：本發(fā)明涉及納米分析檢測領(lǐng)域，尤其涉及水溶性的PbX(X代表硫、硒)量子點作為修飾電極在光電化學(xué)分析方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：建立高靈敏、高通量、特異性強(qiáng)的靶標(biāo)分子快速檢測方法是目前分析化學(xué)面臨的緊迫任務(wù)。脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)不僅起遺傳信息儲存和傳遞的作用，還可以借自身形成的空間結(jié)構(gòu)與其他類型的分子相互作用。核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment，SELEX)篩選出來的，它是一類能與蛋白質(zhì)等靶物質(zhì)特異性結(jié)合的單鏈寡核苷酸片段(單鏈DNA或RNA)，對目標(biāo)分子具有高度親和力和專一性的識別能力[GoulkoAA，LiF，LeXC.TrendsAnal.Chem.，2009，28：878-892.]。適配體不依賴于生物體或細(xì)胞環(huán)境，具有空間結(jié)構(gòu)多樣和靶標(biāo)分子廣泛的特點，對包括金屬離子、有機(jī)小分子、生物分子(蛋白質(zhì)、DNA、酶)，甚至細(xì)胞和微生物在內(nèi)的各類靶物質(zhì)具有特異識別作用[TanakaY，OdaS，YamaguchiH，etal.J.Am.Chem.Soc.，2007，129：244-245；MedleyCD，SmithJE，TangZW，etal.Anal.Chem.，2008，80：1067-1072]。因此，適配體的識別和檢測方法對醫(yī)學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等研究領(lǐng)域的發(fā)展發(fā)揮了越來越重要的作用。光電化學(xué)方法是最近剛剛發(fā)展起來的一種新型分析方法[TokudomeH，YamadaY，SonezakiS，IshikawaH，BekkiM，KanehiraK，MiyauchiM.Appl.Phys.Lett.2005，87：213901-213903；LiuSL，LiC，ChengJ，ZhouYX.Anal.Chem.2006，78：4722-4726.]。光電化學(xué)的檢測過程和電致化學(xué)發(fā)光正好相反。由于采用不同形式的激發(fā)和檢測信號，因而其背景信號較低，能達(dá)到與電致化學(xué)發(fā)光相當(dāng)?shù)母哽`敏度。并且，光電化學(xué)的儀器比較簡單，容易微型化；由于采用電化學(xué)檢測，同光學(xué)檢測方法相比，其設(shè)備更加價廉。因此，光電化學(xué)生物分析方法具有非常好的發(fā)展前景。鉛與第VI主族(如S、Se、Te)元素形成的半導(dǎo)體化合物具有特殊的光學(xué)、光電化學(xué)性質(zhì)。例如：硫化鉛(PbS)是一種典型的IV-VI族半導(dǎo)體化合物，室溫下其本體材料的禁帶寬度約為0.41eV[SeghaierS，KamounN，BriniR，AmaraAB.Mater.Chem.Phys.2006，97：71-80.]，屬于窄帶隙的p型半導(dǎo)體材料[JankoviL，DimosK，BujdkJ，KoutselasI，MadejovaJ，GournisD，KarakassidesMA，KomadelP.Phys.Chem.Chem.Phys.2010，12：14236-14244.]。相對較大(18nm)的激子波爾半徑[ScholesGD，RumblesG.Nat.Mater.2006，5：683-696.]使PbS具有比其它大多數(shù)半導(dǎo)體材料更強(qiáng)的量子尺寸效應(yīng)，通過改變所合成量子點的尺寸可以調(diào)節(jié)其吸收帶邊 從可見光區(qū)一直到近紅外區(qū)。此外PbS量子點能夠顯示多激子效應(yīng)，即吸收一個高能量光子可以產(chǎn)生多個電子-空穴對[SamburJB，NovetT，ParkinsonBA.Science2010，330：63-66.]