超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用。本發(fā)明利用超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球，制備獲得表面親水并富含官能團的納米微球材料。在實際使用這種基于這種超支化聚縮水甘油醚磁性微球的化學發(fā)光診斷試劑時，發(fā)現(xiàn)試劑能夠很好的抑制蛋白的非特異性吸附，抗體偶聯(lián)量也較商品化的磁性微球高出2‐3倍。在項目的性能分析中發(fā)現(xiàn)基于此種磁性微球的診斷試劑可以大大增強抗原抗體之間的反應，與商品化磁性微球試劑做對比時發(fā)現(xiàn)，靈敏度提高4‐5倍，檢測上限提高1.3倍，從而檢測范圍提高將近6.5倍。
【專利說明】超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測試劑領域，涉及超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化 學發(fā)光免疫分析中的應用。

【背景技術】
[0002] 化學發(fā)光免疫分析法是將高特異性的免疫反應分析技術，化學發(fā)光反應體系和高 度靈敏的發(fā)光測定技術相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、酶、激素和藥物等的檢測分析 技術。它是繼放射免疫分析技術、酶聯(lián)免疫分析技術、突光免疫分析技術和時間分辨突光免 疫分析技術之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術。
[0003] 化學發(fā)光免疫分析包含兩個部分，即免疫反應系統(tǒng)和化學發(fā)光系統(tǒng)。免疫反應系 統(tǒng)利用免疫反應的高特異性原理，將待檢測物從待檢測樣本復雜的物質構成中分離捕獲出 來并和特定的標記物結合；化學發(fā)光系統(tǒng)利用特定的過程使標記物參與到氧化還原反應中 去，標記物被氧化劑氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，激發(fā)態(tài)的中間體并不穩(wěn)定，很快就發(fā) 射出光子并回到基態(tài)。發(fā)射的光子被光信號計量裝置接收后，通過光電效應轉變?yōu)殡娦盘?進行后續(xù)數(shù)字處理。免疫反應系統(tǒng)構建了待測物質和標記物的關系，化學發(fā)光系統(tǒng)構建了 標記物含量和電信號的關系，兩者結合應用即可將待測物質的量轉化為電信號從而被計算 處理。
[0004] 化學發(fā)光免疫分析方法由于其具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬等優(yōu)點，日益 受到人們的青睞，在生命科學、臨床醫(yī)學以及環(huán)境、食品、藥物等領域得到廣泛應用。就化學 發(fā)光免疫分析檢測試劑本身性能而言，靈敏度和線性范圍是其中最重要的兩個性能參數(shù)。 這是因為在實際應用中越來越多的需要檢測低豐度分析物樣品，發(fā)展高靈敏的化學發(fā)光免 疫分析方法，是近年來免疫分析方法發(fā)展的重要方向。同時較寬的線性范圍的檢測結果將 給臨床檢測提供一下幫助：①疾病的不同階段（早期，中期，晚期）的準確定位，從而可以輔 助醫(yī)生制定更特異性、更針對性的治療方案；②可以對治療的結果進行及時分析，使得醫(yī)護 人員可以在早期發(fā)現(xiàn)問題并及時調整治療方案，避免給患者帶來更大的治療風險和經(jīng)濟壓 力。
[0005] 在實際的試劑盒開發(fā)過程中，最低檢測限的優(yōu)化和檢測范圍的拓寬往往是兩個矛 盾體。常規(guī)的優(yōu)化最低檢測限的方法一般都以犧牲檢測上限為代價，比如：①通過調節(jié)納米 微球粒徑來優(yōu)化試劑盒的最低檢測限，較小的粒徑將在同等質量濃度下提供較大的抗體結 合面積，從而有助于拓寬免疫分析的線性范圍。較大的粒徑將提高反應體系在低濃度被檢 出物條件下的性能，可以優(yōu)化最低檢測限，但是粒徑的增大會帶來固相載體總表面積的下 降，導致結合在載體上的抗體量下降，從而影響檢測上限；②通過相對減少抗體在固相載體 上的包被量來優(yōu)化最低檢測限，但是和上一條類似的，抗體量的減少同樣會犧牲檢測上限； ③通過增加樣本加樣量來增加體系中待分析物的相對含量從而優(yōu)化最低檢測限，但是待測 物含量提升后，在高濃度樣本的分析中檢測上限必然表現(xiàn)下降?？傊?，若是要通過只優(yōu)化一 個條件，同時優(yōu)化分析試劑在最低檢測限和檢測上限兩個指標上的表現(xiàn)，常規(guī)的方法幾乎 是無能為力的。在實際開發(fā)過程中，傳統(tǒng)的方案是從兩個作用相反的變量上同時優(yōu)化，取折 衷的效果。因此這些優(yōu)化工作必然會是非常消耗時間且起不到最佳效果的。
