Pct 與crp定量聯(lián)檢層析試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條及其制備方法，所述試紙條包括底襯及設(shè)在所述底襯上的包被膜，所述包被膜上設(shè)有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙，所述包被線區(qū)包括從靠近所述樣品墊端至靠近所述吸水紙端依次平行設(shè)置的包被熒光膠乳標(biāo)記抗體的標(biāo)記線、包被雞IgY抗體的質(zhì)控線、包被能與待檢抗原CRP特異性結(jié)合的另一株CRP單克隆抗體的CRP檢測線、以及包被能與待檢抗原PCT特異性結(jié)合的另一株P(guān)CT單克隆抗體的PCT檢測線。本發(fā)明的試紙條簡化了普通試紙條的結(jié)構(gòu)，通過去掉傳統(tǒng)試紙條中熒光乳膠標(biāo)記抗體得以固化的結(jié)合墊，將抗體改為固化在包被膜上，提高了測試的精密度，降低了試紙條成本。
【專利說明】PCT與CRP定量聯(lián)檢層析試紙條及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種PCT與CRP定量聯(lián)檢層析試 紙條及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] CRP是環(huán)狀五球體蛋白，屬于Oligomeric鈣結(jié)合蛋白，相對分子質(zhì)量約120000,由 5個相同的單體以非共價鍵構(gòu)成，是炎性淋巴因子白介素_6、白介素-1、腫瘤壞死因子刺激 肝臟上皮細(xì)胞合成的。CRP在感染發(fā)生后6?8h即開始升高，24?48h達(dá)到高峰，高峰值 可達(dá)正常的數(shù)百倍，在感染消除后其含量急驟下降，一周內(nèi)可恢復(fù)正常。而CRP在病毒感染 時無顯著升高，這為疾病早期感染類型的鑒別提供了極其重要的依據(jù)。
[0003] hsCRP(0. 1?10mg/L)對未來心血管疾病發(fā)生危險程度的預(yù)測：近年來，通過很多 前瞻性研究，已經(jīng)對hsCRP的升高在心血管疾病包括冠心病、中風(fēng)、外周血管疾病發(fā)病的危 險性方面的作用有所認(rèn)識。hsCRP對于急性冠脈綜合征的診斷也有十分重要的作用。
[0004] 臨床實驗室CRP檢測一直采用透射免疫和散射免疫方法，這些方法的參考值范圍 變動很大，從3mg/L到超過200mg/L。隨著人們對于低水平CRP與心血管疾病關(guān)系的認(rèn)識， 這些測定方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求。
[0005] 降I丐素原（procalcitonin,PCT)是1992年發(fā)現(xiàn)的人類降I丐素的前體物質(zhì)，無激素 活性，是由116個氨基酸殘基組成，相對分子量為13kD的糖蛋白。
[0006] PCT能有效地反映感染導(dǎo)致的炎癥損傷程度，具有高靈敏度、特異性。它在細(xì)菌或 真菌感染合并嚴(yán)重全身系統(tǒng)反應(yīng)或器官低灌注時顯著升高，而在病毒或局灶感染時水平正 常或輕度升高。這個特性使得PCT用來鑒別系統(tǒng)感染和非感染性炎癥或局灶感染。此外， PCT還可用來判斷治療的有效性、疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后。
[0007] 健康成人的PCT濃度〈0.lng/ml，嚴(yán)重全身感染者血PCT在24h內(nèi)可升高達(dá)1000 倍。膿毒癥時一般PCT升高且>2ng/ml，通常PCT>5ng/ml提示重癥感染，包括免疫抑制患者 如艾滋病人群，高濃度的PCT、特別是抗生素治療后無下降者常提示預(yù)后不良。
[0008] 目前PCT檢測方法有：
[0009] 1、放射免疫學(xué)分析法--該方法能檢測正常人的血清PCT，可靠敏感度為4pg/ml， 但該法檢測耗時長（19?22h)，而且有放射性元素的污染，使得使用受到限制。
[0010] 2、雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法--該法操作簡便，特異性強，敏感性高，測定的低限 值為0·lng/ml，2h可以出結(jié)果。
[0011] 3、金標(biāo)法--該法具有快速簡便，易觀察的特點。但是靈敏度不高。
[0012] 4、透射免疫濁度法--該測定方法簡便、快速，可自動化，適合于批量檢測，但是 免疫透射比濁的方法學(xué)及臨床應(yīng)用尚需做進(jìn)一步的驗證。
[0013] PCT是特異性較高的早期細(xì)菌感染標(biāo)志物，可較好地區(qū)別細(xì)菌感染與非細(xì)菌感染。 CRP測定雖有助于感染性疾病的早期診斷，但單獨測定不能確定診斷。PCT與CRP聯(lián)合檢測 可提高敏感性和特異性，減小誤診率。
[0014] 何靜發(fā)表在"檢驗醫(yī)學(xué)與臨床"的文章"聯(lián)合測定血清PCT與CRP對感染性疾病的 診斷價值"，研究對90例感染性患者PCTXRP的含量變化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示細(xì)菌感染組與 病毒感染組比較，PCT水平明顯升高，而且重癥細(xì)菌感染組與一般細(xì)菌感染組比較，PCT濃 度亦有明顯增加。血中PCT的升高可能與細(xì)菌內(nèi)毒素可刺激機(jī)體，誘導(dǎo)體內(nèi)甲狀腺外組織 產(chǎn)生大量PCT有關(guān)。細(xì)菌感染組的PCT與CRP之間存在正相關(guān)，這說明細(xì)菌感染引起CRP 改變的同時，也會引起PCT的改變，而病毒感染組中PCT與CRP之間無相關(guān)性，表明病毒能 刺激機(jī)體CRP合成增多，而不能誘導(dǎo)PCT合成。