，因此具有潛在的良好的光電轉(zhuǎn)換性能。據(jù)我們所知，到目前為止，還沒有采用基于PbX(X代表硫、硒、碲)量子點進(jìn)行光電化學(xué)測定的報道。G-quadruplex/hemin是由富含G堿基的核酸序列與嵌入的hemin組成，是一種具有催化性能的DNA酶，它具有易標(biāo)記，低成本，不易水解，熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點?；贕-quadruplex/hemin的DNA酶具有過氧化物酶的活性，能夠在H2O2的存在下催化2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)[HuangY，ChenJ，ZhaoS，ShiM，ChenZF，LiangH.Anal.Chem.2013，85：4423-4430.]的氧化和魯米諾[LuoM，ChenX，ZhouG，XiangX，ChenL，JiX，HeZ.Chem.Commun.2012，48：1126-1128.]的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，G-quadruplex/hemin結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用在比色[XiaoY，PavlovV，NiazovT，DishonA，KotlerM，WillnerI.J.Am.Chem.Soc.2004，126：7430-7431.]和化學(xué)發(fā)光[GaoY，LiBX.Anal.Chem.2013，85：11494-11500.]傳感器中。另外，基于G-quadruplex/hemin的電化學(xué)催化H2O2還原[AcharyaHN，BoseHN.Phys.StatusSolidiA1971，6：K43-K45.]及其對CdSe/ZnS量子點的熒光猝滅[SharonE，F(xiàn)reemanR，WillnerI.Anal.Chem.2010，82：7073-7077.]，針對DNA和適配體的電化學(xué)、熒光傳感器得以建立。我們利用G-四面體/hemin能引發(fā)p型PbX(X代表硫、硒)量子點的光電流增大，建立了一種新穎多功能的光電化學(xué)檢測方法。發(fā)現(xiàn)在PbX(X代表硫、硒)量子點和G-四面體/hemin之間能發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，并伴隨著氧氣的催化還原，從而導(dǎo)致PbX(X代表硫、硒)量子點修飾電極陰極光電流的明顯增大。選取不同序列的核酸作為識別探針，能實現(xiàn)對多種目標(biāo)物(DNA，凝血酶，三磷酸腺苷，單磷酸腺苷，鉛(II)離子)的無標(biāo)記、無底物和高靈敏檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：本發(fā)明的目的是提供一種高效簡便的多功能光電化學(xué)測定方法；尤其是提供PbX(X代表硫、硒)量子點修飾電極與G-四面體/hemin復(fù)合物在光電化學(xué)測定方面的新用途。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)措施來實現(xiàn)：a、以巰基己醇和帶有羧基的化合物共同作為表面修飾劑制備水溶性PbX(X代表硫、硒)量子點。具體步驟為：將一定量的巰基己醇和帶有羧基的化合物與水溶性鉛鹽溶液混合后，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為堿性；然后通入高純氮氣30min后，加入Na2S(或者NaHSe)水溶液，繼續(xù)通N2攪拌，在一定溫度下加熱反應(yīng)一定時間，得水溶性PbX(X代表硫、硒)量子點；b、將經(jīng)過預(yù)處理的ITO玻璃片浸在含有0.1mmol/LNaCl的2％PDDA聚合物的溶液中，10分鐘后用去離子水沖洗電極表面；然后再浸入到水溶性PbX(X代表硫、硒)量子點溶液中，10分鐘后用去離子水清洗電極表面。以上步驟可將PbX(X代表硫、硒)量子點修飾到ITO電極上。