[0006] 磁性微球作為化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中關鍵的組分一固相載體，其本身的性質 對于免疫分析的結果會起到舉足輕重的影響。目前常用的商品化磁性微球是由聚苯乙烯外 殼和超順磁性磁流體內核構成，功能性的基團（比如：氨基、羧基等）通過共聚、接枝或者包 裹的方法引入。這種方式的磁性微球有以下兩個顯著缺陷：第一，聚苯乙烯是一種非常疏水 的材料，直接應用會不可避免的產生非特異性吸附的后果，這會導致樣本中的雜質也吸附 在微球表面，雜質的干擾不僅會增加反映的本底值，導致反應基線的波動，嚴重時甚至會造 成假陽性或者假陰性的結果，直接影響到檢測的可信度，形成誤診或者漏診；第二，無論是 上述何種方式引入的官能團，其密度都不能突破單層表面的最大理論密度，從而限制了抗 體在其上的偶聯(lián)量。
[0007] 增強信號和降低噪音是優(yōu)化化學發(fā)光免疫試劑的兩個重要步驟，降低噪音主要是 在固相載體上覆蓋一層物質，這層物質在微球上占據(jù)絕大多數(shù)位點后，可以有效的降低非 特異性吸附，但不能完全杜絕其發(fā)生。通常使用的物質為BSA蛋白，酪蛋白，明膠，但研究發(fā) 現(xiàn)這類物質的效果并不理想，同時為了尋求最佳的實驗條件，實驗摸索也需要耗費巨大的 人力和時間。增強信號主要集中在信號探針放大方面，這就要求納米粒子可以盡可能多的 負載標示物，甚至會用到例如生物素--鏈霉親和素這種放大標記的工藝方法。
[0008] 聚乙二醇（PEG)是在生物醫(yī)藥方向中使用非常廣泛的一個親水性物質，其生物相 容性以及非免疫源性的特征使得在它在很多領域作為改性材料使用，例如抗體、蛋白、核苷 酸、脂質體的修飾，聚合物和聚合物微球的表面改性等。在免疫分析中，納米粒子表面的PEG 可以有效的降低非特異性吸附，減少本底值，提高反應的靈敏度，降低假陽性和假陰性結 果。但是線性的PEG聚合物由于其結構中只在聚合物端基部分有官能團，因此整個聚合物 結構中只有一個或者兩個活性位點可供于偶聯(lián)，結合能力較弱，偶聯(lián)效率不高，這點限制了 其更廣泛的應用。
[0009] 與線性聚合物不同，超支化聚合物（支化程度至少大于等于2)在結構分支處包含 較多的官能團。超支化聚合一般有較好的溶解性，溶解后粘度較低和流動性也較好，使用上 簡單方便。再者，超支化聚合物合成方法也比較簡單，主要分成三種：第一，利用多官能團的 單體縮聚制備；第二，在已經(jīng)制備好的聚合物前驅體中進行接枝修飾，第三，利用環(huán)氧的開 環(huán)反應來制備超支化的結構。
[0010] 超支化聚縮水甘油醚是一種特殊的超支化聚合物，有著類似聚乙二醇的主鏈結 構，在支鏈結構上富含羥基，這部分羥基一方面為化學偶聯(lián)提供了大量結合位點，另一方面 又給聚合物帶來了良好的親水性能。這些結構特點使超支化聚縮水甘油醚具有大量的末端 官能團，擁有良好的生物相容性、高溶解性和高流變性。因此從增強信號和降低噪音這兩個 方面都提高試劑的性能，從使得其在生物試劑上有著卓越的應用價值。


【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁 性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種含超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球的試劑 盒。
[0013] 本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0014] 超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用。
