水平、過(guò)程控制、質(zhì)量控制、和工業(yè)環(huán)境中的其他類似情況。
[0094] 樣品的體積應(yīng)該足夠大,W在介質(zhì)上鋪板時(shí)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)菌落。適當(dāng)?shù)捏w積將 依賴于樣品的來(lái)源和樣品中微生物的預(yù)期水平。例如,來(lái)自感染傷口的臨床拭子,應(yīng)該比待 檢測(cè)污染程度的飲用水樣品具有單位體積更高水平的微生物,所W,與飲用水樣品相比,將 需要較小體積的拭子材料。通常,樣品大小可W為至少約50ml,例如,100ml、500ml、1000ml 或更多。在其他實(shí)施方式中,樣品可W少于約50ml,例如,少于約40ml、30ml、20ml、15ml、 10ml、5ml、4ml、3ml、或2ml。在某些實(shí)施方式中,樣品大小可W為約1ml或更少,例如,約 750 y 1、500 y 1、250 ]il、100iil、50iil、25iil、10iil、5iil、liil、0. 5]il、0. lyl、或更少。 對(duì)于樣品大小較大的實(shí)施方式,樣品可W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來(lái)過(guò)濾(例如, 經(jīng)過(guò)過(guò)濾膜)和/或濃縮(例如,離屯、、蒸發(fā),等)W減少體積和/或收集樣品中的任何微 生物。在過(guò)濾膜上收集的微生物可W重懸和置于固體或半固體介質(zhì)上,或者過(guò)濾膜可W直 接置于半固體介質(zhì)上。
[0095] 待檢測(cè)的樣品被置于合適的介質(zhì)上,并在有助于微生物生長(zhǎng)的條件下解育。可W 基于已知存在于或疑似存在于樣品中的微生物的類型來(lái)選擇介質(zhì)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 說(shuō),不同微生物的合適的生長(zhǎng)介質(zhì)是已知的。生長(zhǎng)介質(zhì)可W是提供合適營(yíng)養(yǎng)素和限制微生 物運(yùn)動(dòng)(即,提供集中生長(zhǎng))的任何介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中,介質(zhì)可W是半固體介質(zhì),例 如,瓊脂、明膠、藻酸鹽、角叉菜聚糖、或果膠。合適的介質(zhì)包括具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的不同功能的介質(zhì),包括但不限于,通用介質(zhì)、選擇性介質(zhì)、鑒別性介質(zhì)、和/或產(chǎn)色介質(zhì)。 可W選擇和/或調(diào)整介質(zhì),W便可得到有意義的測(cè)量結(jié)果(例如,IF測(cè)量結(jié)果)。合適的半 固體介質(zhì)的例子包括但不限于;AC瓊脂,醋酸桿菌瓊脂,町晚黃一頭抱他晚瓊脂,放線菌瓊 月旨,放線菌分離瓊脂,氣單胞菌分離瓊脂,厭氧瓊脂,厭氧血瓊脂,厭氧TVLS瓊脂,APT瓊脂, Ashby甘露醇瓊脂,曲霉分化瓊脂,ASS瓊脂,金黃色葡萄球菌瓊脂,疊氮血瓊脂,B. T. B.乳 糖瓊脂,桿菌瓊脂,貝爾德-帕克瓊脂,BiGGY瓊脂,膽汁^;:葉巧瓊脂,膽汁^;:葉巧疊氮瓊脂, 膽鹽亮綠淀粉瓊脂,亞硫酸餓瓊脂,血瓊脂,血瓊脂SLMB,B化瓊脂,腦屯、浸液瓊脂,布魯爾 瓊脂,亮綠瓊脂,亮綠膽汁瓊脂,酪紅亮綠乳糖庶糖瓊脂,BR0LACIN瓊脂,BR0LACIN MUG瓊 月旨,布氏瓊脂,BSM瓊脂,緩沖木炭酵母提取物瓊脂,酪蛋白巧瓊脂,彎曲桿菌選擇性瓊脂, 念珠菌IDENT瓊脂,酪蛋白酵母儀瓊脂,CAS0瓊脂,CATC瓊脂,蠟樣芽抱桿菌選擇性瓊脂 (Cereus selective agar),漠化十六燒基S甲錠瓊脂,查-斯二氏瓊脂,中國(guó)藍(lán)乳糖瓊脂, 厚垣抱子瓊脂,克氏巧樣酸鹽瓊脂,克氏尿素瓊脂,巧樣酸鹽瓊脂,CL邸瓊脂,梭菌瓊脂,難 辨梭菌瓊脂,大腸菌類瓊脂,哥倫比亞瓊脂,哥倫比亞血瓊脂,玉米粉瓊脂,蛋白腺酵母玉米 粉瓊脂,CPC-瓊脂,化amp瓊脂,察氏瓊脂,D. T. M.瓊脂,戴維斯最小瓊脂,DCLS瓊脂,脫氧 膽酸鹽巧樣酸鹽瓊脂,脫氧核糖核酸酶試驗(yàn)瓊脂,DEV遠(yuǎn)藤瓊脂,DEV明膠瓊脂,DEV營(yíng)養(yǎng) 瓊脂,葡萄糖酪蛋白腺瓊脂,葡萄糖淀粉瓊脂,畑L瓊脂,孟加拉紅瓊脂值ichloran rose bengal agar),白喉毒性瓊脂,含甲苯胺的DM酶試驗(yàn)瓊脂,大腸桿菌瓊脂,大腸桿菌0157 ; H7MUG瓊脂,ECC瓊脂,ECC選擇性瓊脂,ECD瓊脂,ECD MUG瓊脂,EMB瓊脂,遠(yuǎn)藤瓊脂,阪崎 腸桿菌瓊脂,尿腸球菌瓊脂,腸球菌選擇性瓊脂,走葉巧鐵瓊脂,艾格瓊脂,真菌瓊脂,真菌 生物瓊脂(化ngobiotic agar),加斯納瓊脂,加斯納乳糖瓊脂,明膠鐵培養(yǎng)基,明膠鹽瓊脂, 病菌計(jì)數(shù)瓊脂,葡萄糖漠甲酪紫瓊脂,GSP瓊脂,Hektoen腸道瓊脂,卡那霉素走葉巧疊氮瓊 脂,Karmali彎曲桿菌瓊脂,KF-鏈球菌瓊脂,King瓊脂,克雷白氏桿菌選擇性瓊脂,Kligler 瓊脂,KRANEP瓊脂,Kumlrat瓊脂,保加利亞乳桿菌瓊脂,乳糖TTC瓊脂,LB瓊脂,Leifson 瓊脂,列文EMB瓊脂,李斯特菌瓊脂,李斯特菌單確證瓊脂(Listeria mono confirmatcxry agar),李斯特菌單鑒別瓊脂,李斯特菌選擇性瓊脂,石蕊乳糖瓊脂,化瓊脂,LPM瓊脂,LS 鑒別瓊脂,L - top瓊脂,Luria瓊脂,賴氨酸精氨酸鐵瓊脂,賴氨酸鐵瓊脂,M腸球菌瓊脂, M-17瓊脂,麥康凱瓊脂,含有結(jié)晶紫、氯化鋼和0. 15 %膽鹽的麥康凱瓊脂,麥康凱MUG瓊脂, 麥康凱山梨醇瓊脂,麥芽瓊脂,麥芽提取物瓊脂,甘露醇鹽酪紅瓊脂,McBride瓊脂,McClung To油e瓊脂,M-CP瓊脂,肉肝瓊脂,膜過(guò)濾腸球菌選擇性瓊脂,膜乳糖葡糖巧酸瓊脂,M-遠(yuǎn) 藤瓊脂,M-遠(yuǎn)藤瓊脂 LES,MeReSa 瓊脂,M-FC 瓊脂,Middlebrook 7H10 瓊脂,Middlebrook 7化1瓊脂,牛奶瓊脂,輕型唾液鏈球菌瓊脂曲^13 8311巾31'1118 3肖31〇,匪瓊脂,改良緩沖 炭瓊脂,M0X瓊脂,MRS瓊脂,MS. 0157瓊脂,M-TEC瓊脂,Mueller Hinton瓊脂,MUG蛋白腺 大豆瓊脂,支原體瓊脂,諾布爾瓊脂,營(yíng)養(yǎng)瓊脂,營(yíng)養(yǎng)明膠,OF測(cè)試營(yíng)養(yǎng)瓊脂,0GY瓊脂,0GYE 瓊脂,枯汁瓊脂〇3range serum agar),牛津瓊脂,PALCAM李斯特菌選擇性瓊脂,五氯孟加拉 紅酵母提取物瓊脂(Pentachloro rose bengal yeast agar),蛋白腺酵母提取物瓊脂,腺 化牛奶瓊脂,產(chǎn)氣英膜梭菌瓊脂,酪紅葡萄糖瓊脂,酪紅乳糖瓊脂,酪紅麥芽糖瓊脂,酪紅庶 糖瓊脂,酪紅酒石酸鹽瓊脂,酪獻(xiàn)磯酸鹽瓊脂,苯丙氨酸瓊脂,平板計(jì)數(shù)瓊脂,平板計(jì)數(shù)MUG 瓊脂,PLET瓊脂,PM指示瓊脂,馬鈴馨葡萄糖瓊脂,馬鈴馨葡萄糖孟加拉紅瓊脂,馬鈴馨葡 萄糖庶糖瓊脂,Pril?甘露醇瓊脂,假單胞菌瓊脂,R-2A瓊脂,Raka-Ray瓊脂,快速腸球菌 瓊脂,強(qiáng)化梭菌瓊脂,水稻提取物瓊脂,Rogosa瓊脂,Rogosa化瓊脂,孟加拉紅瓊脂,孟加 拉紅氯霉素瓊脂,S.F.P.