口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種與口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物及其應(yīng)用。所述標(biāo)志物為GPD1L和/或HIF1α，特別是二者的組合。本發(fā)明中，通過檢測(cè)GPD1L和/或HIF1α的表達(dá)水平，可進(jìn)行口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)。
【專利說明】口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與口腔鱗狀細(xì)胞癌和/或口咽鱗狀細(xì)胞 癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)相關(guān)的蛋白標(biāo)志物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在我國(guó)，口腔口咽癌90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)近年來有逐漸上升 的趨勢(shì)。因位于呼吸道與消化道的重要位置，在人體語言、進(jìn)食、呼吸方面都起到重要作 用，病變嚴(yán)重者可造成毀容、吞咽、咀嚼、發(fā)音等功能障礙，影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及 生命。口腔口咽鱗癌患者的診斷和治療現(xiàn)狀如下：①手術(shù)為主的治療是唯一治愈手段， 該腫瘤對(duì)放化療僅中度敏感；②盡管診斷和治療手段不斷進(jìn)步，長(zhǎng)期生存率始終徘徊在 50% -60%，很難繼續(xù)改善；③頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是口腔口咽鱗癌患者最重要的預(yù)后因子；④ 約30% -40%的患者在初次就診時(shí)已伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；⑤目前尚無高效的臨床及分子 標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)口腔口咽鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
[0003] 近年來，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為認(rèn)識(shí)的提高，已經(jīng)證實(shí)口腔鱗癌頸部 轉(zhuǎn)移的內(nèi)因是分子水平異常的結(jié)果，診斷和治療新策略的產(chǎn)生有賴于對(duì)頸部轉(zhuǎn)移生物學(xué)行 為相關(guān)的功能基因和蛋白進(jìn)行全面、系統(tǒng)的研究。在后基因組時(shí)代，認(rèn)識(shí)到蛋白是身體的役 馬（work horse)。不同代謝途徑都是通過蛋白來表現(xiàn)。因此，可以使用在口腔口咽鱗癌早 期表達(dá)的獨(dú)特且特異的蛋白作為生物標(biāo)志物，通過引入分子分型診斷方法輔助臨床篩選頸 部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高?；颊?，從而為開發(fā)新的頸部轉(zhuǎn)移診斷技術(shù)，為患者個(gè)體化外科治療提供 堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和微陣列技術(shù)的出現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用基因芯片 技術(shù)對(duì)多種惡性腫瘤（如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、甲狀腺癌等） 進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，分別篩選出了多個(gè)可能與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的候選基因； 對(duì)這些腫瘤相關(guān)基因功能的深入研究和最終確定，能在一定程度上揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的 分子機(jī)制，為癌癥新型診斷方法、藥物治療靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和預(yù)后預(yù)測(cè)提供研究基礎(chǔ)。2007年以 來，國(guó)際上已經(jīng)有多個(gè)實(shí)體腫瘤（包括前列腺癌、乳腺癌等）的分子診斷/分子分型商品化 試劑盒上市，大多已經(jīng)通過FDA認(rèn)證；然而到目前為止，口腔口咽鱗癌轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚無有 效的商品化分子診斷產(chǎn)品問世，口腔口咽鱗癌的個(gè)體化診斷和治療迫切需要對(duì)新的關(guān)鍵基 因進(jìn)行深入的研究。