[0015] 超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，包括以下 方法：超支化聚縮水甘油醚經(jīng)修飾后通過氨基作用包被在納米磁性微球表面形成超支化聚 縮水甘油醚修飾納米磁性微球，對超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球的羧基進行活化 后偶聯(lián)能與待測分子特異性結合的探測分子，形成了超支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復合物固相載體，將超支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復合物固相載 體和待測樣本以及標記上發(fā)光物質的能與待測分子特異性結合的捕獲分子混合反應后，形 成了超支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復合物固相載體-待測分子-捕獲分 子-發(fā)光物質的復合物，經(jīng)清洗分離出復合物，向其中加入激發(fā)物，復合物中的發(fā)光物質受 到激發(fā)產生化學發(fā)光，最后用化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光強度計算待測樣本中的目標分析物 的濃度。
[0016] 所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，所 述的納米磁性微球大小為1 μ m?10 μ m。
[0017] 所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，所 述的超支化聚縮水甘油醚由三羥甲基丙烷和縮水甘油聚合而成；所述的修飾為琥珀酰亞胺 基碳酸酯修飾。
[0018] 所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，所 述的探測分子和納米磁性微球的偶聯(lián)方式包括羧基偶聯(lián)、氨基偶聯(lián)、羥基偶聯(lián)、醛基偶聯(lián)、 氣甲基偶聯(lián)、疏基偶聯(lián)等方式。
[0019] 所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，檢 測的待測物質可以是抗原、抗體、半抗體、半抗原、小分子化學物質、金屬元素等；探測分子 為能夠與待測物質特異性結合的抗體、抗原、半抗原、半抗體、小分子等；捕獲分子是能與待 測分子或探測分子或兩者復合物特異性結合的物質。
[0020] 所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，所 述的發(fā)光物質選自包括N - (4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根過 氧化物酶，堿性磷酸酶等。
[0021] 所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用，所 述的激發(fā)物選自含有〇. 1%-1%過氧化氫的〇. lmol/L-lmol/L硝酸溶液、含有0. 1^-1% 過氧化氫的〇· lmol/L - lmol/L硫酸溶液、含有0· 1% - 1%過氧化氫的0· lmol/L - Imol/ L鹽酸溶液、含有0.5% - 5% Tween - 20的0· I - lmol/L氫氧化鈉溶液、含有0.5% - 5% Tween - 80 的 0· I - lmol/L 氫氧化鈉溶液、或含有 0· 5% - 5% TritonX - 100 的 0· I - Imol/ L氫氧化鈉溶液。
[0022] -種化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括本發(fā)明所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米 磁性微球-探測分子復合物、化學發(fā)光激發(fā)液系統(tǒng)，連接發(fā)光物質的捕獲分子。
[0023] 其中，所述的化學發(fā)光激發(fā)液系統(tǒng)包括激發(fā)液1和激發(fā)液2,激發(fā)液1選自含有 0. 1% - 1%過氧化氫的0. lmol/L - lmol/L硝酸溶液、含有0. 1% - 1%過氧化氫的0. Imol/ 1^-1111〇1/1硫酸溶液或者含有0.1(%-1(%過氧化氫的0.1111 〇1/1-1111〇1/1鹽酸溶液。激 發(fā)液2選自含有0.5% - 5% Tween - 20的0· I - lmol/L氫氧化鈉溶液、含有0.5% - 5% Tween - 80 的 0· I - lmol/L 氫氧化鈉溶液、含有 0· 5% - 5% TritonX - 100 的 0· I - lmol/L 氫氧化鈉溶液；所述的化學發(fā)光激發(fā)液系統(tǒng)加樣方法為先加入激發(fā)液1，間隔2s后，再加入 激發(fā)液2。
