一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基于石墨烯家族人工模擬酶對雙氧水的催化作用以及探針分子刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的結(jié)合作用，構(gòu)建了以人工模擬酶代替天然過氧化物酶的方法靈敏檢測腫瘤細(xì)胞表面的糖基表達(dá)。發(fā)明的人工模擬酶由石墨烯、鐵卟啉及金納米棒構(gòu)成，三重復(fù)合物之間的協(xié)同作用大大增強(qiáng)了其催化活性。利用靜電吸附作用在人工模擬酶表面固定探針分子刀豆蛋白，其和細(xì)胞表面糖基的特異性結(jié)合作用可以捕獲腫瘤細(xì)胞。根據(jù)人工模擬酶對底液3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和雙氧水催化信號的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面糖基的檢測。本發(fā)明通過簡單方法合成新型人工模擬酶，與辣根過氧化物酶等天然類過氧化物酶相比，穩(wěn)定性提高，催化活性大大增強(qiáng)，提高了檢測的靈敏度。
【專利說明】一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型三重人工模擬酶的合成及以其作為催化劑的腫瘤細(xì)胞表面糖基檢測方法的構(gòu)建。

【背景技術(shù)】
[0002]幾乎所有真核細(xì)胞的表面都含有豐富的聚糖。糖基的功能復(fù)雜而多樣，參與了絕大部分真核生物的生命過程，與某些疾病尤其是腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。細(xì)胞表面的糖基作為細(xì)胞信息功能的重要承擔(dān)者，不僅是酶、凝集素、細(xì)菌等的識別分子，同時(shí)影響著細(xì)胞之間的識別、聯(lián)絡(luò)以及信號傳導(dǎo)等過程。因而可以通過研究癌細(xì)胞表面的糖基在細(xì)胞分化時(shí)的作用為癌細(xì)胞的某些惡性行為提供有效的分子機(jī)制。糖基化的改變不僅能夠?yàn)榘┌Y提供行之有效的檢測和治療方法，而且還能作為預(yù)后性癥狀的指示。因而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面聚糖的原位、實(shí)時(shí)監(jiān)測能夠?yàn)樯钊肓私馓腔淖兓诩?xì)胞的點(diǎn)附、遷移及惡性腫瘤的形成中的作用，對某些疾病尤其是癌癥的早期診斷和研究具有非常重要的臨床意義。
[0003]近年來發(fā)現(xiàn)，某些納米材料具有與天然酶類似的催化活性，作為人工模擬酶引起了人們的極大興趣。例如最初發(fā)現(xiàn)的四氧化三鐵納米粒子具有與辣根過氧化酶(HRP)相似的催化活性，能夠催化酶底物如3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等與雙氧水發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成藍(lán)色的氧化產(chǎn)物。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，很多納米材料均具有模擬酶活性，包括過渡金屬納米材料、貴金屬納米材料、碳納米材料等。與天然酶相比，納米材料具有穩(wěn)定性高、催化活性高及廉價(jià)易得等優(yōu)點(diǎn)，特別是避免了天然酶的不穩(wěn)定和易變性特征，增加了其在過程催化和酶促動力學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的前景，因而這些具有模擬酶活性的納米材料在分析化學(xué)中具有重要的意義。
[0004]本專利創(chuàng)新性地制備了一種基于石墨烯、鐵卩卜啉及金納米棒的三重納米復(fù)合物，制備的三重納米復(fù)合物作為一種新型人工模擬酶，具有極佳的類過氧化物酶催化性質(zhì)，且其表面帶有大量正電荷，有利于探針刀豆蛋白的修飾。進(jìn)一步結(jié)合刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的親合作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面糖基的檢測。通過比較不同細(xì)胞作用下人工模擬酶對底物TMB與雙氧水的催化反應(yīng)生成藍(lán)色的氧化產(chǎn)物的顏色的深淺，可評估細(xì)胞表面糖基的表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)合成基于石墨烯、鐵卟啉及金納米棒的三重納米材料人工模擬酶，基于此人工模擬酶對底液3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺和雙氧水的催化作用以及探針分子刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的結(jié)合作用，構(gòu)建了以人工模擬酶代替天然過氧化物酶的方法靈敏檢測腫瘤細(xì)胞表面的糖基表達(dá)。