[0015] 戴佩佩發(fā)表在"檢驗醫(yī)學(xué)"的文章"降鈣素原與C反應(yīng)蛋白聯(lián)合檢測在細(xì)菌感 染中的應(yīng)用"，研究對ICU的60例細(xì)菌感染患者PCT、CRP的含量及動態(tài)變化進(jìn)行檢測，以 PCT>0. 5ng/ml為界，診斷細(xì)菌感染的敏感性為96. 7% (58/60)，特異性為85. 3% (29/34)， 陽性預(yù)測值92. 1 % (58/63)，陰性預(yù)測值93. 5% (29/31);以CRP>8mg/L為界，診斷細(xì)菌感 染的敏感性為96. 7% (58/60)，特異性為73. 5% (25/34)，陽性預(yù)測值86. 6% (58/67)，陰 性預(yù)測值92. 5% (25/27)。PCT在敏感性與CRP相差不大的情況下，特異性卻顯著高于CRP。 同時測定血CRP和PCT有助于提高細(xì)菌感染性疾病早期判斷的特異性，對抗菌藥物應(yīng)用有 一定的參考價值。在局部感染時，PCT-般輕度升高，而CRP升高相對明顯，在沒有全身表 現(xiàn)的感染時，CRP可能是一個重要的觀察指標(biāo)。
[0016] 然而，目前市面上僅有南京基蛋生物科技有限公司發(fā)明的定性用的PCT/CRP聯(lián)合 檢測免疫層析試紙條（申請?zhí)枮?01210212105. 4)，采用膠體金作為標(biāo)記抗體的載體，來檢 測人全血、血漿、學(xué)清中的PCT和CRP。該試紙條采用的是定性的方法，只能給出陰性和陽性 判斷，無法給出明確的定量結(jié)果。方法學(xué)采用膠體金，靈敏度低。且試紙條的結(jié)構(gòu)復(fù)雜：包 括底襯、順次搭接粘貼的樣品墊、聚酯膜、包被膜和吸水紙。
[0017] 另外，現(xiàn)有技術(shù)中還公開了一種PCT與CRP聯(lián)合檢測用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料（UCP)試紙 條（申請?zhí)枮?01310257936. 8)，該試紙條包括試紙條底襯，以及試紙條底襯上順次相互搭 接粘貼的樣品墊、涂覆有UCP生物標(biāo)記物抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙，包被膜上設(shè)有一 條包被兔抗鼠IgG抗體的控制線，包被膜上還設(shè)有與所述控制線平行的兩條檢測線，分別 包被能與待檢抗原PCT特異性結(jié)合的抗體以及與待檢抗原CRP特異結(jié)合的抗體；所述UCP 生物標(biāo)記物抗體有兩種，分別為上轉(zhuǎn)發(fā)光材料（UCP)標(biāo)記的能與待檢抗原PCT特異性結(jié)合 的抗體以及與待檢抗原CRP特異結(jié)合的抗體。該試紙條結(jié)構(gòu)復(fù)雜：包括底襯、順次搭接粘貼 的樣品墊、聚酯膜、包被膜和吸水紙。且該試紙條采用的也是定性的方法，只能給出陰性和 陽性判斷，無法給出明確的定量結(jié)果。
[0018] 本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用普通的熒光膠乳定量層析檢測試紙條的結(jié) 構(gòu)套在PCT與CRP雙項聯(lián)檢上時，CRP的線性范圍只能達(dá)到0.l-40mg/L，同時CV值大于5， 而正常檢測要求CRP的線性范圍必須是0.l-150mg/L，正常情況下CV值小于5,目前已控制 到3以內(nèi)；且使用普通結(jié)構(gòu)的試紙條實現(xiàn)聯(lián)檢時，CRP檢測中容易出現(xiàn)hook效應(yīng)（鉤狀效 應(yīng)），影響結(jié)果判斷；而PCT檢測對靈敏度的要求又極高；同時CRP檢測的需樣量少，PCT檢 測需樣量多。因此，采用普通的試紙條結(jié)構(gòu)并不能順利實現(xiàn)CRP和PCT的聯(lián)檢。如何使PCT 與CRP聯(lián)合檢測試紙條既能滿足CRP的寬線性范圍又能符合PCT的高靈敏度要求，是現(xiàn)有 技術(shù)中一個難以解決的問題。且目前還沒有可以定量聯(lián)檢PCT與CRP的產(chǎn)品。因此，發(fā)明 一種既能滿足CRP的寬線性范圍又能符合PCT的高靈敏度的PCT與CRP定量聯(lián)檢試紙條很 有必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種PCT與CRP定量聯(lián)檢免 疫層析試紙條及其制備方法。
[0020] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0021] 一種PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，包括底襯及設(shè)在所述底襯上的包被膜， 所述包被膜上設(shè)有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙，所述包被線區(qū)包括從靠近所述樣品墊端至 靠近所述吸水紙端依次平行設(shè)置、且相互間隔的包被熒光膠乳標(biāo)記有CRP單克隆抗體、PCT 單克隆抗體和羊抗雞IgY抗體的標(biāo)記線、包被雞IgY抗體的質(zhì)控線、包被能與待檢抗原CRP 特異性結(jié)合的另一株CRP單克隆抗體的CRP檢測線、以及包被能與待檢抗原PCT特異性結(jié) 合的另一株P(guān)CT單克隆抗體的PCT檢測線。