[0024] -種制備所述試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0025] 1)超支化聚縮水甘油醚的制備：以三羥甲基丙烷作為反應的引發(fā)劑，采用CH3OK 對TMP的羥基進行部分去質子化，去質子化部分占總部分的10%，然后將縮水甘油緩慢滴 加進入體系引發(fā)聚合，反應溫度95?KKTC，反應10?12小時；反應結束后產物溶解在甲 醇中，通過強酸型陽離子交換樹脂（AMBERJET?1500H Resin)中和；聚合物通過在丙酮中析 出，甲醇中溶解，重復兩次進行提純，最后在75?85°C的真空中干燥13?16小時，得超支 化聚縮水甘油醚；
[0026] 2)超支化聚縮水甘油醚的修飾：將超支化聚縮水甘油醚在DMF溶液中用琥珀酰亞 胺基碳酸酯（DSC)進行修飾得DSC修飾的超支化聚縮水甘油醚；
[0027] 3)超支化聚縮水甘油醚對磁性微球的修飾：向氨基磁性微球溶液中滴加上一步 制備的DSC修飾的超支化聚縮水甘油醚溶液，超支化聚縮水甘油醚進過DSC修飾后表面有 大量的琥珀酰亞胺酯（NHS酯），這部分活性酯可以與氨基磁性微球上的氨基反應，于搖床 中反應0. 5?Ih后，再加入50mM的PB緩沖液，此時多余的NHS酯發(fā)生水解，最后使用50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗，清洗過程中使用磁性分離架分離磁性微球，清洗結束后，使用 50mM PBS溶液（pH = 7. 5)重懸，因此在磁性微球表面預留下大量羧基；
[0028] 4)超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球偶聯(lián)探測分子：對上一步制備的超支化聚 縮水甘油醚修飾的磁性微球進行羧基活化，通常方法為加入1 - (3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)，其摩爾含量為羧基摩爾含量的1 - 10倍，混合均勻后震蕩反應 30分鐘，活化結束后離心使用50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗，將探測分子用IOOmM碳酸氫 鈉緩沖液（pH = 8. 0)稀釋到后，加入到磁性微球溶液中，置于200?220rpm 35?37°C搖 床上反應2. 5?3. 5h，反應結束后使用，50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗懸浮磁性微球，制 得超支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復合物固相載體；
[0029] 5)發(fā)光物質的標記：捕獲分子加入到50mM PBS緩沖液（pH = 8. 0)中，加入0· 3? lmmol/L的發(fā)光物質，混合，室溫避光反應20?30min，使用IOmM PBS緩沖液（pH = 6. 5) 透析除去未結合的發(fā)光物質，最后加入50%重蒸甘油，置于-20°C保存；
[0030] 6)配制激發(fā)液1和激發(fā)液2 :激發(fā)液1為含有0. 5%過氧化氫溶液的0. 2M的硝酸 溶液；激發(fā)液2為含有1 % Tween - 20的0. 5M氫氧化鈉溶液。
[0031] 一種制備上述試劑盒的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
[0032] 超支化聚縮水甘油醚的制備：在配有機械攪拌和微量恒流泵的三口燒瓶中，加入 0.24g三羥甲基丙烷（TMP)，作為反應的引發(fā)劑，采用3· 7M CH3OK(溶解于甲醇中）對TMP的 羥基進行部分去質子化，去質子化部分占總部分的10%，多余甲醇通過加熱蒸發(fā)除去。然 后50mL的縮水甘油緩慢滴加進入體系引發(fā)聚合，注意縮水甘油的滴加速度，滴加過快可能 會引起爆聚。反應溫度95°C，反應12小時；
[0033] 反應結束后產物溶解在甲醇中，通過強酸型陽離子交換樹脂（amberjettmi 5〇〇H Resin)中和。聚合物通過在丙酮中析出，甲醇中溶解，重復兩次進行提純。最后在80°C的 真空中干燥15小時。得超支化聚縮水甘油醚；
[0034] 超支化聚縮水甘油醚的修飾：將超支化聚縮水甘油醚溶解于二甲基甲酰胺（DMF) 中，配制成lOmg/mL的溶液，取lmL，加入20mg琥珀酰亞胺基碳酸酯（DSC)于常溫下進行反 應，得DSC修飾的超支化聚縮水甘油醚（DSC - HPG)。
