一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于膠體金免疫層析技術(shù)，采用競爭法檢測原理，以精子頂體蛋白為檢測標(biāo)志物，將精液稀釋于緩沖液中，使精子頂體蛋白從精子細胞中釋放至緩沖液中，再與免疫層析試紙條反應(yīng)，得到檢測結(jié)果，具有特異性更高的優(yōu)勢，避免了在檢測臨界值狀態(tài)下檢測線若隱若現(xiàn)，結(jié)果不易判讀的缺點。
【專利說明】一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種精子濃度檢測方法，具體是一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子 濃度快速檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)的基本原理是將已知的特異性抗原或抗體固定于硝 酸纖維素膜上某一區(qū)帶作為檢測帶，在樣品區(qū)滴加待測樣品后，借助毛細作用，待測樣品泳 動至膠體金膜，膠體金膜上的金標(biāo)復(fù)合物溶解，并與待測樣品進行抗原抗體反應(yīng)，形成復(fù)合 物，繼續(xù)泳動至包被膜的檢測區(qū)；帶有膠體金標(biāo)記的復(fù)合物被檢測區(qū)抗原或抗體捕獲，呈現(xiàn) 紅色條帶。若待測樣品中沒有待測抗原或抗體，則不發(fā)生結(jié)合，即不顯色。在硝酸纖維素膜 檢測區(qū)附近一般再固定上針對金標(biāo)結(jié)合物相應(yīng)的抗原或抗體作為質(zhì)控帶，無論樣品中有無 待測物，質(zhì)控線都應(yīng)顯示，若沒有顯示，則檢測失敗。整個過程一般在15分鐘內(nèi)完成，操作 簡單、快速，且不需任何儀器。
[0003] 與常規(guī)的檢測方法相比，層析技術(shù)具有操作簡便、不需其它任何儀器設(shè)備，無需專 業(yè)人員，攜帶方便，可隨時隨地進行。單個測試條成本極低，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。穩(wěn) 定性好，可長期保存的優(yōu)勢。但是存在定量問題和靈敏度問題的缺陷。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中檢測精子濃度的方法，主要有經(jīng)典的顯微計數(shù)法，需借助儀器設(shè)備以 及專業(yè)的操作人員才可以進行；比色法，特異性低，且色差會影響判讀結(jié)果；免疫層析雙抗 體夾心法，在檢測臨界值狀態(tài)下檢測線若隱若現(xiàn)，結(jié)果不易判讀。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種精子濃度快速檢測方法，是基于膠體金免疫層析技術(shù)，采用競 爭法檢測原理，定性檢測經(jīng)過預(yù)處理后的精液樣本中的ACRV1。
[0006] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0007] -種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，以精子頂體蛋白為檢測 標(biāo)志物，將精液稀釋于緩沖液中，使精子頂體蛋白從精子細胞中釋放至緩沖液中，再與免疫 層析試紙條反應(yīng)，得到檢測結(jié)果。
[0008] 進一步的，所述待測精液與緩沖液的體積比為1:3-5。
[0009] 進一步的，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述緩沖液中含有表面活性劑，所述表面 活性劑為聚乙二醇辛基苯基醚，所述表面活性劑與緩沖液的質(zhì)量比為1:80-120。
[0010] 進一步的，所述免疫層析試紙條包括樣品墊、膠體金膜、包被膜、吸收墊、塑料板， 所述樣品墊的尾端位于膠體金膜首端的上面，所述膠體金膜的尾端位于包被膜首端的上 面，所述包被膜的尾端位于吸收墊首端的下面，所述塑料板位于層析試紙的下面；所述包被 膜上包被檢測帶T和質(zhì)控線C，所述檢測帶T靠近膠體金膜一端，所述質(zhì)控線C靠近吸收墊 一端。
[0011] 進一步的，所述檢測線T處包被由大腸桿菌重組表達的ACRV1蛋白，包被量為 0? 6-0. 1/cm，所述ACRV1 蛋白濃度為 100-500i!g/m。
[0012] 進一步的，所述質(zhì)控線C處包被抗小鼠IgG抗體，包被量為0. 6-0. 8li1/cm，所述抗 小鼠IgG抗體濃度為500-1000iig/ml。
[0013] 進一步的，所述膠體金膜為玻璃纖維膜，膜上負載金標(biāo)ACRV1單克隆抗體。