瓊脂,薩氏2%葡萄糖瓊脂,薩氏4%葡萄糖瓊脂,薩氏葡萄糖瓊 月旨,具有氯霉素的薩氏葡萄糖瓊脂,沙口氏菌瓊脂,根據(jù)0en6z的沙口氏菌瓊脂,沙口氏菌 顯色瓊脂,SD瓊脂,選擇瓊脂,致病真菌選擇性瓊脂,SFP瓊脂,S -Ga廣/LB瓊脂,Shapton 瓊脂,西蒙斯巧樣酸鹽瓊脂,脫脂牛奶瓊脂,山梨酸瓊脂,酒清藍(lán)瓊脂,SPS瓊脂,SS瓊脂,1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂,葡萄球菌瓊脂,鏈球菌選擇性瓊脂,嗜熱鏈球菌隔離瓊脂,硫酸API瓊脂, 亞硫酸鐵瓊脂,TBX瓊脂,TCBS瓊脂,TCMG瓊脂,Te巧it〇r" -7瓊脂,塞耶馬了瓊脂,熱酸 化瓊脂(Thermoaci化rans agar), Tinsdale瓊脂,番茄汁瓊脂,S 了酸甘油醋瓊脂,S糖鐵 瓊脂,膜蛋白酶大豆瓊脂(tryptic soy agar),蛋白腺瓊脂,蛋白腺葡萄糖提取物瓊脂,蛋 白腺葡萄糖酵母提取物瓊脂,蛋白腺大豆酵母提取物瓊脂,蛋白腺酵母提取物瓊脂,膜蛋白 腺瓊脂(T巧ptose agar), TSC瓊脂,TSN瓊脂,通用啤酒瓊脂,UTI瓊脂,弧菌瓊脂,副溶血 性弧菌庶糖瓊脂,紫紅膽鹽瓊脂,紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂,紫紅膽鹽乳糖瓊脂,紫紅膽鹽乳糖 葡萄糖瓊脂,維生素Bi2培養(yǎng)瓊脂,沃格爾-約翰遜瓊脂,VRB MUG瓊脂,Wi化ins化algren 厭氧瓊脂,威爾遜布萊爾瓊脂,WL鑒別瓊脂,WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂,麥芽汁瓊脂,XLD瓊脂,化T4瓊 月旨,酵母瓊脂,酵母提取物瓊脂,酵母麥芽瓊脂,酵母甘露醇瓊脂,耶爾森氏菌隔離瓊脂,耶 爾森氏菌選擇性瓊脂,YGC瓊脂,YPAD瓊脂,YPDG瓊脂,YPG瓊脂,和YT瓊脂。在一個(gè)實(shí)施 方式中,固體或半固體介質(zhì)可W進(jìn)一步包括一種或多種額外的添加劑,所述添加劑增強(qiáng)或 另外增大在固體或半固體介質(zhì)上的微生物菌落的內(nèi)巧光(I巧測(cè)量結(jié)果??蒞用來(lái)增強(qiáng)內(nèi) 巧光的適當(dāng)?shù)奶砑觿┛蒞包括一種或多種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物,氨基酸,肉類和蔬菜提取物, 糖源(carbohy化ate sources),緩沖劑,復(fù)蘇劑,生長(zhǎng)因子,酶輔因子,礦物鹽,金屬補(bǔ)充物 (metal supplements),還原化合物,馨合劑,光敏化劑,巧滅劑,還原劑,氧化劑,洗漆劑,表 面活性劑,消毒劑,選擇劑(selective agents),代謝抑制劑,或其組合。
[0096] 在其他實(shí)施方式中,所述介質(zhì)可W是例如,置于半固體介質(zhì)的頂部的過(guò)濾器(例 如,過(guò)濾膜或玻璃纖維過(guò)濾器)。在其他實(shí)施方式中,該過(guò)濾器置于材料(例如,吸收墊) 的上方,該材料暴露(例如,浸潰)于液體介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中,樣品(例如,大體積樣 品)可W穿過(guò)過(guò)濾器W收集樣品中存在的任何微生物。過(guò)濾器隨后可W置于生長(zhǎng)介質(zhì)的頂 部,并在適宜微生物生長(zhǎng)的條件下解育。合適的過(guò)濾膜對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的,并且 包括適于收集微生物和/或能夠支持微生物生長(zhǎng)的任何膜。膜材料的例子包括但不限于, 纖維素、混合纖維素醋、硝化纖維素、聚氯己締、巧龍、聚四氣己締、聚諷、聚離諷、聚碳酸醋 黑和混合醋黑,包括它們的任何組合。過(guò)濾器可W具有適于過(guò)濾液體和/或收集微生物的 孔徑,例如,對(duì)于酵母為約1 y m至約25 y m,W及對(duì)于細(xì)菌為約0. 05 y m至約2 y m,例如約 0. 2 y m 至約 1 y m。
[0097] 在某些實(shí)施方式中,介質(zhì)可W存在于平板中,例如,標(biāo)準(zhǔn)的微生物瓊脂平板。在一 些實(shí)施方式中,所述平板可W是多孔平板,每個(gè)平板具有,例如,2、4、6、8、12、24、32、48、64、 96、128、或更多的孔,W檢測(cè)多個(gè)樣品。該平板可W由任何適合微生物生長(zhǎng)的材料制成,例 如,聚苯己締或玻璃。任選地,該平板可W有蓋子。如果在蓋子蓋在平板上的時(shí)候進(jìn)行菌落 的探測(cè),那么蓋子和/或平板可W含有可W透過(guò)至少部分紫外光、可見(jiàn)光、和/或近紅外光 譜的至少一個(gè)區(qū)域,W容許透過(guò)所述蓋子和/或平板進(jìn)行探測(cè)。
[009引在本發(fā)明的方法中,詞組"使樣品中存在的微生物在固體或半固體介質(zhì)上生長(zhǎng)"和 "位于介質(zhì)上的樣品"包括W任何方式使得樣品與介質(zhì)相接觸,W使樣品中存在的微生物能 夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生菌落。在某些實(shí)施方式中,樣品位于固體或半固體介質(zhì)的表面。在其他實(shí)施 方式中,樣品可W與液態(tài)的介質(zhì)相混合,隨后使其固化(例如,傾注平板)使得任何生長(zhǎng)的 菌落嵌入到介質(zhì)中。在另一個(gè)實(shí)施方式中,樣品可W與脫水介質(zhì)混合,使得該介質(zhì)復(fù)水化并 且隨后使其固化。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方式中,固體或半固體介質(zhì)位于容器的底部,該容器含有懸浮在所述 介質(zhì)上面的液體中的微生物。隨后,該容器可經(jīng)過(guò)處理(例如,離屯、)使得微生物位于介質(zhì) 上。之后,可W將液體移除,并解育介質(zhì)使得菌落生長(zhǎng)。例如,血液樣品可W引入到血液培 養(yǎng)管,該培養(yǎng)管含有液態(tài)生長(zhǎng)介質(zhì)和位于底部的固體或半固體介質(zhì)。該培養(yǎng)管隨后經(jīng)過(guò)離 屯、,使得微生物位于固體或半固體介質(zhì)上(任選地,在紅細(xì)胞溶解后),移除液體,培養(yǎng)微生 物,根據(jù)本發(fā)明方法檢測(cè)、和/或鑒定。
