梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專利摘要】梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒及其制備方法，涉及梅毒螺旋體。試劑盒設(shè)有外包裝盒、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人γ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶、重組抗原包被微孔板。先制備梅毒螺旋體特異性重組抗原、重組抗原包被微孔板、抗人γ鏈單克隆抗體、抗人μ鏈單克隆抗體、抗人Ig單克隆抗體；標(biāo)記抗體的堿性磷酸酶，再制備發(fā)光底物、洗滌液、對(duì)照品，最后組裝梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒。
【專利說明】梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及梅毒螺旋體，尤其是涉及一種梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病，近年來在國內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，梅毒的防控已列為我國公共衛(wèi)生服務(wù)的主要任務(wù)之一。
[0003]梅毒螺旋體不能體外培養(yǎng)，而直接病原學(xué)暗視野顯微鏡檢查陽性率不高，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)包括心磷脂抗體和特異性抗體檢測(cè)，心磷脂抗體的假陽性率高，靈敏度低。而梅毒特異性抗體檢測(cè)方法包括梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)、熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(FTA-ABS)及免疫印跡法(Western-blot)等，其特異性均較高，但不能進(jìn)行高通量的檢測(cè)。
[0004]中國專利CN101881772A公開一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗(yàn)試劑盒及其制備和檢測(cè)方法，具體包括用TP重組抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封閉空白結(jié)合點(diǎn)，制成特異性TP探針-高聚分子微球；與待測(cè)標(biāo)本共培養(yǎng)捕獲TP抗體，洗滌離心除去未結(jié)合的TP抗體，再加入熒光標(biāo)記的抗人IgG或IgM抗體；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)微球的熒光強(qiáng)度，對(duì)受測(cè)抗體進(jìn)行定性或定量分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供能現(xiàn)時(shí)檢測(cè)梅毒螺旋體特異性IgG抗體、梅毒螺旋體特異性IgM抗體和梅毒螺旋體特異性總抗體的一種梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
[0006]所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒設(shè)有外包裝盒、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶、重組抗原包被微孔板；堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶、重組抗原包被微孔板設(shè)在外包裝盒內(nèi)；堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶?jī)?nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶?jī)?nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶?jī)?nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體，發(fā)光底物瓶?jī)?nèi)裝有發(fā)光底物，梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品，洗滌液瓶?jī)?nèi)裝有洗滌液。
[0007]所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I)制備梅毒螺旋體特異性重組抗原:
[0009]采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得梅毒螺旋體特異性抗原TPN17和TPN47 ；
[0010]2)制備重組抗原包被微孔板
[0011 ] 將步驟I)中的梅毒螺旋重組抗原TPN17和TPN47用包被緩沖液稀釋至20 μ g/mL,以每孔0.1mL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板,風(fēng)干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液配制的1.0%脫脂奶粉，每孔0.2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風(fēng)干、消毒，制備重組抗原包被微孔板，密封備用；
[0012]3)制備抗人Y鏈單克隆抗體
[0013]以人Y鏈為抗原免交通崗Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人Y鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0014]4)制備抗人U鏈單克隆抗體
[0015]以人μ鏈為抗原免交通崗Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人μ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0016]5)制備抗人Ig單克隆抗體
[0017]以人Ig為抗原免交通崗Balb/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù),篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0018]6)抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記
[0019]堿性磷酸酶經(jīng)過碘酸鈉活化，分別與步驟3)、4)、5)中所制備的單克隆抗體分子的-NH2偶聯(lián)，形成堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體；
[0020]7)發(fā)光底物制備
[0021]人工合成金剛烷胺類發(fā)光底物(AMPPD)及其增強(qiáng)劑，均經(jīng)無菌過濾，制備發(fā)光底物工作液；
[0022]8)洗滌液制備
[0023]洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.01 % ;
[0024]9)對(duì)照品
[0025]梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品:由非梅毒感染的健康人群血清配制而成；
[0026]梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性IgG抗體陽性血清配制而成；
[0027]梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性IgM陽性血清配制而成；
[0028]梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性總抗體陽性血清配制而成；
[0029]10)制備梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒
[0030]將堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體、發(fā)光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品分別裝入瓶?jī)?nèi)，再將堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板裝入外包裝盒，即得梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒。
[0031]在步驟10)中，所述瓶可采用聚乙烯瓶。
[0032]本發(fā)明提供了一種梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒，可用于臨床標(biāo)本中梅毒螺旋體特異性IgG抗體、梅毒螺旋體特異性IgM抗體和梅毒螺旋體特異性總抗體的高能量檢測(cè)，能準(zhǔn)確地進(jìn)梅毒感染性的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，環(huán)保無污染，具有長遠(yuǎn)的好處。