[0022] 在其中一個實施例中，所述標(biāo)記線上熒光膠乳標(biāo)記的抗體采用包被緩沖液I進(jìn)行 稀釋，所述包被緩沖液I包括：〇. 2%?3%BSA，5%?20%蔗糖，1 %?5%海藻糖，0. 2%? 3%酪蛋白，0· 1%?0· 5%Tween-20,0· 1 ?0· 5%PVP，0. 05 ?0· 1%NaN3,余量為 0· 01 ? 0. 05M、pH7. 4的PBS;所述質(zhì)控線、CRP檢測線、和PCT檢測線上包被的抗體均采用包被緩沖 液II進(jìn)行稀釋，所述包被緩沖液II包括：3%?5%甲醇，余量為0. 01-0. 05M、pH7. 4的PBS。
[0023] 在其中一些實施例中，所述包被膜為硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的爬速為 95s?135s/4cm。
[0024] 在其中一些實施例中，所述熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體和熒光乳膠標(biāo)記的 PCT單克隆抗體的濃度均為0. 5?2mg/ml，在試紙條上的用量均為0. 02?0. 1μg/cm2,按 5%?30%的比例進(jìn)行稀釋；所述熒光乳膠標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體的濃度為0. 5?2mg/ml， 按5% -15%的比例進(jìn)行稀釋，在試紙條上的用量為0. 001?0. 025μg/cm2。
[0025] 在其中一些實施例中，所述質(zhì)控線上包被的雞IgY抗體的濃度為0. 5?lmg/ml，用 量為20μ1/27?35cm;所述檢測線上包被的CRP單克隆抗體和PCT單克隆抗體的濃度均 為 0· 5 ?2mg/ml，用量均為 20μ1/27 ?35cm。
[0026] 在其中一個實施例中，所述待檢抗原CRP為人CRP，所述待檢抗原PCT為人PCT。
[0027] 在其中一個實施例中，所述包被線區(qū)還包括設(shè)置于PCT檢測線與吸水紙之間的含 有伊文斯蘭染料的記號線。記號線可以減少工人在貼膜過程中的操作失誤。所述記號線位 于CRP與PCT檢測線之后，記號線與質(zhì)控線分別位于兩條檢測線的兩端。前面的質(zhì)控線還 有利于避免儀器讀數(shù)錯誤；后面的記號線一方面可起到標(biāo)記作用，避免生產(chǎn)組裝試紙條時 顛倒出錯，另一方面，當(dāng)樣本層析到記號線時，由于記號線是由染料構(gòu)成，線上的染料會被 樣本沖散，褪去顏色，從而可根據(jù)記號線的有無，檢驗樣本是否正常層析反應(yīng)，與質(zhì)控線一 起起到雙質(zhì)控作用。
[0028] 在其中一個實施例中，所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線和記號線之間 的相互間隔為3?8mm。
[0029] 在其中一個實施例中，所述熒光膠乳顆粒的直徑為0.Iym?Ιμπι，受激發(fā)后發(fā)射 的波長為180nm?800nm。
[0030] 本發(fā)明還提供了上述PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備方法，包括以下 步驟：
[0031] (I)、標(biāo)記線的制備
[0032] 用包被緩沖液I稀釋標(biāo)記有CRP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有PCT單克隆抗體 的熒光膠乳和標(biāo)記有羊抗雞IgY抗體的熒光膠乳，將這三種標(biāo)記抗體的膠乳混合，劃線于 包被膜上形成標(biāo)記線；其中熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體和熒光膠乳標(biāo)記的PCT單克 隆抗體的濃度均為〇. 5?2mg/ml，用量均為0. 02?0. 1μg/cm2 ;突光膠乳標(biāo)記的羊抗雞 IgY抗體的濃度為〇. 5?2mg/ml，用量為0. 001?0. 025μg/cm2 ;所述包被緩沖液I中含 有0· 2%?3%BSA，5%?20%蔗糖，1%?5%海藻糖，0· 2%?3%酪蛋白，0· 1%?0· 5% Tween-20,0· 1 ?0· 5%PVP，0. 05 ?0· 1%NaN3,余量為 0· 01 ?0· 05Μ、ρΗ7· 4 的PBS;
[0033] (2)、質(zhì)控線和檢測線的制備
[0034] 用包被緩沖液II稀釋雞IgY抗體、能與待檢抗原CRP特異結(jié)合的不同于步驟（1) 的CRP單克隆抗體的另一株CRP單克隆抗體、以及能與待檢抗原PCT特異結(jié)合的不同于步 驟（1)的PCT單克隆抗體的另一株P(guān)CT單克隆抗體，并將稀釋后的三種抗體分別依次平行 地劃線于包被膜上形成質(zhì)控線、CRP檢測線和PCT檢測線；其中，質(zhì)控線包被的雞IgY抗體 的濃度為〇. 5?lmg/ml，用量為20μ1/27?35cm;CRP檢測線包被的CRP單克隆抗體的濃 度為0. 5?2mg/ml，用量為20μ1/27?35cm;PCT檢測線包被的PCT單克隆抗體的濃度為 0. 5?2mg/ml，用量為20μ1/27?35cm;所述包被緩沖液II中含有3%?5%甲醇，余量為 0. 01-0. 05M、pH7. 4的PBS;所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線之間相互間隔3? 8mm；
[0035] (3)、包被膜的制備
[0036] 將包被好標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線的包被膜置于濕度〈30 %的40? 50°C的烘箱，干燥24?72h后，于2°C?30°C密封干燥平衡7天以上；
[0037] (4)、試紙條的制備