[0100] 一旦樣品被放置于介質(zhì)上(例如,利用標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)技術(shù)在介質(zhì)上涂布液體樣 品,和/或通過(guò)在半固體介質(zhì)上放置過(guò)濾膜),在適于樣品中存在微生物的生長(zhǎng)的條件下, 對(duì)該介質(zhì)進(jìn)行解育。所述適宜條件被本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知,并且依賴于具體的微生物和 介質(zhì)??蒞在約20°C到約50°C的溫度下解育介質(zhì),例如約25°C到約45°C,例如約37°C。解 育時(shí)間要足W出現(xiàn)可檢測(cè)到的菌落(通過(guò)視覺(jué)或分光鏡),并且依賴于微生物、溫度、介質(zhì)、 營(yíng)養(yǎng)素水平、和其他決定生長(zhǎng)率的條件。在一些實(shí)施方式中,解育時(shí)間可W約為12小時(shí)或 更少,例如,約11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1小時(shí)或更少。在某些實(shí)施方式中,例如在緩慢 生長(zhǎng)條件下或?qū)τ诰徛L(zhǎng)的微生物來(lái)說(shuō)(例如,分枝桿菌),解育時(shí)間可W約為12小時(shí)或 更多,例如,大約18、24、36、48、或72小時(shí)或更多。在一些實(shí)施方式中,在培養(yǎng)箱中解育介 質(zhì),并且從培養(yǎng)箱中移除介質(zhì)一次或多次,將介質(zhì)置于一種裝置中來(lái)檢測(cè)和/或鑒定任何 在介質(zhì)上生長(zhǎng)的菌落。在其他實(shí)施方式中,可W直接在用來(lái)檢測(cè)和/或鑒定菌落的裝置中 解育介質(zhì),例如,在控溫平板支持器(temperature-controlled plate holder)中。
[0101] 一方面,本發(fā)明設(shè)及在固體或半固體介質(zhì)上探測(cè)微生物菌落,W生成鑒定構(gòu)成該 菌落的微生物的IF測(cè)量結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方式中,可W通過(guò)巧光光譜來(lái)探測(cè)。探測(cè)過(guò)程 能夠W非入侵的方式進(jìn)行,即,當(dāng)探測(cè)菌落時(shí)其可W完整地保留在介質(zhì)上。在另一個(gè)實(shí)施 方式中,含有介質(zhì)和菌落的平板在探測(cè)過(guò)程自始至終都保持密封(例如,不移動(dòng)蓋子)。根 據(jù)該個(gè)實(shí)施方式,所述平板,或其部分,可W由透光(例如,近紅外光(NIR;700nm-14(K)nm) 光譜、紫外光扣V ;190nm-400nm)光譜和/或可見(jiàn)光(VIS ;400nm-700nm)光譜的至少一部 分)的材料組成。合適材料的例子包括但不限于,丙締酸、甲基丙締酸醋、石英、烙凝娃石、 藍(lán)寶石、環(huán)締姪共聚物(C0C)和/或環(huán)締姪聚合物(COP)(例如Zeonex⑩rZeoiiex⑩,San Diego, CA))。能夠W非入侵方式檢測(cè)和/或鑒定微生物,任選地加上在鑒定過(guò)程自始至終 保持平板密封,W及某些或全部操作自動(dòng)化,該些都降低了處理具有或可能具有傳染性和/ 或危害性的微生物所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn),還降低了污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。此外,能夠通過(guò)直接探測(cè)來(lái)鑒 定微生物,而不用進(jìn)一步處理片狀物(pellet)(例如,懸浮和重鋪板(replating)和/或其 他鑒定方法),大大增加了可作出鑒定的速度。在其他實(shí)施方式中,菌落可W懸浮于溶液中, 并且任選地在探測(cè)之前從介質(zhì)中移除。在另一個(gè)實(shí)施方式中,在原位探測(cè)之后菌落懸浮于 溶液中,隨后執(zhí)行進(jìn)一步探測(cè)??蓱?yīng)用于已分離的微生物而不是介質(zhì)上的微生物的菌落的 技術(shù),例如,乳膠凝集試驗(yàn)或自動(dòng)化表型鑒定試驗(yàn),可W在懸浮的微生物上執(zhí)行。
[0102] 在一些實(shí)施方式中,光譜法可W用于分析微生物的內(nèi)巧光特性,例如,在缺少額外 的劑時(shí)存在于微生物內(nèi)的特性,該些額外的劑比如,著色劑(stain)、染料、結(jié)合劑,等等。 在其他實(shí)施方式中,除了分析IF,光譜法還可W用于分析微生物的一個(gè)或多個(gè)外在特性,例 如,僅僅在有額外的劑的幫助下才能檢測(cè)的特性。分光鏡的探測(cè)可W通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員 所知的可W有效檢測(cè)和/或鑒定微生物的一種或多種內(nèi)在或外在特性的任何技術(shù)來(lái)完成。 例如,前面巧光(化ont化ce fluorescence,其中激發(fā)光和發(fā)射光從同一光學(xué)表面進(jìn)入和 離開,如果樣品具有通常的光學(xué)厚度,那么激發(fā)光穿過(guò)非常短的距離進(jìn)入到樣品中(參見(jiàn), 例如,Eisinger, J.,和 J.FloresZ'Rront-face fluorometry of liquid samples(液體樣 品的前面巧光測(cè)定),"Anal.Biochem. 94:15(1983))可W用于片狀物中微生物的鑒定。其 他形式的測(cè)量,例如,落射巧光(epifluorescence)、反射、吸收、和/或散射測(cè)量,也可W用 于本發(fā)明。
[0103] 在本發(fā)明的一個(gè)方面,光譜法通過(guò)使用聚焦光學(xué)部件例如鏡頭系統(tǒng)或顯微鏡裝置 執(zhí)行,W容許提供功能性連接到分光光度計(jì)(例如,使用纖維光學(xué)部件)的紫外、可見(jiàn)光和 紅外范圍的觀測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中,介質(zhì)(例如,位于平板內(nèi))置于顯微鏡載物臺(tái)上,在該 里可w通過(guò)激發(fā)源探測(cè)介質(zhì)w及可視地觀察(例如,通過(guò)顯微鏡)探測(cè)介質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施 方式中,可W通過(guò)移動(dòng)平板本身或移動(dòng)附著有平板的顯微鏡載物臺(tái)手動(dòng)操作平板來(lái)確定菌 落位置W便探測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,顯微鏡載物臺(tái)為自動(dòng)控制的(例如,動(dòng)力載物臺(tái)), W便掃描附著在載物臺(tái)上的平板(例如,W設(shè)計(jì)用W覆蓋待掃描的整個(gè)部分的設(shè)置模式)。 在另一個(gè)實(shí)施方式中,當(dāng)集中光束例如激光掃描整個(gè)介質(zhì)時(shí),介質(zhì)保持靜止,發(fā)射光被成像 或非成像檢測(cè)器檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,顯微鏡可W包括能控制溫度(例如,水?。┑?平板培養(yǎng)箱,使得平板可W保持在顯微鏡下并且在介質(zhì)解育過(guò)程中進(jìn)行探測(cè)。