[0033]本發(fā)明采用梅毒螺旋體重組抗原TPN15、TPNl7作為梅毒診斷抗原，在同一試劑盒檢測(cè)板上,實(shí)現(xiàn)梅毒螺旋體特異性IgG抗體、IgM抗體和總抗體，可同時(shí)作為梅毒感染性的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。且本發(fā)明的產(chǎn)品不僅可以靈敏檢測(cè)出梅毒螺旋體IgG抗體、IgM抗體和總抗體，并且操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，環(huán)保無污染，具有長遠(yuǎn)的好處。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒實(shí)施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0035]以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0036]實(shí)施例1
[0037]參見圖1，所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒實(shí)施例設(shè)有外包裝盒1、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶2、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶3、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人I g單克隆抗體瓶4、發(fā)光底物瓶5、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶6、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶7、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶8、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶9、洗滌液瓶10、重組抗原包被微孔板11 ;堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶2、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶3、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶4、發(fā)光底物瓶5、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶6、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶7、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶8、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶9、洗滌液瓶10、重組抗原包被微孔板11設(shè)在外包裝盒I內(nèi)；堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶2內(nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶3內(nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶4內(nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體，發(fā)光底物瓶5內(nèi)裝有發(fā)光底物，梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶6內(nèi)裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶7內(nèi)裝有梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶8內(nèi)裝有梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶9內(nèi)裝有梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品，洗滌液瓶10內(nèi)裝有洗滌液。
[0038]所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0039](I)制備梅毒螺旋體特異性重組抗原:
[0040]采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得梅毒螺旋體特異性抗原TPN17和TPN47。
[0041](2)制備重組抗原包被微孔板
[0042]將步驟⑴中的梅毒螺旋重組抗原TPN17和TPN47用包被緩沖液稀釋至20 μ g/mL,以每孔0.1mL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板,風(fēng)干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液配制的1.0%脫脂奶粉，每孔0.2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風(fēng)干、消毒，制備重組抗原包被微孔板，密封備用。
[0043](3)制備抗人Y鏈單克隆抗體
[0044]以人Y鏈為抗原免交通崗Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人Y鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0045](4)制備抗人μ鏈單克隆抗體
[0046]以人μ鏈為抗原免交通崗Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人μ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0047](5)制備抗人Ig單克隆抗體
[0048]以人Ig為抗原免交通崗Balb/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù),篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0049](6)抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記
[0050]堿性磷酸酶經(jīng)過碘酸鈉活化，分別與步驟(3)、(4)、(5)中所制備的單克隆抗體分子的-NH2偶聯(lián)，形成堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體。
[0051](7)發(fā)光底物制備
[0052]人工合成金剛烷胺類發(fā)光底物(AMPPD)及其增強(qiáng)劑，均經(jīng)無菌過濾，制備發(fā)光底物工作液。
[0053](8)洗滌液制備
[0054]洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.01 %。
[0055](9)對(duì)照品
[0056]梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品:由非梅毒感染的健康人群血清配制而成；
[0057]梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性IgG抗體陽性血清配制而成；
[0058]梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性IgM陽性血清配制而成；
[0059]梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性總抗體陽性血清配制而成；
[0060](10)制備梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒
[0061]重組抗原包被微孔板、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體、、發(fā)光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品和外包裝盒共同組成的梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒。
[0062]步驟(10)所述堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體、發(fā)光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性總抗陽性對(duì)照品均裝在相應(yīng)的聚乙烯瓶中。
[0063]實(shí)施例2
[0064]以下給出采用梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者的臨床標(biāo)本中的梅毒螺旋體特異性抗體:
[0065]1、標(biāo)本處理:血清:靜脈血5mL,置37°C水浴30min, 3000g離心1min,上清為檢測(cè)樣品備用。
[0066]2、加樣:加100 μ L的標(biāo)本于反應(yīng)板中，同時(shí)作空白、陰性和陽性對(duì)照孔。37°C孵育Ih0
[0067]3、洗滌:37°C反應(yīng)30min后，被測(cè)定的梅毒特異性抗體與微孔板上包被的梅毒特異性重組抗原結(jié)合，洗滌分離未結(jié)合的游離成分；