石墨烯家族類過氧化物酶由石墨烯、鐵卟啉及金納米棒構(gòu)成，三重復(fù)合物之間的協(xié)同作用大大增強(qiáng)了此人工模擬酶的催化活性。本發(fā)明進(jìn)一步利用靜電吸附作用在人工模擬酶表面固定探針分子刀豆蛋白，利用刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的特異性結(jié)合作用，可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞。微孔板上首先固定一層刀豆蛋白探針分子，然后通過三明治夾心結(jié)構(gòu)結(jié)合腫瘤細(xì)胞及表面修飾刀豆蛋白的人工模擬酶材料。根據(jù)人工模擬酶對底液3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺和雙氧水催化信號的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面糖基的檢測。本發(fā)明通過簡單方法合成新型人工模擬酶，與辣根過氧化物酶等天然類過氧化物酶相比，穩(wěn)定性提高，催化活性大大增強(qiáng)，提高了檢測的靈敏度。
[0006]本方法所用儀器裝置為:LB 942微孔板(berthold, Germany) ;DF_101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；pHS-25型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；BS124S電子天平(北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱。
[0007]所用試劑為:羧基化修飾的石墨烯分散液(南京先豐納米材料科技有限公司)；NaBH4及抗壞血酸(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；1-(3_ 二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)及刀豆蛋白均購自Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水均為二次蒸餾水。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為三重人工模擬酶的透射電鏡表征圖；
圖2為以三重人工模擬酶為催化劑檢測細(xì)胞表面糖基過程的示意圖；
圖3為三重人工模擬酶為催化劑與傳統(tǒng)人工模擬酶的催化性能比較，(a)為空白對照，(b)為金納米棒、鐵卟啉及石墨烯的混合液，(C)為發(fā)明前的雙重人工模擬酶，(e)為本發(fā)明所合成的三重人工模擬酶。
[0009]圖4為三重人工模擬酶為催化劑檢測細(xì)胞表面糖基。

【具體實(shí)施方式】
[0010]以下為實(shí)施本發(fā)明的具體示例，其作用在于進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，使閱讀者更容易理解，但不構(gòu)成對本發(fā)明要求的保護(hù)范圍的限定或限制。
[0011]實(shí)施例一三重人工模擬酶的制備
10 g石墨烯(GO)溶解于100 mL干燥的四頸瓶中，加入40 mL超純水。攪拌超聲30min后,加入60 VL氨水溶液和10 mg鐵卩卜啉(hemin),接著加入1PL聯(lián)氨溶液。上述混合液水浴中加熱到60 °C ,保持4 ho產(chǎn)物經(jīng)10000 rpm離心25 min后水洗數(shù)次,經(jīng)真空干燥后得到雙重人工模擬酶(H-RG0)。
[0012]三重人工模擬酶(H-RGO-Au)在H-RGO的基礎(chǔ)上通過NaBH4及抗壞血酸存在下HAuCl4的還原制得。首先制備金納米棒的種子溶液，將I mL 0.12 mM HAuCl4和I mL 0.048M CTAB溶液混合，在不斷攪拌中加入0.12 mL新鮮配制的2.4 mM NaBH4。此時(shí)溶液顏色由黃色變?yōu)樽攸S色。種子溶液在使用前放置在27 0C環(huán)境中2 h。
[0013]生長液的制備:將50 mL 0.2 mM HAuCl4和50 mL 0.048 M十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液混合，然后于室溫條件下溫柔加入2.5 mL 0.96 mM AgNO3溶液和3.4 mgH-RGO0之后，加入0.7 mL 0.0lM抗壞血酸，此時(shí)溶液顏色從暗黃色變?yōu)闊o色。接著加入
0.12 mL之前配制好的種子液，于27 °C條件下反應(yīng)20 min。上述溶液被移至30 °C條件下反應(yīng)12 ho反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8500 rpm離心25 min后去除上清液,沉淀重新分散于超純水中。