[0104] 在本發(fā)明的一方面,激發(fā)源直接對(duì)準(zhǔn)單個(gè)菌落,W生成IF測(cè)量結(jié)果。探測(cè)時(shí),菌落 可W是任何大小,只要足夠大W便形成精確的測(cè)量結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方式中,當(dāng)人眼無(wú)法 檢測(cè)時(shí),可W對(duì)菌落進(jìn)行探測(cè)。例如,當(dāng)菌落包括少于約10,000個(gè)微生物時(shí),例如,少于約 5000、1000、500、400、300、200、或100個(gè)微生物,該菌落可W進(jìn)行探測(cè)。在其他實(shí)施方式中, 當(dāng)菌落直徑小于約1000 y m或在其最長(zhǎng)尺度上長(zhǎng)度小于約1000 y m(如果該菌落不是圓形) 時(shí),該菌落可W進(jìn)行探測(cè)。例如,當(dāng)菌落為約900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、 或25 ym或更少時(shí),該菌落可W進(jìn)行探測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中,激發(fā)光束的直徑小于待探 測(cè)的菌落,使得完整光束可W直接落在菌落上,并且介質(zhì)基本不會(huì)干擾IF測(cè)量結(jié)果。在某 些實(shí)施方式中,激發(fā)光束的直徑小于約1000 y m,例如,小于約900、800、700、600、500、400、 300、200、100、50、或25^111。激發(fā)光束的尺寸,^及發(fā)射光束的尺寸是可控的,例如,使用小 孔。在某些實(shí)施方式中,激發(fā)光束直接落在菌落中屯、。在其他實(shí)施方式中,激發(fā)光束直接落 在菌落的其他部位(例如,在邊緣和/或邊緣附近),該部位的微生物與位于菌落中屯、的微 生物相比,可能處于不同的生長(zhǎng)和/或新陳代謝狀態(tài)。在另外的實(shí)施方式中,激發(fā)光束可W 直接落在菌落內(nèi)的某一特定深度,例如,使用共聚焦顯微鏡。
[0105] 菌落的照明源或激發(fā)源,可W選自為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何數(shù)量的合適光 源??蒞使用能產(chǎn)生可用數(shù)據(jù)的電磁波譜的任何部分。可W使用能夠發(fā)射紫外光譜、可見(jiàn) 光譜和/或近紅外光譜的光源,W及電磁光譜的其他部分,該些為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例 如,光源可W是連續(xù)能譜的燈,比如,生成紫外光的気或氣弧燈和生成可見(jiàn)/近紅外激發(fā)的 鶴面素?zé)?。如本【技術(shù)領(lǐng)域】所熟知,該些光源提供寬廣的發(fā)射范圍,并且針對(duì)特殊的激發(fā)波長(zhǎng) 的光譜帶寬可W使用光學(xué)干設(shè)過(guò)濾器、棱鏡和/或光柵來(lái)減少。
[0106] 可替代的,多數(shù)窄帶光源,例如發(fā)光二極管和/或激光,可W空間多路傳輸W提供 多波長(zhǎng)的激發(fā)源。例如,發(fā)光二極管在190nm到超過(guò)900nm是可用的,該源具有20-40nm的 譜帶寬度(半高全寬)。激光在從紫外到近紅外的離散波長(zhǎng)中是可用的,并可W用于本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的多路方法。
[0107] 任何光源的光譜選擇性可W通過(guò)利用光譜區(qū)分裝置來(lái)改善,例如掃描單色器。也 可W使用其他的區(qū)分方法,如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的,例如聲光可調(diào)濾波器、液晶可調(diào)濾 波器、光學(xué)干設(shè)濾波器陣、棱鏡攝譜儀,等等,及其任何組合。選擇光譜鑒別器要考慮的是 調(diào)節(jié)范圍和選擇性水平。舉例說(shuō)明,例如,鑒別器可W使用波長(zhǎng)范圍300-800nm和選擇性 lOnm。該些參數(shù)通常決定達(dá)到調(diào)節(jié)范圍和選擇性而必需的最適宜技術(shù)。
[0108] 通常,光源引起樣品激發(fā),隨后在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)或連續(xù)測(cè)量從樣品發(fā)射的巧光。類似 的,可W測(cè)量來(lái)自激發(fā)源和樣品的相互作用的反射光,W提供檢測(cè)和/或表征的有關(guān)數(shù)據(jù)。
[0109] 來(lái)自樣品的發(fā)射可W通過(guò)任何合適的光譜區(qū)分裝置測(cè)量,在某些實(shí)施方式中使用 分光計(jì)。該分光計(jì)可w是掃描單色器,其檢測(cè)特定的發(fā)射波長(zhǎng),其中掃描單色器的輸出由光 電倍增管檢測(cè),和/或該分光計(jì)可W被配置成攝譜儀,其中輸出由圖像檢測(cè)器陣?yán)珉姾?禪合器件(CCD)檢測(cè)器陣檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中,鑒別器允許通過(guò)光電檢測(cè)裝置(例如 光電倍增管、雪崩光電二極管、CCD檢測(cè)器陣、和/或電子倍增電荷禪合器件(EMCCD)檢測(cè) 器陣)觀察巧光和/或散射信號(hào)。
[0110] 分光鏡技術(shù)用于獲得如下測(cè)量結(jié)果:所述測(cè)量結(jié)果被優(yōu)選提供為激發(fā)-發(fā)射矩陣 巧EM)測(cè)量結(jié)果。如本文所用,EEM被定義為巧光物質(zhì)的發(fā)光光譜發(fā)射強(qiáng)度,是激發(fā)波長(zhǎng)和 發(fā)射波長(zhǎng)兩者的函數(shù),包括完整光譜或其子集,其中子集可W含有一個(gè)或多個(gè)激發(fā)/發(fā)射 對(duì)。另外,具有固定激發(fā)波長(zhǎng)的邸1截面圖可W用于顯示特定激發(fā)波長(zhǎng)的發(fā)射光譜,具有 固定發(fā)射波長(zhǎng)的邸1截面圖可W用于顯示樣品的激發(fā)光譜。在一個(gè)實(shí)施方式中,多個(gè) 在多于一個(gè)的特定激發(fā)-發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)處被測(cè)量,例如,至少在2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、50,或更多特定激發(fā)-發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)。在某些實(shí)施方式中,測(cè)量的激發(fā)-發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)的數(shù) 量要足W確定精確的微生物的種,例如,約5至約30對(duì),例如,約10至約20波長(zhǎng)對(duì)。在其 他實(shí)施方式中,測(cè)量的激發(fā)-發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)的數(shù)量要足W至少部分地鑒定微生物,例如獲得 足夠有用的活動(dòng)信息,例如,足W鑒定如下文所述的分類組的信息。例如,提供有用活動(dòng)信 息(例如,分類組)的激發(fā)-發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)的適當(dāng)數(shù)量可W為約2至約8對(duì),例如約3至約5 對(duì)。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明,將已知微生物菌落作為對(duì)照測(cè)量結(jié)果,因此允許使用本領(lǐng)域技術(shù)人 員所知的各種數(shù)學(xué)方法,將測(cè)量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與目標(biāo)微生物的表征相聯(lián)系。