[0068]4、再加入堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體(檢測(cè)梅毒螺旋體特異性IgG抗體)、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體(檢測(cè)梅毒螺旋體特異性IgM抗體)和堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體(檢測(cè)梅毒螺旋體特異性總抗體)。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶催化底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第1min測(cè)定各加樣品孔的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度單位(relative light units，RLU)。樣品的RLU與待測(cè)梅毒抗體濃度呈正相關(guān)。
[0069]實(shí)施例3
[0070]以下給出梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒的性能檢定
[0071](I)陽性標(biāo)本符合率
[0072]用梅毒特異性抗體陽性參比血清50份檢定，計(jì)算陽性符合率。
[0073](2)陰性標(biāo)本符合率
[0074]用梅毒特異性抗體陰性參比血清50份檢定，計(jì)算陰性符合率。
[0075](3)批內(nèi)差異
[0076]同一批次試劑盒,用特征性血清檢測(cè),要求CV ( 10%。
[0077](4)批間差異
[0078]不同批次試劑盒,用特征性血清檢測(cè),要求CV ( 12%。
[0079](5)干擾試驗(yàn)
[0080]用溶血、脂血和黃疸標(biāo)本各50例進(jìn)行的干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
[0081](6)交叉反應(yīng)
[0082]采用本試劑盒，進(jìn)行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(η = 50)、類風(fēng)濕病(η = 50)、免疫性肝炎(η=50)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測(cè)，觀察交叉反應(yīng)。
[0083](7)穩(wěn)定性檢測(cè)
[0084]應(yīng)用Arrhenius法則,將試劑盒放置37°C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個(gè)月。
【權(quán)利要求】
1.梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有外包裝盒、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶、重組抗原包被微孔板；堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶、重組抗原包被微孔板設(shè)在外包裝盒內(nèi)；堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶?jī)?nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶?jī)?nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶?jī)?nèi)裝有堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體，發(fā)光底物瓶?jī)?nèi)裝有發(fā)光底物，梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品，梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶?jī)?nèi)裝有梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品，洗滌液瓶?jī)?nèi)裝有洗滌液。
2.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)制備梅毒螺旋體特異性重組抗原: 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得梅毒螺旋體特異性抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47 ； 2)制備重組抗原包被微孔板 將步驟I)中的梅毒螺旋重組抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47用包被緩沖液稀釋至20 μ g/mL,以每孔0.1mL加入微孔板中，411C包被24h ;取出抗原板,風(fēng)干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液配制的1.0%脫脂奶粉，每孔0.2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風(fēng)干、消毒，制備重組抗原包被微孔板，密封備用； 3)制備抗人Y鏈單克隆抗體 以人Y鏈為抗原免交通崗Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人Y鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 4)制備抗人μ鏈單克隆抗體 以人μ鏈為抗原免交通崗Balb/C小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人μ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 5)制備抗人Ig單克隆抗體 以人Ig為抗原免交通崗Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 6)抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記 堿性磷酸酶經(jīng)過碘酸鈉活化，分別與步驟3)、4)、5)中所制備的單克隆抗體分子的-NH2偶聯(lián)，形成堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體； 7)發(fā)光底物制備 人工合成金剛烷胺類發(fā)光底物及其增強(qiáng)劑，均經(jīng)無菌過濾，制備發(fā)光底物工作液； 8)洗滌液制備 洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.01% ; 9)對(duì)照品 梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品:由非梅毒感染的健康人群血清配制而成； 梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性IgG抗體陽性血清配制而成； 梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性IgM陽性血清配制而成； 梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品:梅毒患者的特異性總抗體陽性血清配制而成； 10)制備梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒 將堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體、發(fā)光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品分別裝入瓶?jī)?nèi)，再將堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Y單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人μ單克隆抗體瓶、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人Ig單克隆抗體瓶、發(fā)光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgG抗體陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性IgM陽性對(duì)照品瓶、梅毒螺旋體特異性總抗體陽性對(duì)照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板裝入外包裝盒，即得梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒。
3.如權(quán)利要求2所述梅毒螺旋體特異性抗體高通量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟10)中，所述瓶采用聚乙烯瓶。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK104330562SQ201410629879
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】楊天賜, 劉莉莉, 張惠林, 童曼莉, 林麗蓉, 張長弓 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院, 廈門市波生生物技術(shù)有限公司