c、以制得的PbX(X代表硫、硒)量子點修飾的ITO電極作為工作電極，通過縮合反應(yīng)將捕獲核酸序列所帶NH2與電極表面PbX(X代表硫、硒)量子點表面的COOH共價相連，從而將捕獲探針固定到電極表面。具體操作為將PbX(X代表硫、硒)量子點修飾電極浸在含有20mgEDS和10mgNHS的1mL水溶液中反應(yīng)1小時，再用清洗液(含有0.02％Tween-20的0.01mol/LpH7.4的Tris-HCl緩沖溶液)沖洗電極表面。然后，滴加25μL1.0×10-6mol/L捕獲核酸序列在4度下反應(yīng)過夜，用清洗液沖洗電極表面；接著用25μL封閉液(含有0.1mol/LKCl、1.0mmol/L單乙醇胺或者0.02％Tween-20以及3％BSA的0.01mol/LTris-HCl(pH7.4)緩沖溶液)封閉30min以除去電極表面的活性位點，用清洗液沖洗；將電極放入含有0.05mol/LKCl和0.1mol/LNaCl的一定pH的緩沖溶液組成電解質(zhì)溶液中，以銀/氯化銀電極作為參比電極，鉑絲作為對電極，一定電位下在自制的光電化學(xué)測定儀器上進(jìn)行光電流測定。d、隨后，將電極表面加入不同濃度的待測目標(biāo)物和1.0×10-6mol/Lhemin后反應(yīng)30-60分鐘，用清洗液沖洗；將電極放入電解質(zhì)溶液中觀察光電流的變化情況。本發(fā)明所制備的水溶性PbX(X代表硫、硒)量子點修飾到ITO電極表面，然后固定捕獲探針，電極光照后可以產(chǎn)生陰極光電流但電流值較小；然而，當(dāng)加入待測目標(biāo)物和hemin后，電極表面形成穩(wěn)定的G-四面體/hemin復(fù)合物。該G-四面體/hemin復(fù)合物作為PbS量子點的電子受體并催化還原溶解氧，使得PbX(X代表硫、硒)量子點修飾電極的光電流強(qiáng)度明顯升高。并且，光電流增大程度與被測目標(biāo)物的含量呈線性關(guān)系。通過改變捕獲探針的堿基序列，可以將此傳感器應(yīng)用于多種不同目標(biāo)物的測定。本研究將p-型PbX(X代表硫、硒)量子點的優(yōu)異光電化學(xué)特性與G-四面體/hemin復(fù)合物巧妙結(jié)合，表現(xiàn)出了無標(biāo)記、無底物、靈敏度高、多功能的優(yōu)勢。本發(fā)明的目的還可通過如下技術(shù)措施來實現(xiàn)：所述的PbX(X代表硫、硒)納米材料合成時使用的表面修飾劑選自巰基己醇和帶有羧基的化合物組成的混合物，帶有羧基的化合物選自巰基乙酸，巰基丙酸，半胱氨酸，二巰基丁二酸，油酸，聚丙烯酸，表面修飾劑的總量為鉛離子的物質(zhì)的量的3-20倍，帶有羧基的化合物與巰基己醇的物質(zhì)的量之比為2∶1-25∶1；合成PbX(X代表硫、硒)納米材料時所選用的反應(yīng)溫度為50-100度，反應(yīng)時間為1-6小時；光電流測定時所使用的緩沖溶液為含有0.05 mol/LKCl和0.1mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖溶液，緩沖溶液的pH為6.0-9.0；光電流測定時采用的電壓為(-0.3)-(+0.3)V(相對于Ag/AgCl參比電極)；光電流測定時的目標(biāo)物為DNA，凝血酶(TB)，三磷酸腺苷(ATP)，單磷酸腺苷(AMP)，鉛(II)離子。附圖說明：圖1是發(fā)明制備的巰基己醇、巰基乙酸修飾的PbS量子點修飾電極在不同濃度的hemin存在下的光電流，從a到f曲線hemin的濃度依次為10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol/L。圖2是發(fā)明制備的巰基己醇、巰基乙酸修飾的PbS量子點修飾電極的光電流強(qiáng)度隨目標(biāo)DNA濃度變化的關(guān)系圖。圖3是在相同測定條件下，相同濃度的目標(biāo)DNA(10-14mol/L)及堿基序列錯配的DNA對PbS量子點修飾電極光電流的影響。圖4是發(fā)明制備的巰基己醇、聚丙烯酸修飾的PbS量子點修飾電極光電化學(xué)測定凝血酶的線性關(guān)系圖。