例如,可W使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員所知的軟件系統(tǒng),將樣品數(shù)據(jù)與基線或?qū)φ諟y(cè)量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。更具體地, 數(shù)據(jù)可W通過(guò)多種多變量分析方法進(jìn)行分析,例如,比如廣義判別分析(GDA)、偏最小二乘 判別分析(PLSDA)、偏最小二乘回歸(PLSR)、主成分分析(PCA)、平行因子分析(PARAFAC)、 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析(NNA)、和/或支持向量機(jī)(SVM)。在設(shè)計(jì)用于如前所述地監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和/或 表征生物的系統(tǒng)中,該些方法可W用于將未知的目標(biāo)微生物基于現(xiàn)有的命名法歸類成有關(guān) 組,和/或基于生物的新陳代謝、病原性和/或毒力歸類成天然存在組。
[0112] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,來(lái)自檢測(cè)系統(tǒng)的非分光鏡的測(cè)量結(jié)果,例如檢測(cè)時(shí)間和生 長(zhǎng)率,可W用于輔助表征和/或鑒定來(lái)自菌落的微生物。另外,源自固體或半固體介質(zhì)的攝 影圖像的測(cè)量結(jié)果可W提供有價(jià)值的關(guān)于菌落中微生物表征和/或鑒定的信息,例如,菌 落大小,形狀、顏色和密度。
[0113] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中,菌落中微生物的表征和/或鑒定不需要包括精確的 種的鑒定。表征包括生物粒子的廣泛的分類或分級(jí),W及單一種的實(shí)際鑒定。來(lái)自菌落的 微生物的分類可W包括微生物表型和/或形態(tài)學(xué)特征的測(cè)定。例如,生物粒子的表征可W 基于可見(jiàn)的差別來(lái)完成,例如,組分、形狀、大小、群集和/或新陳代謝。在一些實(shí)施方式中, 目標(biāo)生物粒子的分類可W不要求對(duì)給定生物粒子的特征的先前了解,而是僅要求與經(jīng)驗(yàn)的 測(cè)量結(jié)果相一致的相關(guān)性,因此使得該種方法與基于特定結(jié)合事件或新陳代謝反應(yīng)的方法 相比,更加通用和容易適應(yīng)。如本文所用的,"鑒定"是指確定先前未知的微生物屬于哪一 科、屬、種和/或菌株。例如,鑒定一種先前未知的微生物到科、屬、種和/或菌株級(jí)別。
[0114] 在某些例子中,表征包括分類模型,其為將采取的行動(dòng)提供足夠有用的信息。如 本文所用,優(yōu)選的分類模型包括分成如下一個(gè)或多個(gè)組;(1)革蘭氏組;(2)臨床革蘭氏組; 做治療組;(4)功能組郝妨天然內(nèi)巧光組。
[0115] (1)壟蘭反IL;在革蘭氏組分類中,基于微生物的革蘭氏染色反應(yīng)及其總尺寸,可 W將微生物分為3個(gè)廣泛的分類類別,所述組選自如下的一個(gè)或多個(gè);(a)革蘭氏陽(yáng)性微生 物,其革蘭氏染色呈深藍(lán)色;化)革蘭氏陰性微生物,其革蘭氏染色呈紅色;和(C)酵母細(xì) 胞,其革蘭氏染色呈深藍(lán)色,但酵母細(xì)胞是非常大的圓形細(xì)胞,通過(guò)其形態(tài)學(xué)特征和大小可 W和細(xì)菌區(qū)別開。
[0116] (2)臨巧革蘭氏組:革蘭氏組可W講一巧分成若干個(gè)代表形杰學(xué)特征差異的亞 類。該些亞類包括由具有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員報(bào)道的所有相關(guān)的臨床信息,由此,與陽(yáng)性 或陰性革蘭氏反應(yīng)相比,提供了更高水平的鑒定。該個(gè)特定的分類非常有幫助,因?yàn)槠渫ㄟ^(guò) 使用自動(dòng)系統(tǒng)提供等效的臨床相關(guān)信息排除了關(guān)于依賴革蘭氏染色的質(zhì)量和/或技術(shù)人 員讀取涂片的技術(shù)水平的許多憂慮。更特別的,基于該種分類模型的微生物亞類可W選自 如下的一種或多種;(a)球菌,其為小圓細(xì)胞;化)雙球菌,其為兩個(gè)彼此連接的小圓細(xì)胞; (C)桿狀菌,其為矩形形狀;和(d)桿菌,其為桿狀??蒞通過(guò)附加的形態(tài)學(xué)信息而確定的 該些亞類的例子包括;(i)革蘭氏陽(yáng)性球菌;(ii)革蘭氏陽(yáng)性鏈狀球菌;(iii)革蘭氏陽(yáng)性 簇狀球菌群集(即,"葡萄樣"簇(cluster)) ; (iv)革蘭氏陽(yáng)性雙球菌;(V)革蘭氏陽(yáng)性桿狀 菌;(Vi)革蘭氏陽(yáng)性的具有內(nèi)生抱子的桿狀菌;(vii)革蘭氏陰性桿狀菌;(viii)革蘭氏 陰性球桿菌;(ix)革蘭氏陰性雙球菌;(X)酵母;和(xi)絲狀真菌。
[0117] (3)治療組;治療組包括多個(gè)微生物的種,當(dāng)從特定樣本類型中分離時(shí),該些種 用相同類別的抗生素或抗生素混合物治療(參考;"San化rd Guide to Antimicrobial 化erapy 2008 (桑福德抗微生物治療指南2008)")。在許多情況下,臨床醫(yī)生不需要種級(jí)別 的身份來(lái)使得最初的經(jīng)驗(yàn)療法能夠變?yōu)楦嗅槍?duì)性的療法,因?yàn)槌^(guò)一個(gè)種可W用相同的 抗生素選擇來(lái)治療。該個(gè)分類等級(jí)正確地把該些"相同-治療"微生物分到一個(gè)治療類別 中。該種表征水平的例子包括,把高度耐藥的腸桿菌科巧B)的種和敏感的邸的種(來(lái)自 大腸桿菌的腸桿菌屬菌巧nterobacter spp.))區(qū)分,或把耐-氣康挫的念珠菌屬的種(光 滑念珠菌杞gl油rata)和克魯斯念珠菌杞kruzei))和敏感的念珠菌屬的種(白色念珠 菌(C. a化icans)和近平滑念珠菌(C. parapsilosis))區(qū)分開,等等。
[011引 (4)功能組:巧據(jù)本發(fā)巧,微牛物還可W基于新陳代謝、毒力、和/或表巧特征的混 合而分成若干個(gè)組。非發(fā)酵微生物可W清楚地與發(fā)酵微生物區(qū)分。此外,產(chǎn)生溶血素的微 生物種可W與非溶血性的種分別分組。在某些情況下,該些組代表著比屬級(jí)別更大的類別 (例如,大腸桿菌類,革蘭氏陰性非發(fā)酵類桿狀菌),處于屬級(jí)別的某些類別(例如,腸球菌 屬、念珠菌屬),更接近種級(jí)別的區(qū)別的某些類別(例如,凝固酶陰性葡萄球菌、a-溶血性 鏈球菌、0 -溶血性鏈球菌、凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌即金黃色葡萄球菌)。