[0014] 進一步的，所述金標(biāo)ACRV1單克隆抗體的制備方法為：在膠體金溶液中加入金標(biāo) ACRV1單克隆抗體，混勻，靜置5min，加入牛血清白蛋白溶液，混勻，靜置5min;高速離心收 集沉淀，將沉淀用緩沖液定容至原膠體金溶液體積的1/10,得到金標(biāo)ACRV1單克隆抗體。
[0015] 進一步的，所述膠體金溶液中按照30iig/ml的比例加入ACRV1抗體。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明首次采用免疫膠體金競爭 法原理檢測精子濃度，與比色法檢測原理相比，特異性更高。與雙抗體夾心法原理相比，通 過對比檢測線與質(zhì)控線條帶顏色的強弱進行結(jié)果判定，避免了在檢測臨界值狀態(tài)下檢測線 若隱若現(xiàn)，結(jié)果不易判讀的缺點。
[0017] 結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實施方式】后，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清 楚。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1本發(fā)明的用于檢測精子濃度的膠體金免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)圖。

【具體實施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下將結(jié)合附圖和實施例， 對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0020] 本發(fā)明以精子頂體蛋白為檢測標(biāo)志物，所述精子頂體蛋白10(AcrosomalProtein SP-10)，又名頂體泡蛋白1(Acrosomalvesicleprotein1，ACRV1)，是一種在成熟精子的 頂體特異性表達的蛋白，該蛋白在幾乎所有人類精子樣本中都能被檢測到，且表達量穩(wěn) 定。在較溫和的條件下，即可與精子細胞發(fā)生解離，以可溶狀態(tài)存在于溶液中，是一種理想 的檢測精子濃度的免疫診斷標(biāo)志物。本發(fā)明將固定體積的精液稀釋于固定體積的含表面活 性劑的緩沖液中進行預(yù)處理，使ACRV1蛋白從精子細胞中充分釋放至緩沖液中，與層析試 紙條反應(yīng)，從而達到定性檢測精子濃度的目的，應(yīng)用于優(yōu)生優(yōu)育領(lǐng)域。
[0021] 所述待測精液與緩沖液的體積比為1:3-5,優(yōu)選為1:4,所述緩沖液選用磷酸鹽緩 沖液，所述緩沖液中含有表面活性劑TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚），所述表面活性 劑與緩沖液的質(zhì)量比為1:80-120,優(yōu)選為1:100。
[0022] 本發(fā)明依托層析試紙進行檢測，如圖1所示，所述層析試紙包括樣品墊1、膠體金 膜2、包被膜3、吸收墊4、塑料板5組成，所述樣品墊的尾端位于膠體金膜首端的上面，所述 膠體金膜的尾端位于包被膜首端的上面，所述包被膜的尾端位于吸收墊首端的下面，所述 塑料板位于層析試紙的下面，用于支撐整個層析試紙；所述包被膜上包被檢測帶T6和質(zhì)控 線C7，所述檢測帶T靠近膠體金膜一端，所述質(zhì)控線C靠近吸收墊一端。圖中箭頭方向為液 體層析方向。
[0023] 所述樣品墊為吸水紙；所述膠體金膜為玻璃纖維膜，膜上負載金標(biāo)ACRV1單克隆 抗體，為流動帶；所述包被膜為硝酸纖維反應(yīng)膜，所述檢測線T處包被由大腸桿菌重組表 達的ACRV1蛋白，包被量為0. 6-0. 8iil/cm，所述ACRV1蛋白濃度為100-500iig/ml;所述 質(zhì)控線C處包被抗小鼠IgG抗體，包被量為0. 6-0. 8iU/cm，所述抗小鼠IgG抗體濃度為 500-1000iig/ml;所述吸收墊為吸水紙。
[0024] 本發(fā)明的金標(biāo)ACRV1單克隆抗體的制備方法具體為：在膠體金溶液中按照30yg/ ml的比例加入ACRV1單克隆抗體，即每1000mL膠體金溶液需加入重量為30mg的ACRV1單 克隆抗體，混勻，靜置5分鐘，然后加入終體積為1 %的牛血清白蛋白（BSA)溶液，混勻，靜置 5分鐘；高速離心收集沉淀，將沉淀用緩沖液定容至原膠體金溶液體積的1/10。
[0025] 將制備好的金標(biāo)ACRV1單克隆抗體通過噴金儀以5-10iiL/cm的量均勻噴淋至玻 璃纖維素上，干燥后即得膠體金膜。