[0038] 在底襯上搭接粘貼包被膜，在包被膜靠近標(biāo)記線的一端搭接粘貼樣品墊，在包被 膜靠近PCT檢測線的一端搭接粘貼吸水紙，即得。
[0039] 在其中一個實施例中，所述試紙條的制備方法還包括記號線的制備步驟：用純凈 水將伊文斯蘭染料按〇. 5%?2%的稀釋比稀釋后，于PCT檢測線和吸水紙之間劃線，形成 記號線。
[0040] 在其中一個實施例中，步驟（1)中，所述熒光膠乳標(biāo)記抗體的制備步驟為：將常規(guī) 方法共價活化后的熒光膠乳超聲波200W?400W處理20?30秒后，按照50?200μg標(biāo) 記抗體/100μ1熒光膠乳的比例加入CRP單克隆抗體、PCT單克隆抗體和羊抗雞IgY抗體， 混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌3次，每次10000?15000xg、離心10分鐘，沉淀用 PBS-TBN溶解并超聲波100W處理30秒，用PBS-TBN恢復(fù)離心前體積，4°C保存，備用。
[0041] 本發(fā)明發(fā)明人通過換用不同材料的結(jié)合墊等方法都不能實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。 最后撤掉結(jié)合墊，直接將材料包被在包被膜上，并改用特殊的包被緩沖液，再通過包被參數(shù) 的逐一調(diào)配，最終使CRP線性范圍達(dá)到0.l-150mg/L，同時也符合了PCT靈敏度高的要求。 [0042] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點：
[0043] 1、本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條簡化了普通試紙條的結(jié)構(gòu)，通過 去掉傳統(tǒng)試紙條中熒光乳膠標(biāo)記抗體得以固化的結(jié)合墊，將熒光乳膠標(biāo)記的抗體改為固化 在包被膜上，從而提高了測試的精密度，并降低了標(biāo)記抗體的用量，最終降低了試紙條成 本。
[0044] 2、本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條利用特殊的包被緩沖液將熒光乳 膠標(biāo)記的抗體固化在包被膜上，固化后能有效的促使標(biāo)記膠乳在層析過程中的釋放，從而 有利于提1?測試的精密度。
[0045] 3、本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條與普通試紙條的硝酸纖維素包被 膜的爬速并不一樣，可以有效防止信號峰出現(xiàn)本底前翹，使測試結(jié)果的精密度更高。
[0046] 4、本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條PCT與CRP檢測線設(shè)在質(zhì)控線后 面，而不是在質(zhì)控線前面，與普通試紙條的檢測線和質(zhì)控線位置設(shè)定并不相同，這有利于確 保降低儀器掃描熒光信號時出錯的風(fēng)險；若將PCT或CRP檢測線設(shè)于質(zhì)控線之前，當(dāng)較為靠 近標(biāo)記線的檢測線的結(jié)果為陰性，沒有熒光信號聚集時，同時，反應(yīng)后的標(biāo)記線上也沒有明 顯的熒光信號聚集，兩線的信號曲線較為類似，因此熒光檢測儀進(jìn)行信號掃描時可能會受 標(biāo)記線的熒光信號影響取錯信號值，進(jìn)而讀錯數(shù)據(jù)；而將質(zhì)控線設(shè)在PCT或CRP檢測線之前 時，由于質(zhì)控線可捕獲熒光信號，質(zhì)控線處會產(chǎn)生明顯的信號峰，如質(zhì)控線后面的檢測線結(jié) 果為陰性，則由于質(zhì)控線和該檢測線的熒光信號值相差較大，儀器較容易將兩者分辨開，讀 取正確的波段熒光信號值；反之，如質(zhì)控線后的檢測線結(jié)果為陽性，則質(zhì)控線和該檢測線處 熒光信號強度大，均會出現(xiàn)明顯熒光信號峰，也易于儀器判讀取值。
[0047] 5、本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條可以實現(xiàn)定量檢測人全血、血漿 和血清里的PCT和CRP，PCT的檢測范圍是0. 1?100ng/ml，CRP的檢測范圍是0. 1?150mg/ L;PCT的靈敏度達(dá)到0·lng/ml，CRP靈敏度達(dá)到0·lmg/L。
[0048] 6、本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條解決了CRP取樣量過少不易操作 的問題，檢測時間短，只需15min。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1為本發(fā)明實施例1的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意 圖；
[0050] 圖2為本發(fā)明實施例6中PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條與對照試劑測 試相同臨床樣本時，兩者PCT與CRP相關(guān)性圖；
[0051] 圖3為本發(fā)明試驗例2中兩種包被液配方對CRP與PCT的熱破壞穩(wěn)定性的影響 圖；
[0052] 圖4為本發(fā)明試驗例3中普通用膜和本發(fā)明的硝酸纖維素膜對測試結(jié)果的影響 圖；
[0053] 圖5為本發(fā)明試驗例4中CRP檢測線和PCT檢測線孰前孰后對標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較 圖；其中P-C表示PCT檢測線在前，CRP檢測線在后；C-P表示CRP檢測線在前，PCT檢測線 在后；