[0119] (5)天然內(nèi)巧光("IF")組;還可W基于微牛物聚成一組的自然趨執(zhí)按照其固 有的和/或內(nèi)在的巧光特征來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行分類。某些組可能為治療組和功能組類別所 共有。該些分組可W包括具有特征性IF譜貌(signature)的單個(gè)的種,例如,糞腸球菌 巧.faecali)、化脈性鏈球菌(S. pyogenes)或銅綠假單胞菌化aeruginosa),和/或可W含 有具有相對(duì)保守的IF譜貌的生物小組,例如大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷白氏桿菌化oxytoca)或 產(chǎn)氣腸桿菌化aerogenes)和弗氏巧樣酸桿菌(C.化eundii)組。
[0120] 除了為鑒定目的測(cè)量微生物內(nèi)在特性(例如,內(nèi)巧光)W外,本發(fā)明方法可W進(jìn)一 步包括使用添加的鑒定劑(identifier agent)來(lái)輔助鑒定過(guò)程。結(jié)合特定微生物的試劑, 例如親和配體,可W用于分離微生物,W鑒定微生物的類別或種(例如,通過(guò)結(jié)合到獨(dú)特的 表面蛋白或受體),和/或鑒定微生物的特性(例如,抗生素耐藥性)。有用的鑒定劑包括 但不限于,單克隆抗體和多克隆抗體及其片段(例如,鑒定金黃色葡萄球菌的抗-Eap)、核 酸探針、抗生素(例如,盤巧西林、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B)、適體、膚模擬物、瞻菌體來(lái)源的結(jié) 合蛋白、凝集素、宿主先天免疫生物標(biāo)志物(急性期蛋白、li^S結(jié)合蛋白、CD14、甘露糖結(jié)合 凝集素、Toll樣受體)、宿主防御膚(例如,防御素、cathelicidin、proteogrin、爪贍抗菌 膚)、細(xì)菌素(例如,硫離抗生素(lantibiotic)比如,乳酸鏈球菌膚、mersacidin、表皮素、 gallidermin和植物乳桿菌素C和II類膚)、瞻菌體化及核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、多糖、英 膜/粘質(zhì)或蛋白的選擇性巧光染料,包括其任何組合。如果試劑本身沒(méi)有可檢測(cè)信號(hào),那么 試劑可W被標(biāo)記W提供可檢測(cè)信號(hào),例如通過(guò)將試劑輛合到標(biāo)記物上(例如,可見(jiàn)的或巧 光的標(biāo)記物)。標(biāo)記物包括但不限于,巧光的、發(fā)光的、發(fā)磯光的、放射性的、和/或比色的化 合物。所述試劑可W在本發(fā)明方法的任何步驟加入到微生物中,例如,當(dāng)樣品位于介質(zhì)上時(shí) 和/或當(dāng)菌落被檢測(cè)完后。在某些實(shí)施方式中,所述試劑在菌落中的存在和/或數(shù)量可W 在探測(cè)菌落過(guò)程中來(lái)測(cè)定。其他有用的鑒定劑包括,微生物酶的底物、馨合劑、洗漆劑、表面 活性劑、消毒劑(例如,酒精、漂白劑、過(guò)氧化氨)和有毒化合物(例如,疊氮化鋼、氯化鐘) 和代謝抑制劑例如環(huán)己酷胺、等等。類似地,許多用于測(cè)量微生物細(xì)胞活力、新陳代謝和/ 或膜電位的巧光化合物,可W用作本發(fā)明的鑒定劑。
[0121] 在在本發(fā)明的一個(gè)方面,該方法進(jìn)一步包括從菌落中回收微生物W及執(zhí)行附加試 驗(yàn)的步驟?;厥盏奈⑸锟蒞懸浮于適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中,例如,鹽水。一旦懸浮,微生物可W進(jìn) 行任何需要的進(jìn)一步試驗(yàn),如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知和上文所述的。特別的,任何要求潔凈 微生物樣品的試驗(yàn)可W用懸浮的微生物執(zhí)行。在某些實(shí)施方式中,可W執(zhí)行附加的鑒定和 /或表征試驗(yàn)。鑒定試驗(yàn)的例子包括Vitek 2,擴(kuò)增的和非擴(kuò)增的核酸試驗(yàn)(NAT),產(chǎn)色和 乳膠凝集測(cè)定,免疫測(cè)定(例如,使用標(biāo)記的一抗或二抗和/或其他配體),質(zhì)譜法(例如, MLDI-T0F質(zhì)譜法)和/或其他光學(xué)技術(shù),例如紅外光譜(FTIR)或拉曼光譜。也可W執(zhí)行 附加的表征試驗(yàn),例如耐藥性、抗菌譜、和/或毒力因子。附加的表征可W是在本方法起始 鑒定步驟中啟動(dòng)的試驗(yàn)的一部分。例如,耐受甲氧西林的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)可W通過(guò) 在菌落生長(zhǎng)之前向樣品中添加巧光標(biāo)記的盤巧西林來(lái)啟動(dòng)。結(jié)合的盤巧西林的存在和/或 數(shù)量可W隨后測(cè)定,例如,在菌落中或在從菌落回收的微生物中。在某些實(shí)施方式中,一個(gè) 或多個(gè)附加試驗(yàn)可W在與進(jìn)行鑒定步驟相同的系統(tǒng)中執(zhí)行,例如,在相同的裝置中。在一個(gè) 實(shí)施方式中,特定的附加試驗(yàn)可W基于所作的鑒定選自許多可用的試驗(yàn)。
[0122] 在本發(fā)明的一個(gè)方面,某些或全部的方法步驟可W實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。如本文所用,術(shù)語(yǔ) "自動(dòng)化"是指計(jì)算機(jī)控制。在一個(gè)實(shí)施方式中,不同的巧光發(fā)射檢測(cè)和相關(guān)步驟是自動(dòng)化 的,并且由該方法獲得的結(jié)果信息自動(dòng)化地用于填充數(shù)據(jù)庫(kù)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,該方 法的其他步驟,例如菌落的檢測(cè)和/或探測(cè),也可W自動(dòng)化。實(shí)現(xiàn)該方法步驟的自動(dòng)化不僅 允許更多樣品進(jìn)行更快速的試驗(yàn),而且減低了處理可能含有有害的和/或有傳染性的微生 物的樣品時(shí)人為誤差所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)W及減低了污染樣品和/或?qū)⒉僮髡弑┞队跇悠返臋C(jī) 會(huì)。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明設(shè)及用于在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)和/或鑒定微生物的 系統(tǒng),該系統(tǒng)包括分光光度計(jì)和聚焦光學(xué)部件,例如鏡頭系統(tǒng)或顯微鏡。在其他實(shí)施方式 中,該系統(tǒng)進(jìn)一步包括用于掃描介質(zhì)表面的機(jī)械裝置,和/或用于控制介質(zhì)的環(huán)境(例如, 解育介質(zhì)的環(huán)境)的機(jī)械裝置。