[0035] 超支化聚縮水甘油醚對磁性微球的修飾：取5mg氨基磁性微球（粒徑大小為 1 μ m?10 μ m)，根據(jù)固含量5mg/ml進行換算，去除上清液保留固體物質。之后向磁性微球 溶液中滴加500 μ L的DSC - HPG溶液，于搖床中反應30min。反應結束后，向反應體系中加 入ImL 50mMPBS溶液繼續(xù)反應30min，將多余的NHS酯水解后，使用50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗三次，清洗過程中使用磁性分離架分離磁性微球，清洗結束后，使用ImL 50mM PBS 溶液（pH = 7. 5)重懸；
[0036] 超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球偶聯(lián)探測分子：對微球的羧基進行活化，活化 結束后使用500 μ L 50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗磁性微球。將探測分子用IOOmM碳酸 氫鈉緩沖液（pH = 8. 0)稀釋到lmg/mL后，加入到磁性微球溶液中，置于220rpm 37°C搖床 上反應3h。反應結束后使用400 μ L 50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗懸浮磁性微球，清洗三 次，制得超支化聚縮水甘油醚磁性微球探測分子復合物；
[0037] 發(fā)光物質的標記：捕獲分子加入到50mM PBS緩沖液（pH = 8. 0)中，加入0· 5mmol/ L的發(fā)光物質，混合，室溫避光反應20min。使用IOmM PBS緩沖液（pH = 6. 5)透析除去未 結合的發(fā)光物質，最后加入50%重蒸甘油，置于-20°C保存；
[0038] 配制激發(fā)液1和激發(fā)液2 :激發(fā)液1為含有0. 5%過氧化氫溶液的0. 2M的硝酸溶 液；激發(fā)液2為含有1% Tween - 20的0. 5M氫氧化鈉溶液。
[0039] 有益效果：
[0040] 本發(fā)明專利在化學發(fā)光免疫分析法中引入超支化聚縮水甘油醚磁性微球，利用超 支化聚縮水甘油醚的高度親水性和支化高官能團密度的特點，可同時提高化學發(fā)光免疫分 析試劑在最低檢測限和檢測上限的表現(xiàn)。具體來說，超支化聚縮水甘油醚親水性強，可以大 大地降低在檢測過程中因疏水作用而導致的非目標蛋白的非特異性吸附，能夠較大程度的 降低本底并減少噪聲，從而能夠優(yōu)化試劑的最低檢測限；支化高官能團密度的特點使得修 飾了該分子的磁性微球作為固相載體在包被抗體時，能夠提高包被量，從而拓寬檢測范圍。 另外超支化聚縮水甘油醚的親水性使得偶聯(lián)在上面的抗體能夠更好地保持其構象，從而提 高了結合抗原的能力。
[0041] 本發(fā)明專利利用超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球，制備獲得表面親水并富 含官能團的納米微球材料。在實際使用這種基于這種超支化聚縮水甘油醚磁性微球的化學 發(fā)光診斷試劑時，發(fā)現(xiàn)試劑能夠很好的抑制蛋白的非特異性吸附，抗體偶聯(lián)量也較商品化 的磁性微球高出2 - 3倍。在項目的性能分析中發(fā)現(xiàn)基于此種磁性微球的診斷試劑可以大 大增強抗原抗體之間的反應，與商品化磁性微球試劑做對比時發(fā)現(xiàn)，靈敏度提高4 -5倍，檢 測上限提高1. 3倍，從而檢測范圍提高將近6. 5倍。對于試劑的線性相關性、重復性、回收 率、穩(wěn)定性等其它性能時，分析發(fā)現(xiàn)均可以達到國標或者行標的要求，試劑性能優(yōu)越。
[0042] 本試劑的發(fā)明可以很好解決目前診斷試劑中普遍存在的非特異性吸附的問題，對 于一些線性要求很寬，靈敏度要求很高的項目，使用本試劑亦可以取得很好的效果，因此該 診斷試劑具有更高的臨床檢驗應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1本發(fā)明技術路線示意圖
[0044] 圖2hGH檢測系統(tǒng)與對比檢測系統(tǒng)之間的線性相關圖
[0045] 圖3基于超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球的hGH檢測試劑標準曲線
[0046] 圖4基于普通羧基磁性微球的hGH檢測試劑標準曲線
[0047] 圖5hGH檢測試劑不同檢驗天數(shù)下的血清檢測值
[0048] 圖6TP0_Ab檢測系統(tǒng)和對比系統(tǒng)之間的線性相關圖
[0049] 圖7基于超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球的TPO-Ab檢測試劑標準曲線
[0050] 圖8基于商品化羧基磁性微球的TPO-Ab檢測試劑標準曲線