[0054] 附圖標(biāo)記：1、底襯；2、包被膜；3、樣品墊；4、吸水紙；5、標(biāo)記線；6、質(zhì)控線；7、CRP 檢測線；8、PCT檢測線；9、記號線。

【具體實施方式】
[0055] 以下通過附圖和具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0056] 以下實施例中所使用的原料如無特別說明，均來源于市售。
[0057] 實施例IPCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條及其制備方法
[0058] 如圖1所示，為本發(fā)明的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。 一種PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條，包括底襯1及設(shè)在所述底襯1上的包被膜 2,所述包被膜2上設(shè)有樣品墊3、包被線區(qū)和吸水紙4,包被線區(qū)包括靠近所述樣品墊3端 至靠近所述吸水紙4端依次平行設(shè)置、且相互間隔的包被熒光膠乳標(biāo)記有CRP單克隆抗體、 PCT單克隆抗體和羊抗雞IgY抗體的標(biāo)記線5、包被雞IgY抗體的質(zhì)控線6、包被能與待檢 抗原CRP特異性結(jié)合的另一株CRP單克隆抗體的CRP檢測線7、以及包被能與待檢抗原PCT 特異性結(jié)合的另一株P(guān)CT單克隆抗體的PCT檢測線8、以及含有伊文斯蘭染料的記號線9。
[0059] 在該實施例中，所述包被膜2為爬速在95s/4cm的硝酸纖維素膜。
[0060] 該實施例的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的制備方法如下，包括以下 步驟：
[0061] 1.熒光膠乳的共價活化
[0062] 超聲波處理膠乳微球體30秒后，調(diào)節(jié)膠乳微球體濃度為I.OXIO1Vml, 15000xg離 心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水或者100mMpH6. 0磷酸鈉溶液溶解，并超聲波200W 處理30秒；先加入50μ1的lOOmg/mlEDC，震蕩混勻，再加入50μ1的50mg/mlN-羥基硫代 琥珀酰亞胺（Sylfo-NHS)，震蕩混勻；室溫孵育30分鐘后15000xg、離心15分鐘，沉淀用 100mM、pH6. 0的檸檬酸緩沖液溶解，放置在2?8°C條件下備用；
[0063] 2.熒光膠乳微粒標(biāo)記蛋白的制備
[0064] 將活化后的熒光膠乳超聲波200W處理30秒后，按照50 μg標(biāo)記抗體/100 μ 1熒光 膠乳的比例加入羊抗雞IgY抗體（購自CELLWAY-LAB公司）、PCT單克隆抗體（購自Hytest 公司）、CRP單克隆抗體（購自Hytest公司），混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌3次， 每次15000xg、離心10分鐘，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波100W處理30秒，用PBS-TBN恢 復(fù)離心前體積，4°C保存，備用；
[0065] 3.制備硝酸纖維素包被膜
[0066]a.標(biāo)記線的制備
[0067] 用包被緩沖液I稀釋標(biāo)記有CRP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有PCT單克隆抗體 的熒光膠乳和標(biāo)記有羊抗雞IgY抗體的熒光膠乳，將這三種標(biāo)記抗體的膠乳混合，劃線于 硝酸纖維素膜上。熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體的濃度為0. 5mg/ml，按15%的稀釋比， 0. 02μg/cm2的用量劃線在試紙條上；熒光膠乳標(biāo)記的PCT單克隆抗體的濃度為0. 5mg/ml， 按15%的稀釋比，0. 02μg/cm2的用量劃線在試紙條上；熒光膠乳標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體 的濃度為〇. 5mg/ml，按5%的稀釋比，0. 001μg/cm2的用量劃線在試紙條上。（包被緩沖液 I的制備：含有 〇· 2%BSA，5%蔗糖，1%海藻糖，0· 2%酪蛋白，0· 1%Tween-20,0· 1%PVP， 0.05%NaN3，余量為0.01M、ρΗ7·4的PBS，用0.22以111濾膜過濾，置于41：備用，有效期30 天。）
[0068]b.質(zhì)控線和檢測線的制備：用包被緩沖液II稀釋雞IgY抗體（購自CELLWAY-LAB公司）以及能與待檢抗原之一特異結(jié)合的另一單克隆抗體（購自Hytest公司），并將稀釋 后的三種抗體分別依次平行地劃線于硝酸纖維素膜上，所述質(zhì)控線靠近標(biāo)記線。質(zhì)控線包 被的雞IgY抗體的濃度為0. 5mg/ml，用量為20μl/27-35cm，CRP檢測線包被的CRP單克隆 抗體的濃度為〇. 5mg/ml，用量為20μl/27-35cm，PCT檢測線包被的PCT單克隆抗體的濃度 為0· 5mg/ml，用量為20μl/27-35cm。（包被緩沖液II的制備：將3 %甲醇，余量為(λ01M、 ρΗ7·4的PBS，用0.22以111濾膜過濾，置于41：備用，有效期30天）
[0069]c.記號線的制備：用純凈水將伊文斯蘭染料按2%的稀釋比稀釋，稀釋后劃線于 硝酸纖維素膜上，所述記號線靠近PCT檢測線。