[0123] 本發(fā)明的一方面設(shè)及在固體或半固體介質(zhì)上檢測(cè)菌落。任選地,檢測(cè)之后是鑒定 /表征菌落中的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中,對(duì)放置樣品的介質(zhì)進(jìn)行手動(dòng)掃描W確定菌落 的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中,可W用肉眼對(duì)菌落進(jìn)行視覺(jué)上的檢測(cè)。在其他實(shí)施方式中,可 W使用顯微鏡對(duì)菌落進(jìn)行檢測(cè)。例如,可W在顯微鏡下觀察介質(zhì),同時(shí)在顯微鏡物鏡下用手 移動(dòng)位于顯微鏡載物臺(tái)上的介質(zhì)W掃描介質(zhì)部分,來(lái)確定菌落的存在。介質(zhì)的移動(dòng)可W通 過(guò)操作介質(zhì)本身(例如,移動(dòng)含有介質(zhì)的平板)或者移動(dòng)載有介質(zhì)的顯微鏡載物臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)。 在其他實(shí)施方式中,自動(dòng)進(jìn)行掃描。在一個(gè)實(shí)施方式中,動(dòng)力顯微鏡載物臺(tái)可W按照程序在 物鏡下W跨介質(zhì)表面的捜索模式移動(dòng)介質(zhì),W至介質(zhì)的各個(gè)部分可W依次被觀察到。在另 一個(gè)實(shí)施方式中,當(dāng)集中光束例如激光掃描介質(zhì)并且發(fā)射出的光被成像或非成像檢測(cè)器檢 測(cè)時(shí),介質(zhì)保持靜止。在一個(gè)實(shí)施方式中,介質(zhì)可W分割為對(duì)應(yīng)激發(fā)光束的尺度的相等的部 分(例如,約100、250、500、或1000 ^1112或更多),顯微鏡載物臺(tái)可^被逐步推進(jìn),使得每個(gè) 部分位于物鏡下W便探測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,可W在大范圍菌落內(nèi)觀察介質(zhì)(例如,整 個(gè)平板或其大部分(例如,一半、=分之一、四分之一、十分之一或更?。?。在任一個(gè)實(shí)施方 式中,基于從介質(zhì)掃描創(chuàng)建的地圖,可W對(duì)菌落的位置進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中,顯微 鏡載物臺(tái)可W程控為依次移動(dòng)到每個(gè)檢測(cè)的菌落上,獲得每個(gè)菌落的IF光譜。在一個(gè)實(shí)施 方式中,手動(dòng)或自動(dòng)的掃描可W按照固定的間隔進(jìn)行重復(fù)(例如,每0. 5、1、2、3、4、5、6、8、 10或12小時(shí)或更多)W監(jiān)測(cè)菌落的出現(xiàn)和/或生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,可W使 用可見(jiàn)光掃描介質(zhì)來(lái)監(jiān)測(cè)菌落,例如,尺寸大到足W在顯微鏡下可看見(jiàn)的菌落。在另一個(gè)實(shí) 施方式中,照射介質(zhì)W使得檢測(cè)菌落的內(nèi)在特性(例如,I巧。超過(guò)介質(zhì)本底水平的IF峰表 明了菌落的存在。例如,介質(zhì)的巧光地圖可W通過(guò)比如使用掃描激發(fā)光束(例如激光)和 單一的、非成像檢測(cè)器來(lái)構(gòu)建。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用圖像捕獲/采集裝置(例如,照 相機(jī)或掃描儀,比如CCD線陣掃描儀、CCD線掃描照相機(jī)、CCD 2D列陣照相機(jī)、激光掃描照相 機(jī)或其他裝置)的大面積成像可^如胖003/022999和美國(guó)專利號(hào)5,912,115、6,153,400、和 6, 251,624所描述的使用。
[0124] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,所述檢測(cè)方法還可W用于檢測(cè)樣品中微生物的存 在,包括或不包括待檢測(cè)微生物的鑒定。在某些實(shí)施方式中,檢測(cè)方法可W用于監(jiān)測(cè)樣品的 微生物污染,例如,食品、藥品、飲用水,等等。在一個(gè)實(shí)施方式中,該方法可W重復(fù)的方式執(zhí) 行,W持續(xù)監(jiān)測(cè)污染,例如,每月一次、每周一次、每天一次、每小時(shí)一次、或任何其他時(shí)間類 型。在另一個(gè)實(shí)施方式中,樣品可W按照需要進(jìn)行試驗(yàn),例如,當(dāng)懷疑污染或需要證實(shí)污染 不存在的時(shí)候。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,檢測(cè)方法可W用于尋找在臨床樣品中微生物的存 化例如,從傷口或血液培養(yǎng)物中。例如,樣品可W在特定時(shí)間點(diǎn)從血液培養(yǎng)物中移出,并且 在樣品上執(zhí)行該檢測(cè)方法,W確定是否血液培養(yǎng)物呈陽(yáng)性。在一個(gè)實(shí)施方式中,可W在培 養(yǎng)物解育之后的規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)采集樣品,例如解育后24小時(shí),W測(cè)定血液培養(yǎng)物是否呈陽(yáng) 性。在另一個(gè)實(shí)施方式中,樣品可W有規(guī)律地從血液培養(yǎng)物中采集,例如,每12、6、4、2、1或 0. 5小時(shí),W在可檢測(cè)陽(yáng)性的短時(shí)間內(nèi)鑒定陽(yáng)性血液培養(yǎng)物。在檢測(cè)方法的某些實(shí)施方式 中,檢測(cè)步驟后面可W任選地跟隨本文所述的鑒定/表征方法。在其他實(shí)施方式中,檢測(cè)方 法部分地或全部地為自動(dòng)化,特別是對(duì)于包括重復(fù)監(jiān)測(cè)樣品的實(shí)施方式。
[0125] 在某些實(shí)施方式中,本發(fā)明的方法可W對(duì)動(dòng)物或植物細(xì)胞進(jìn)行,而不是微生物。特 別的,可W使用本文公開的技術(shù)檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、表征、和/或鑒定能夠W集落、叢集(clump)或 其他=維結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)或在=維基質(zhì)上生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞(例如,哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲的細(xì)胞) 或植物細(xì)胞。W =維集落生長(zhǎng)的適合的細(xì)胞的例子包括但不限于,干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、和 寶生細(xì)胞。
[01%] 本發(fā)明在下述實(shí)施例中進(jìn)一步詳述,該些實(shí)施例通過(guò)舉例說(shuō)明方式提供,而不是 用來(lái)W任何方式限制本發(fā)明。利用了本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或者W下具體描述的技術(shù)。 實(shí)施例
[0127] 實(shí)施例1.從平板和膜上的菌落獲得光譜