[0051] 圖OTPO-Ab檢測試劑不同檢驗天數(shù)下的血清檢測值

【具體實施方式】
[0052] 實施例1基于超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球診斷試劑的制備方法
[0053] 超支化聚縮水甘油醚的制備
[0054] 在配有機械攪拌和微量恒流泵的三口燒瓶中，加入0. 24g三羥甲基丙烷（TMP)，作 為反應的引發(fā)劑，采用3. 7M CH3OK(溶解于甲醇中）對TMP的羥基進行部分去質子化，去質 子化部分占總部分的10%，多余甲醇通過加熱蒸發(fā)除去。然后50mL的縮水甘油緩慢滴加進 入體系引發(fā)聚合，注意縮水甘油的滴加速度，滴加過快可能會引起爆聚。反應溫度95°C，反 應12小時。
[0055] 反應結束后產物溶解在甲醇中，通過強酸型陽離子交換樹脂（amberjettmi 5〇oh Resin)中和。聚合物通過在丙酮中析出，甲醇中溶解，重復兩次進行提純。最后在80°C的 真空中干燥15小時。超支化聚縮水甘油醚為無色粘稠液體。
[0056] 超支化聚縮水甘油醚的修飾
[0057] 將超支化聚縮水甘油醚溶解于二甲基甲酰胺（DMF)中，配制成10mg/mL的溶液，取 lmL，加入20mg琥珀酰亞胺基碳酸酯（DSC)于常溫下進行反應，得DSC修飾的超支化聚縮水 甘油醚（DSC - HPG)。
[0058] 超支化聚縮水甘油醚對磁性微球的修飾
[0059] 取5mg氨基磁性微球（粒徑大小為1 μ m?10 μ m)，根據(jù)固含量5mg/ml進行換算， 去除上清液保留固體物質。之后向磁性微球溶液中滴加500 μ L的DSC - HPG溶液，于搖床 中反應30min。反應結束后，向反應體系中加入ImL 50mM PBS溶液繼續(xù)反應30min，將多余 的NHS酯水解后，使用50mM PBS溶液（pH = 7. 5)清洗三次，清洗過程中使用磁性分離架分 離磁性微球，清洗結束后，使用ImL 50mM PBS溶液（pH = 7. 5)重懸。
[0060] 超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球偶聯(lián)hGH抗體
[0061] 對超支化聚縮水甘油醚修飾的磁性微球的羧基進行活化，通常方法為加入EDC， 其摩爾含量為羧基摩爾含量的10倍，混合均勻后震蕩反應30分鐘，活化結束后離心使用 500 μ L 50mMPBS溶液（pH = 7. 5)清洗磁性微球。將hGH -5802抗體（生產廠家Medixm AB 貨號100042)用IOOmM碳酸氫鈉緩沖液（pH = 8. 0)稀釋到lmg/mL后，加入到磁性微球溶 液中，置于220印111371：搖床上反應311。反應結束后使用4001^501111?83溶液（?!1 = 7.5) 清洗懸浮磁性微球，清洗三次，制得超支化聚縮水甘油醚磁性微球-5802復合物。
[0062] 實施例2中作為對照試劑的商品化羧基磁性微球（生產廠家JSR診斷試劑，貨號 MS160/Carboxyl)與hGH抗體的偶聯(lián)方法同上，僅使用商品化羧基磁性微球替代超支化聚 縮水甘油醚修飾的磁性微球。
[0063] 吖啶酯的標記
[0064] 取hGH - 5801抗體（生產廠家Medixm AB貨號100041)加入到50mM PBS緩沖液 (pH = 8. 0)中，加入0· 5mmol/L的吖啶酯，混合，室溫避光反應20min。使用IOmM PBS緩沖 液（pH = 6. 5)透析除去未結合的吖啶酯，最后加入50%重蒸甘油，置于-20°C保存。
[0065] 化學發(fā)光激發(fā)液系統(tǒng)
[0066] 配制激發(fā)液1和激發(fā)液2 :激發(fā)液1為含有0. 5%過氧化氫溶液的0. 2M的硝酸溶 液；激發(fā)液2為含有1% Tween - 20的0. 5M氫氧化鈉溶液。
[0067] 實施例2超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球開發(fā)的診斷試劑在化學發(fā)光免疫分 析中利用雙抗夾心法在hGH項目上的驗證
[0068] 將超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球-hGH - 5802抗體復合物30 μ 1、hGH - 5801 抗體-吖啶酯復合物120μ 1，加入到100μ 1待分析樣本中，反應15分鐘。由于特異性的免 疫反應形成超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球-hGH -5802抗體-hGH-5801抗體-吖啶酯的 免疫復合物，使用磁力分離架進行固液分離去除上清液，留取沉淀物。使用清洗液對復合物 進行清洗，加入激發(fā)物1，間隔2s加入激發(fā)物2,激發(fā)物1中過氧化氫加成吖啶酯吖啶環(huán)的 9位碳原子，在堿性條件下生成過氧負離子，分子內進攻羰基，離去基團，生成不穩(wěn)定中間體 1，2-二氧雜環(huán)丁烷酮，1，2-二氧雜環(huán)丁烷酮開環(huán)生成吖啶酮，同時釋放光子。間隔0. 5s開 始測定產生的化學發(fā)光發(fā)光強度，光量子技術時間為0. 5-3s。