[0070] 標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線與記號線相互間隔3mm。
[0071] 將包被好的硝酸纖維素膜置于濕度〈30%的50°C的烘箱，干燥72h后，于2°C? 30°C密封干燥平衡7天以上封袋備用。
[0072] 4.制備試紙條
[0073] 在底襯1上搭接粘貼包被膜2,在包被膜2靠近標(biāo)記線5的一端搭接粘貼樣品墊 3,在包被膜2靠近記號線9的一端搭接粘貼吸水紙4,得到試紙板，按照要求切割成適當(dāng)寬 度的試紙條。
[0074] 實施例2PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條及其制備方法
[0075] 該實施例的試紙條的結(jié)構(gòu)與實施例1的試紙條的結(jié)構(gòu)相同。不同之處在于，在該 實施例中，所述包被膜2為爬速在110s/4cm的硝酸纖維素膜。
[0076] 該實施例的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的制備方法如下，包括以下 步驟：
[0077] 1.熒光膠乳的共價活化
[0078] 同實施例1。
[0079] 2.熒光膠乳微粒標(biāo)記蛋白的制備
[0080] 同實施例1。
[0081] 3.制備硝酸纖維素包被膜
[0082] a.標(biāo)記線的制備
[0083] 用包被緩沖液I稀釋標(biāo)記有CRP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有PCT單克隆抗 體的熒光膠乳和標(biāo)記有羊抗雞IgY抗體的熒光膠乳，將這三種標(biāo)記抗體的膠乳混合，劃線 于硝酸纖維素膜上。熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體的濃度為lmg/ml，按20%的稀釋比， 0. 1μg/cm2的用量劃線在試紙條上；熒光膠乳標(biāo)記的PCT單克隆抗體的濃度為lmg/ml，按 20%的稀釋比，0. 1μg/cm2的用量劃線在試紙條上；熒光膠乳標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體的濃 度為I.Omg/ml，按10%的稀釋比，0.0251^/(^12的用量劃線在試紙條上。（包被緩沖液I 的制備：含有2%BSA，10%蔗糖，3%海藻糖，1%酪蛋白，0· 2%Tween-20,0. 3%PVP，0. 09% NaN3，余量為0· 02M、ρΗ7· 4的PBS，用0· 22μm濾膜過濾，置于4°C備用，有效期30天。）
[0084] b.質(zhì)控線和檢測線的制備
[0085]將用包被緩沖液II稀釋后的三種抗體分別依次平行地劃線于硝酸纖維素 膜上，所述質(zhì)控線靠近標(biāo)記線。質(zhì)控線包被的雞IgY抗體的濃度為〇. 8mg/ml，用 量為20μl/27-35cm，CRP檢測線包被的CRP單克隆抗體的濃度為I.Omg/ml，用量 為20μl/27-35cm，PCT檢測線包被的PCT單克隆抗體的濃度為I.Omg/ml，用量為 20μl/27-35cm。（包被緩沖液II的制備：將4 %甲醇，余量為(λ03M、ρΗ7· 4的PBS，用 0· 22μm濾膜過濾，置于4°C備用，有效期30天）
[0086] c.記號線的制備
[0087] 用純凈水將伊文斯蘭染料按1 %的稀釋比稀釋，稀釋后劃線于硝酸纖維素膜上，所 述記號線靠近PCT檢測線。
[0088] 標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線與記號線相互間隔5mm。
[0089] 將包被好的硝酸纖維素膜置于濕度〈30%的50°C的烘箱，干燥72h后，于2°C? 30°C密封干燥平衡7天以上封袋備用。
[0090] 4.制備試紙條
[0091] 同實施例1。
[0092] 實施例3PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條及其制備方法
[0093] 該實施例的試紙條的結(jié)構(gòu)與實施例1的試紙條的結(jié)構(gòu)相同。不同之處在于，在該 實施例中，所述包被膜2為爬速在135s/4cm的硝酸纖維素膜。
[0094] 該實施例的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的制備方法如下，包括以下 步驟：
[0095] 1.熒光膠乳的共價活化
[0096] 同實施例1。
[0097] 2.熒光膠乳微粒標(biāo)記蛋白的制備
[0098] 同實施例1。
[0099] 3.制備硝酸纖維素包被膜
[0100] a.標(biāo)記線的制備
[0101] 用包被緩沖液I稀釋標(biāo)記有CRP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有PCT單克隆抗 體的熒光膠乳和標(biāo)記有羊抗雞IgY抗體的熒光膠乳，將這三種標(biāo)記抗體的膠乳混合，劃線 于硝酸纖維素膜上。熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體的濃度為2mg/ml，按30%的稀釋比， 0. 1μg/cm2的用量劃線在試紙條上；突光膠乳標(biāo)記的PCT單克隆抗體的濃度為2mg/ml，按 30%的稀釋比，0. 1μg/cm2的用量劃線在試紙條上；熒光膠乳標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體的濃 度為2mg/ml，按15 %的稀釋比，0. 025μg/cm2的用量劃線在試紙條上。（包被緩沖液I的制 備：含有 3%BSA，20%蔗糖，5%海藻糖，3%酪蛋白，0.5%Tween-20，0· 5%PVP，0· 1 %NaN3, 余量為0· 05M、ρΗ7· 4的PBS，用0· 22μm濾膜過濾，置于4°C備用，有效期30天。）