[0128] 進(jìn)行試驗(yàn),W測(cè)定是否可W在具有或不具有黑膜的血瓊脂平板炬AP ;具有5%綿 羊血的膜蛋白酶大豆瓊脂)上直接獲得菌落的有用的光譜(表1)。大腸桿菌巧0、金黃 色葡萄球菌(SA)、糞腸球菌巧巧、和銅綠假單胞菌(PA)的菌落如表2所示進(jìn)行生長(zhǎng),通過(guò) 借助光纖適配器禪合到Fluorolog3光譜儀(Horiba Jobin Yvon,Edison NJ)和PMT檢 測(cè)器的UV顯微鏡(10X物鏡)進(jìn)行采集光譜。通過(guò)W下采集ffiM;激發(fā)波長(zhǎng)范圍巧X)= 260-550皿,和發(fā)射波長(zhǎng)范圍(Em) = 280-600皿,每5皿具有狹縫寬度=5皿。在標(biāo)明的 地方,通過(guò)在發(fā)射路徑上放置1mm的小孔,使得探測(cè)區(qū)域變窄,該導(dǎo)致觀察到的區(qū)域約為 0.1mm。沒(méi)有該小孔時(shí),投射在菌落上的激發(fā)圈和發(fā)射圈的直徑等于約1mm。包含在每個(gè)試 驗(yàn)運(yùn)行中的樣品顯示在表2中。
[0129] 表 1
[0130]
【權(quán)利要求】
1. 一種在固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)上表征和/或鑒定微生物的方法,該方法包括: (a) 在固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)上探測(cè)一個(gè)或多個(gè)菌落,以生成所述菌落中微生物特有 的內(nèi)熒光(IF)測(cè)量結(jié)果;和 (b) 基于內(nèi)熒光(IF)測(cè)量結(jié)果表征和/或鑒定所述菌落中的微生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述菌落是具有小于50 y m的直徑的微菌落。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,在探測(cè)步驟(a)之前,使已知含有或疑似含有微 生物的樣品在所述固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)上生長(zhǎng),以生成至少一個(gè)菌落。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述探測(cè)步驟是非侵入性的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述微生物被表征到一個(gè)或多個(gè)分類模型,所述 分類模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組、功能組、和天然內(nèi)熒光組組成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述微生物被鑒定到屬級(jí)別、種級(jí)別、或菌株級(jí) 別。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述IF測(cè)量結(jié)果通過(guò)光譜法產(chǎn)生,并且所述光譜 法包括測(cè)定激發(fā)一發(fā)射矩陣(EEM)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中將所述EHM與已知微生物的EHM的數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中所述EEM包括至少2個(gè)不同的波長(zhǎng)對(duì)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中所述EEM使用多變量分析進(jìn)行比較。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,所述方法還包括添加鑒定劑到所述固體或半固體生 長(zhǎng)介質(zhì)或樣品中,并且其中所述鑒定部分地基于所述鑒定劑在所述菌落或從所述菌落回收 的微生物中的存在和/或數(shù)量。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中所述鑒定劑是親和配體、抗體或其片段、核酸探 針、抗生素、適體、肽模擬物、噬菌體來(lái)源的結(jié)合蛋白、凝集素、宿主防御肽、細(xì)菌素、噬菌體、 染料,或其任何組合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)包括一種或多種對(duì) 所述微生物的生長(zhǎng)有用的營(yíng)養(yǎng)素以及一種或多種添加劑,其中所述一種或多種添加劑增強(qiáng) 在所述固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)上的所述微生物菌落的所述內(nèi)熒光測(cè)量結(jié)果。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中所述一種或多種添加劑選自由以下組成的組: 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、肉類和蔬菜提取物、糖源、緩沖劑、復(fù)蘇劑、生長(zhǎng)因子、酶輔因子、 礦物鹽、金屬補(bǔ)充物、螯合劑、光敏化劑、猝滅劑、還原劑、氧化劑、洗滌劑、表面活性劑、消毒 劑、選擇劑和代謝抑制劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中所述還原劑是還原化合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中探測(cè)菌落包括測(cè)量落射熒光。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中探測(cè)菌落包括測(cè)量反射光。
18. -種檢測(cè)樣品中微生物的存在的方法,該方法包括: (a) 獲得已知含有或可能含有微生物的樣品; (b) 使樣品中存在的任何微生物在固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)上生長(zhǎng);和 (c) 通過(guò)對(duì)所述固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)進(jìn)行逐點(diǎn)掃描以生成內(nèi)熒光(IF)測(cè)量結(jié)果,定 位存在于所述固體或半固體生長(zhǎng)介質(zhì)上的任何菌落; 其中,按生成的測(cè)量結(jié)果所定位的一個(gè)或多個(gè)菌落的存在表明在樣品中存在微生物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中所述IF測(cè)量結(jié)果通過(guò)光譜法產(chǎn)生,并且所述光 譜法包括測(cè)定激發(fā)一發(fā)射矩陣(EEM)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法,其中所述EEM包括至少2個(gè)不同的波長(zhǎng)對(duì)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104502317SQ201410809237
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月16日
【發(fā)明者】約翰·沃爾什, 瓊斯·海曼, 瑟曼·索普 申請(qǐng)人:生物梅里埃有限公司