具體實施方式：實施實例1：a、在含有0.045mmol的半胱氨酸、0.015mmol巰基己醇溶液與0.015mmol的Pb(CH3COO)2的溶液中，加入1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為9，通入高純氮氣30min后，加入15mL0.01mol/L的NaHSe水溶液，繼續(xù)通氮氣60度下攪拌反應(yīng)2h，得水溶性PbSe量子點；b、將經(jīng)過預(yù)處理的ITO玻璃片浸在含有0.1mmol/LNaCl的2％PDDA聚合物的溶液中，10分鐘后用去離子水沖洗電極表面；然后再浸入到水溶性PbSe量子點溶液中，10分鐘后用去離子水清洗電極表面。以上步驟可將PbSe量子點修飾到ITO電極上。c、將PbSe量子點修飾電極浸在含有20mgEDS和10mgNHS的1mL水溶液中反應(yīng)1小時，再用清洗液(含有0.02％Tween-20的0.01mol/LpH7.4的Tris-HCl緩沖溶液)沖洗電極表面。然后，滴加25μL1.0×10-6mol/L捕獲核酸序列在4度下反應(yīng)過夜，用清洗液沖洗電極表面；接著用25μL封閉液(含有0.02％Tween-20以及3％BSA的0.01mol/LTris-HCl(pH7.4)緩沖溶液)封閉30min以除去電極表面的活性位點，用清洗液沖洗；將電極放入含有0.05mol/LKCl和0.1mol/LNaCl的0.1mol/L的Tris-HCl(pH7.0)緩沖溶液中，以銀/氯化銀電極作為參比電極，鉑絲作為對電極，0V(相對于Ag/AgCl參比電極)下在自制的光電化學(xué)測定儀器上進(jìn)行光電流測定。d、隨后，將電極表面加入25μL不同濃度的凝血酶和1.0×10-6mol/Lhemin，反應(yīng)60分鐘后，用清洗液沖洗；最后，將電極放入含有0.05mol/LKCl和0.1mol/LNaCl的0.1mol/L的Tris-HCl(pH7.0)緩沖溶液中，0V(相對于Ag/AgCl參比電極)下觀察光電流的變化情況。實施實例2：a、17μL巰基乙酸、0.01mmol巰基己醇溶液與0.015mmol的Pb(CH3COO)2溶液混合后，加入1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為11，通入高純氮氣30min后，加入20mL0.01mol/L的Na2S水溶液，繼續(xù)通氮氣90度下攪拌反應(yīng)4h，得水溶性PbS量子點；b、將經(jīng)過預(yù)處理的ITO玻璃片浸在含有0.1mmol/LNaCl的2％PDDA聚合物的溶液中，10分鐘后用去離子水沖洗電極表面；然后再浸入到水溶性PbS量子點溶液中，10分鐘后用去離子水清洗電極表面。以上步驟可將PbS量子點修飾到ITO電極上。c、將PbS量子點修飾電極浸在含有20mgEDS和10mgNHS的1mL水溶液中反應(yīng)1小時，再用清洗液(含有0.02％Tween-20的0.01mol/LpH7.4的Tris-HCl緩沖溶液)沖洗電極表面。然后，滴加25μL1.0×10-6mol/L捕獲核酸序列在4度下反應(yīng)過夜，用清洗液沖洗電極表面；接著用25μL封閉液(含有0.1mol/LKCl、1.0mmol/L單乙醇胺的0.01mol/LTris-HCl(pH7.4)緩沖溶液)封閉30min以除去電極表面的活性位點，用清洗液沖洗；將電極放入含有0.05mol/LKCl和0.1mol/LNaCl的0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.5)緩沖溶液中，以銀/氯化銀電極作為參比電極，鉑絲作為對電極，-0.1V(相對于Ag/AgCl參比電極)下在自制的光電化學(xué)測定儀器上進(jìn)行光電流測定。d、隨后，將電極表面加入25μL不同濃度的目標(biāo)DNA和1.0×10-6mol/Lhemin，反應(yīng)60分鐘后，用清洗液沖洗；最后，將電極放入含有0.05mol/LKCl和0.1mol/LNaCl的0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.5)緩沖溶液中，-0.1V(相對于Ag/AgCl參比電極)下觀察光電流的變化情況。