[0014]實(shí)施例二刀豆蛋白連接的三重人工模擬酶(ConA-H-RGO-AuNRs)的制備因?yàn)榈抖沟鞍椎牡入婞c(diǎn)在4.5-5.5之間，而合成的三重人工模擬酶表面帶有大量正電荷，刀豆蛋白和三重人工模擬酶之間的結(jié)合可以通過靜電吸附作用完成。具體操作步驟如下:100 μι 溶于 PBS 緩沖液中的 H-RGO-AuNRs 和 100 μ? 2.0 mg mL-1 刀豆蛋白(Con A)溶液混合，室溫下攪拌1.5 h，然后10000 rpm離心20 min。之后用PBS洗滌，重新分散于200 μ? PBS 中。
[0015]實(shí)施例三細(xì)胞表面糖基的比色法檢測
如圖2所示，羧基修飾的微孔板用新鮮配制的含有30 mg mL—1 EDC和15 mg mL—1 NHS的咪唑鹽酸緩沖溶液處理30 min，加入10 μ L Con A溶液反應(yīng)12 h。用3%牛血清白蛋白(BSA)于37 °C條件下反應(yīng)30 min去除非特異性吸附。
[0016]200 μ?含有ImM Ca2+和ImM Mn2+的Κ562細(xì)胞懸濁液滴到經(jīng)上述方法處理的微孔板上，37 °C條件下孵育90 min。經(jīng)沖洗和干燥后，加入10 PL刀豆蛋白連接的三重人工模擬酶(ConA-H-RGO-AuNRs)在相同條件下繼續(xù)反應(yīng)90 min。實(shí)驗(yàn)過程中，在腫瘤細(xì)胞的存在下通過刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的特異性作用，具有催化性能的人工模擬酶引入到微孔板表面。從而催化底物TMB和雙氧水的反應(yīng),使本來無色的溶液顯藍(lán)色。
[0017]其實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
如圖3所示，傳統(tǒng)的人工模擬酶材料催化性能不高，而本發(fā)明中制備的三重人工模擬酶材料催化性能大大增加。這主要是由于三重人工模擬酶材料中石墨烯、鐵卟啉和金納米棒之間的協(xié)同增強(qiáng)作用所致。
[0018]經(jīng)腫瘤細(xì)胞作用后，合成的人工模擬酶可以催化底物TMB和雙氧水的反應(yīng)，使本來無色的溶液顯藍(lán)色。收集微孔板中催化后的溶液放置于樣品管中，可明顯觀察到溶液顯藍(lán)色，而作為對照的未經(jīng)細(xì)胞作用的微孔板中的溶液仍然呈無色，如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建，其特征在于:利用靜電吸附作用在人工模擬酶表面固定探針分子刀豆蛋白，利用刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的特異性結(jié)合作用，可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞；電極上首先固定一層刀豆蛋白探針分子，然后通過三明治夾心結(jié)構(gòu)結(jié)合腫瘤細(xì)胞及表面修飾刀豆蛋白的人工模擬酶材料；根據(jù)人工模擬酶對底液3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺和雙氧水電化學(xué)催化信號的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面糖基以及腫瘤細(xì)胞的定量檢測。
2.按照權(quán)利要求1所述一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建，其特征在于新型三重人工模擬酶的構(gòu)建:合成方法中引入石墨烯、鐵卟啉及金納米棒，構(gòu)建三重人工模擬酶。
3.按照權(quán)利要求1所述一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建，其特征在于以三重人工模擬酶為催化劑:利用靜電吸附作用在人工模擬酶表面固定探針分子刀豆蛋白，利用刀豆蛋白和細(xì)胞表面糖基的特異性結(jié)合作用，在微孔板上構(gòu)建刀豆蛋白/腫瘤細(xì)胞/刀豆蛋白修飾的人工模擬酶材料的三明治夾心結(jié)構(gòu)，根據(jù)人工模擬酶對底液3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺和雙氧水催化信號的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面糖基的檢測。
4.按照權(quán)利要求1所述一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建，其特征在于對催化信號的檢測，催化劑為三重人工模擬酶，催化底物為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺和雙氧水。
5.按照權(quán)利要求1所述一種新型人工模擬酶的合成及對糖基檢測方法的構(gòu)建，其特征在于利用新型三重人工模擬酶的強(qiáng)催化作用和高穩(wěn)定性，提高檢測性能。
【文檔編號】G01N33/68GK104459154SQ201410744292
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】劉靜, 周宏 , 張書圣 申請人:臨沂大學(xué)