[0069] 標本檢測相關性評估
[0070] 分別使用Roche公司生產的人生長激素測定試劑盒（電化學發(fā)光法）和本發(fā)明所 建hGH檢測系統(tǒng)對40份濃度在0. 01?32. 49ng/mL范圍的hGH待分析樣本進行測定，然 后計算本發(fā)明所建hGH檢測系統(tǒng)與對比檢測系統(tǒng)之間的線性相關性，并計算在5、10、15和 20ng/mL檢定點的預期偏差（Bx)和相對偏差（Bx/x)。
[0071] 如圖2所示，本發(fā)明所建系統(tǒng)與對比系統(tǒng)的線性回歸方程為y = 0. 9083X+0. 4067， 線性相關系數(shù)為r2 = 0. 9913 (r = 0. 9956);如表1所示，本發(fā)明所建系統(tǒng)在5、10、15、20ng/ mL4個檢定點的預期偏差最高為I. 43ng/mL，預期相對偏差最高為7. 15%，表明本發(fā)明所建 系統(tǒng)檢測待分析樣本可以獲得與Roche檢測系統(tǒng)基本一致的結果，檢測準確度高，能夠很 好地滿足臨床應用需求。
[0072] 表1預期偏差與相對偏差計算
[0073]

【權利要求】
1. 超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分析中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用，其特征在于包括以下方法：超支化聚縮水甘油醚經(jīng)修飾后通過氨基作用包被 在納米磁性微球表面形成超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球，對超支化聚縮水甘油醚 修飾納米磁性微球的羧基進行活化后偶聯(lián)能與待測分子特異性結合的探測分子，形成了超 支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復合物固相載體，將超支化聚縮水甘油醚納米 磁性微球-探測分子復合物固相載體和待測樣本以及標記上發(fā)光物質的能與待測分子特 異性結合的捕獲分子混合反應后，形成了超支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復 合物固相載體-待測分子-捕獲分子-發(fā)光物質的復合物，經(jīng)清洗分離出復合物，向其中加 入激發(fā)物，復合物中的發(fā)光物質受到激發(fā)產生化學發(fā)光，最后用化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光 強度計算待測樣本中的目標分析物的濃度。
3. 根據(jù)權利要求1所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用，其特征在于所述的納米磁性微球大小為I U m?10 ii m。
4. 根據(jù)權利要求1所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用，其特征在于所述的超支化聚縮水甘油醚由三羥甲基丙烷和縮水甘油聚合而 成；所述的修飾為琥珀酰亞胺基碳酸酯修飾。
5. 根據(jù)權利要求1所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用，其特征在于檢測的待測物質為抗原、抗體、半抗體、半抗原、小分子化學物質或 金屬元素；探測分子為能夠與待測物質特異性結合的抗體、抗原、半抗原、半抗體或小分子； 捕獲分子是能與待測分子或探測分子或兩者復合物特異性結合的物質。
6. 根據(jù)權利要求1所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用，其特征在于所述的發(fā)光物質選自包括N - (4 -氨丁基）-N -乙基異魯米諾，吖 啶酯，吖啶磺酰胺，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