[0026] 檢測時，將待測樣本滴加到樣品墊1上，通過層析作用，待測樣本中的ACRV1與膠 體金膜2上負載的金標(biāo)ACRV1單克隆抗體結(jié)合，結(jié)合物層析到達包被膜3沿硝酸纖維素膜 移動，與檢測線T上的重組ACRV1蛋白結(jié)合，出現(xiàn)紅色反應(yīng)線。
[0027] 當(dāng)待測樣本中ACRV1濃度高時，金標(biāo)ACRV1單克隆抗體上的抗原識別位點大部分 或全部被封閉，結(jié)合物層析到達檢測線T時，將沒有或有少部分的金標(biāo)ACRV1單克隆抗體與 檢測線T上的重組ACRV1蛋白結(jié)合，因此在檢測帶T處不會出現(xiàn)條帶或出現(xiàn)顏色較弱的條 帶。
[0028] 當(dāng)待測樣本中ACRV1濃度低時，金標(biāo)ACRV1單克隆抗體上的抗原識別位點只有小 部分被封閉，結(jié)合物層析到達檢測線T時，將與檢測線T上的重組ACRV1蛋白結(jié)合，出現(xiàn)較 深紅色條帶。
[0029] 無論待測樣本中ACRV1濃度高或低，當(dāng)結(jié)合物繼續(xù)層析至包被有抗小鼠IgG抗體 的質(zhì)控線C時，均會出現(xiàn)一條紅色條帶。如果檢測線T沒有顯色，或顯色弱于質(zhì)控線C，或顯 色與質(zhì)控線C顏色相近時，則提示陽性結(jié)果，說明被測者精子濃度達到正常標(biāo)準(zhǔn)。如果檢測 線T顏色深于質(zhì)控線C，則提示陰性結(jié)果，說明被測者精子濃度未達到正常標(biāo)準(zhǔn)。如果質(zhì)控 線C不顯色，無論檢測線T顯色與否，說明產(chǎn)品自身或操作過程存在問題，該次檢測結(jié)果無 效。檢驗結(jié)果的解釋如下表所示，質(zhì)控線C顯色時，檢測線T顯色越弱，說明精子濃度越高。 若C線沒有顯色，說明檢測失敗或產(chǎn)品失效。
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其特征在于：以精子頂體 蛋白為檢測標(biāo)志物，將精液稀釋于緩沖液中，使精子頂體蛋白從精子細胞中釋放至緩沖液 中，再與免疫層析試紙條反應(yīng)，得到檢測結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述待測精液與緩沖液的體積比為1:3-5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述緩沖液中含有表面活性劑，所述表面活性劑為 聚乙二醇辛基苯基醚，所述表面活性劑與緩沖液的質(zhì)量比為1:80-120。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述免疫層析試紙條包括樣品墊、膠體金膜、包被膜、吸收墊、塑料板，所述樣品 墊的尾端位于膠體金膜首端的上面，所述膠體金膜的尾端位于包被膜首端的上面，所述包 被膜的尾端位于吸收墊首端的下面，所述塑料板位于層析試紙的下面；所述包被膜上包被 檢測帶T和質(zhì)控線C，所述檢測帶T靠近膠體金膜一端，所述質(zhì)控線C靠近吸收墊一端。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述檢測線T處包被由大腸桿菌重組表達的ACRV1蛋白，包被量為0. 6-0. 8W/ cm，所述ACRV1蛋白濃度為100-500l^g/m。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述質(zhì)控線C處包被抗小鼠 IgG抗體，包被量為0. 6-0. 8Ml/cm，所述抗小鼠 IgG 抗體濃度為500-1000l^g/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述膠體金膜為玻璃纖維膜，膜上負載金標(biāo)ACRV1單克隆抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述金標(biāo)ACRV1單克隆抗體的制備方法為：在膠體金溶液中加入金標(biāo)ACRV1單 克隆抗體，混勻，靜置5min，加入牛血清白蛋白溶液，混勻，靜置5min ;高速離心收集沉淀， 將沉淀用緩沖液定容至原膠體金溶液體積的1/10,得到金標(biāo)ACRV1單克隆抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的精子濃度快速檢測方法，其 特征在于：所述膠體金溶液中按照3〇Mg/ml的比例加入ACRV1抗體。
【文檔編號】G01N33/68GK104459152SQ201410728892
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】黃玉香, 高宏, 吳松潔, 劉培方, 李環(huán)宇 申請人:青島拓新生物科技有限公司