[0102] b.質(zhì)控線和檢測線的制備
[0103] 將用包被緩沖液II稀釋后的三種抗體分別依次平行地劃線于硝酸纖維素膜上，所 述質(zhì)控線靠近標(biāo)記線。質(zhì)控線包被的雞IgY抗體的濃度為lmg/ml，用量為20μl/27-35cm， CRP檢測線包被的CRP單克隆抗體的濃度為2mg/ml，用量為20μl/27-35cm，PCT檢測線包 被的PCT單克隆抗體的濃度為2mg/ml，用量為20μl/27-35cm。（包被緩沖液II的制備：將 5%甲醇，余量為0· 05M、ρΗ7· 4的PBS，用0· 22μm濾膜過濾，置于4°C備用，有效期30天）
[0104] c.記號線的制備
[0105] 用純凈水將伊文斯蘭染料按0. 5%的稀釋比稀釋，稀釋后劃線于硝酸纖維素膜上， 所述記號線靠近PCT檢測線。
[0106] 標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線與記號線相互間隔8mm。
[0107] 將包被好的硝酸纖維素膜置于濕度〈30%的50°C的烘箱，干燥72h后，于2°C? 30°C密封干燥平衡7天以上封袋備用。
[0108] 4.制備試紙條
[0109] 同實施例1。
[0110] 實施例4PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條
[0111] 在該實施例中，PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條組裝在由塑料上殼和塑 料下殼扣合而成的塑料外殼中，塑料上殼設(shè)有兩個開孔，加樣孔和顯不窗，加樣孔對應(yīng)于實 施例1所述的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的樣品墊3,結(jié)果顯示窗則對應(yīng)于試 紙條的質(zhì)控線6、檢測線7、檢測線8和記號線9,在使用時，從該塑料外殼中取出所述試紙 條。
[0112] 實施例5測試實施例1所述的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層析試紙條的熒光定 量光譜檢測系統(tǒng)
[0113] 在該實施例中，設(shè)置有用來測試實施例1所述的PCT與CRP定量聯(lián)合檢測免疫層 析試紙條的熒光定量光譜檢測系統(tǒng)，主要包含熒光光源系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及自動軟件分析控 制系統(tǒng)。
[0114] 熒光光源系統(tǒng)發(fā)出單色激發(fā)光，照射在試紙條的檢測線7和8,檢測線7和8通過 反應(yīng)凝集的熒光膠乳在激發(fā)光的作用下，發(fā)射出熒光信號，該熒光信號被檢測系統(tǒng)捕獲，檢 測系統(tǒng)由光電倍增管和固態(tài)檢測器組成，檢測系統(tǒng)接收入射熒光信號，由光電倍增管實現(xiàn) 光信號的放大，然后由固態(tài)檢測器將光信號轉(zhuǎn)換為電信號，由電信號讀出電路將電信號輸 出，再經(jīng)過自動軟件分析控制系統(tǒng)處理，在顯示屏上顯示結(jié)果。實現(xiàn)對樣本的精確定量。
[0115] 對CRP進(jìn)行測定時，采用德靈公司的DN-100特種蛋白分析儀做檢測標(biāo)準(zhǔn)，對PCT 進(jìn)行測定時，采用梅里埃公司的VIDAS做檢測標(biāo)準(zhǔn)。表1為采用本發(fā)明實施例1的試紙條 對部分樣品進(jìn)行定量測定的結(jié)果。
[0116] 表1采用本發(fā)明實施例1的試紙條對樣本的定量測試結(jié)果
[0117]

【權(quán)利要求】
1. 一種PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在于，包括底襯及設(shè)在所述底襯上 的包被膜，所述包被膜上設(shè)有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙，所述包被線區(qū)包括從靠近所述樣 品墊端至靠近所述吸水紙端依次平行設(shè)置的、且相互間隔的包被熒光膠乳標(biāo)記有CRP單克 隆抗體、PCT單克隆抗體和羊抗雞IgY抗體的標(biāo)記線、包被雞IgY抗體的質(zhì)控線、包被能與 待檢抗原CRP特異性結(jié)合的另一株CRP單克隆抗體的CRP檢測線、以及包被能與待檢抗原 PCT特異性結(jié)合的另一株P(guān)CT單克隆抗體的PCT檢測線。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在于，所述 標(biāo)記線上包被的熒光膠乳標(biāo)記抗體采用包被緩沖液I進(jìn)行稀釋，所述包被緩沖液I包括： 0? 2%?3% BSA，5%?20%蔗糖，1%?5%海藻糖，0? 2%?3%酪蛋白，0? 1%?0? 5% Tween-20,0. 1 ?0? 5% PVP，0. 05 ?0? 1% NaN3,余量為 0? 01 ?0? 05M、pH7. 4 的 PBS。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在于，所述包被 膜為硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的爬速為95s?135s/4cm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在于， 所述熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體和熒光乳膠標(biāo)記的PCT單克隆抗體的濃度均為0. 