7. 根據(jù)權利要求1所述的超支化聚縮水甘油醚修飾納米磁性微球在化學發(fā)光免疫分 析中的應用，其特征在于所述的激發(fā)物選自含有〇. 1% - 1 %過氧化氫的〇. lmol/L - Imol/ L硝酸溶液、含有0? 1% - 1%過氧化氫的0? lmol/L- lmol/L硫酸溶液、含有0? 1% - 1%過 氧化氫的 〇? lmol/L - lmol/L 鹽酸溶液、含有 0? 5% - 5% Tween - 20 的 0? I - lmol/L 氫氧 化鈉溶液、含有〇? 5% - 5% Tween - 80的0? I - lmol/L氫氧化鈉溶液、或含有0? 5% - 5% TritonX - 100 的 0? I - lmol/L 氫氧化鈉溶液。
8. -種化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，其特征在于包括權利要求2所述的超支化聚縮水甘 油醚修飾納米磁性微球-探測分子復合物、化學發(fā)光激發(fā)液系統(tǒng)，連接發(fā)光物質的捕獲分 子。
9. 根據(jù)權利要求8所述的化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的化學發(fā)光激發(fā) 液系統(tǒng)包括激發(fā)液1和激發(fā)液2,激發(fā)液1選自含有0. 1 % -1 %過氧化氫的0. lmol/L - Imol/ L硝酸溶液、含有0? 1% -1%過氧化氫的0? lmol/L-lmol/L硫酸溶液或者含有0? 1% -1% 過氧化氫的〇? lmol/L - lmol/L鹽酸溶液；激發(fā)液2選自含有0? 5 % - 5 % Tween - 20的 0? I - lmol/L氫氧化鈉溶液、含有0? 5% - 5% Tween - 80的0? I - lmol/L氫氧化鈉溶液、或 含有0? 5% - 5% TritonX - 100的0? I - lmol/L氫氧化鈉溶液；所述的化學發(fā)光激發(fā)液系 統(tǒng)加樣方法為先加入激發(fā)液1，間隔2s后，再加入激發(fā)液2。
10. -種制備權利要求8或9所述試劑盒的方法，包括以下步驟： 1) 超支化聚縮水甘油醚的制備：以三羥甲基丙烷作為反應的引發(fā)劑，采用CH3OK對TMP 的羥基進行部分去質子化，去質子化部分占總部分的10 %，然后將縮水甘油緩慢滴加進入 體系引發(fā)聚合，反應溫度95?KKTC，反應10?12小時；反應結束后產物溶解在甲醇中， 通過強酸型陽離子交換樹脂中和；聚合物通過在丙酮中析出，甲醇中溶解，重復兩次進行提 純，最后在75?85°C的真空中干燥13?16小時，得超支化聚縮水甘油醚； 2) 超支化聚縮水甘油醚的修飾：將超支化聚縮水甘油醚用琥珀酰亞胺基碳酸酯進行 修飾得DSC修飾的超支化聚縮水甘油醚； 3) 超支化聚縮水甘油醚對磁性微球的修飾：向氨基磁性微球溶液中滴加上一步制備 的DSC修飾的超支化聚縮水甘油醚溶液，于搖床中反應0. 5?lh，反應結束后，向反應體系 中加入50mM PBS溶液繼續(xù)反應0. 5?lh，將多余的NHS酯水解后，使用pH = 7. 5的50mM PBS溶液清洗，清洗過程中使用磁性分離架分離磁性微球，清洗結束后，使用pH = 7. 5的 50mM PBS溶液重懸； 4) 超支化聚縮水甘油醚修飾磁性微球偶聯(lián)探測分子：對上一步制備的超支化聚縮水 甘油醚修飾的磁性微球的羧基進行活化，活化結束后使用pH = 7. 5的50mM PBS溶液清洗， 將探測分子用PH = 8. 0的IOOmM碳酸氫鈉緩沖液稀釋到后，加入到磁性微球溶液中，置于 200?220rpm 35?37°C搖床上反應2. 5?3. 5h，反應結束后使用，pH = 7. 5的50mM PBS 溶液清洗懸浮磁性微球，制得超支化聚縮水甘油醚納米磁性微球-探測分子復合物固相載 體； 5) 發(fā)光物質的標記：捕獲分子加入到pH = 8. 0的50mM PBS緩沖液中，加入0. 3? lmmol/L的發(fā)光物質，混合，室溫避光反應20?30min，使用pH = 6. 5的IOmM PBS緩沖液 透析除去未結合的發(fā)光物質，最后加入50%重蒸甘油，置于-20°C保存； 6) 配制激發(fā)液1和激發(fā)液2 :激發(fā)液1為含有0. 5 %過氧化氫溶液的0. 2M的硝酸溶液； 激發(fā)液2為含有1 % Tween - 20的0. 5M氫氧化鈉溶液。
【文檔編號】G01N33/553GK104316679SQ201410594720
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權日:2014年10月29日
【發(fā)明者】金晶, 朱宗哲, 陳贏, 蘇恩本 申請人:南京基蛋生物科技有限公司