5? 211^/1111，按10%?30%的比例進(jìn)行稀釋，在試紙條上的用量均為0.02?0.11^/〇112;所述 熒光乳膠標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體的濃度為0. 5?2mg/ml，按5 %?15 %的比例進(jìn)行稀釋，在 試紙條上的用量為0. 001?0. 025 ii g/cm2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在 于，所述質(zhì)控線上包被的雞IgY抗體的濃度為0. 5?lmg/ml，用量為20U1/27?35cm ;所 述檢測線上包被的CRP單克隆抗體和PCT單克隆抗體的濃度均為0. 5?2mg/ml，用量均為 20 u 1/27 ?35cm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在于， 所述待檢抗原CRP為人CRP，所述待檢抗原PCT為人PCT。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條，其特征在于， 所述包被線區(qū)還包括設(shè)置于PCT檢測線和吸水紙之間的含有伊文斯蘭染料的記號線。
8. -種PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 、標(biāo)記線的制備 用包被緩沖液I稀釋標(biāo)記有CRP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有PCT單克隆抗體的熒 光膠乳和標(biāo)記有羊抗雞IgY抗體的熒光膠乳，將這三種標(biāo)記抗體的膠乳混合，劃線于包被 膜上形成標(biāo)記線；其中熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體和熒光膠乳標(biāo)記的PCT單克隆抗體 的濃度均為〇. 5?2mg/ml，用量均為0. 02?0. I ii g/cm2 ;熒光膠乳標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體 的濃度為〇. 5?2mg/ml，用量為0. 001?0. 025 ii g/cm2 ;所述包被緩沖液I中含有0. 2 %? 3% BSA，5%?20%蔗糖，1 %?5%海藻糖，0? 2%?3%酪蛋白，0? 1 %?0? 5% Tween-20， 0? 1 ?0? 5% PVP，0. 05 ?0? 1% NaN3,0. 01 ?0? 05M、pH7. 4 的 PBS ; (2) 、質(zhì)控線和檢測線的制備 用包被緩沖液II稀釋雞IgY抗體、能與待檢抗原CRP特異結(jié)合的不同于步驟（1)的CRP 單克隆抗體的另一株CRP單克隆抗體、以及能與待檢抗原PCT特異結(jié)合的不同于步驟（1) 的PCT單克隆抗體的另一株P(guān)CT單克隆抗體，并將稀釋后的三種抗體分別依次平行地劃線 于包被膜上形成質(zhì)控線、CRP檢測線和PCT檢測線；其中，質(zhì)控線包被的雞IgY抗體的濃度 為0. 5?lmg/ml，用量為20 iil/27?35cm ;CRP檢測線包被的CRP單克隆抗體的濃度為 0. 5?2mg/ml，用量為20iil/27?35cm ;PCT檢測線包被的PCT單克隆抗體的濃度為0. 5? 2mg/ml，用量為20iil/27?35cm ;所述包被緩沖液II中含有3%?5%甲醇，0? 01-0. 05M、 pH7. 4 的 PBS ; (3) 、包被膜的制備 將包被好標(biāo)記線、質(zhì)控線、CRP檢測線、PCT檢測線的包被膜置于濕度〈30%的40? 50°C的烘箱，干燥24?72h后，于2°C?30°C密封干燥平衡7天以上； (4) 、試紙條的制備 在底襯上搭接粘貼包被膜，在包被膜靠近標(biāo)記線的一端搭接粘貼樣品墊，在包被膜靠 近PCT檢測線的一端搭接粘貼吸水紙，即得。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備方法，其特 征在于，所述試紙條的制備方法還包括記號線的制備步驟：用純凈水將伊文斯蘭染料按 0.5%?2%的稀釋比稀釋后，于PCT檢測線與吸水紙之間劃線，形成記號線。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的PCT與CRP定量聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備方法，其特征 在于，所述步驟（1)中，熒光膠乳標(biāo)記抗體的制備步驟為：將常規(guī)方法共價活化后的熒光膠 乳超聲波200W?400W處理20?30秒后，按照50?200 ii g標(biāo)記抗體/100 ill熒光膠乳 的比例加入CRP單克隆抗體、PCT單克隆抗體和羊抗雞IgY抗體，混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小 時，離心洗滌3次，每次10000?15000xg、離心10分鐘，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波100W 處理30秒，用PBS-TBN恢復(fù)離心前體積，4°C保存。
【文檔編號】G01N33/74GK104316702SQ201410593720
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】戴旭青, 黃春榮, 李凱, 唐時幸, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司