[0004] 缺氧誘導(dǎo)因子la (HIF-la)作為腫瘤乏氧調(diào)控的核心成員，一些證據(jù)表明 HIF-la與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其過表達(dá)可明顯促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移（Tsai Y P, Wu K J. Hypoxia-regulated target genes implicated in tumor metastasis, J Biomed Sci，2012, 19:102 ;Vered M, Dayan D，Yahalom R，et al. Cancer-associated fibroblasts and epithelial-mesenchymal transition in metastatic oral tongue squamous cell carcinoma, Int J Cancer, 2010, 127(6) :1356-1362 ；Yang Μ H, Wu Μ Z,Chiou S H, et al.Direct regulation of TWIST by HIF-lalpha promotes metastasis，Nat Cell Biol，2008, 10(3) :295-305);然而，也有許多研究表明，HIF-Ια在許多腫瘤中表達(dá)與轉(zhuǎn)移 無明顯相關(guān)性，甚至有報(bào)道該分子可以啟動(dòng)凋亡，某些條件下和特定腫瘤中具有抑癌作用 (Cabanillas R, Rodrigo JP, Secades P,et al. The relation between hypoxia-inducible factor(HIF)-lalpha expression with p53expression and outcome in surgically treated supraglottic laryngeal cancer. J Surg Oncol. 2009,99(6) :373-8 ;Fillies T, Werkmeister R, van Diest PJ，et al. HIFl-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage squamous cell carcinomas of the oral floor BMC Cancer. 2005,21 ;5:84 ;Munipalle PC，Viswanath YK，Davis PA，et al. Prognostic value of hypoxia inducible factor lain esophageal squamous cell carcinoma.Dis Esophagus. 2011，24(3) :177-81)。這與HIF-1 α在腫瘤特定時(shí)空條件下發(fā)揮作用的特定信 號(hào)通路和其上下游調(diào)控分子密切相關(guān)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中未發(fā)現(xiàn)能用于預(yù)測(cè)口腔口咽鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且具有高敏感度和 特異度的生物標(biāo)志物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種能用于預(yù)測(cè)口腔口咽鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生 物標(biāo)志物，并提供所述的生物標(biāo)志物及其相關(guān)檢測(cè)試劑的應(yīng)用，特別是用于口腔口咽鱗狀 細(xì)胞癌輔助診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋 巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)，具有高敏感度和特異度。
[0007] 為了尋找一種能用于預(yù)測(cè)口腔口咽鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，本案發(fā)明 人在前期課題研究中基因表達(dá)譜芯片篩選基礎(chǔ)之上，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 初步篩選出78個(gè)口腔鱗癌相關(guān)基因，并經(jīng)進(jìn)一步的摸索實(shí)驗(yàn)及分析研究，發(fā)現(xiàn)了 GPD1L基 因是一個(gè)新的口腔鱗癌下調(diào)基因，其在口腔口咽鱗癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)。此后在對(duì)120 例口腔鱗癌和120例正?？谇火つそM織標(biāo)本中78個(gè)口腔鱗癌相關(guān)基因的real-time PCR 檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)GPD1L基因在97. 6%的口腔鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)GPD1L與 HIF-la調(diào)控密切相關(guān)，GPD1L與HIFla基因表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)。最終確定了 GPD1L 與HIF-1 a可以作為口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、 和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。
[0008] 本發(fā)明中，除明確說明外，所述GPD1L包括GPD1L基因和/或GPD1L蛋白；所述 HIF-la包括HIF-la基因和/或HIF-la蛋白。所述口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌包括口腔鱗狀 細(xì)胞癌和/或口咽鱗狀細(xì)胞癌。通常情況下，所述的"高表達(dá)"、"低表達(dá)"是相對(duì)于正常人 相應(yīng)組織中的表達(dá)水平而言。
[0009] GPD1L基因定位于人染色體3p22. 3區(qū)段，與甘油-3-磷酸脫氫酶基因具有84% 的同源序列，包含8個(gè)外顯子。該基因最初于2002年哺乳動(dòng)物基因組計(jì)劃時(shí)被發(fā)現(xiàn)， 但當(dāng)時(shí)并不了解GPD1L有何生理功能。2007年，London等發(fā)現(xiàn)該基因突變與一種嚴(yán) 重的心源性猝死性疾?。˙rugada綜合癥）的發(fā)生有關(guān)，該疾病的主要致病機(jī)理是鈉離 子通道基因異常。GPD1L可以直接或間接與心臟鈉離子通道的穿孔素 α亞單位偶聯(lián) (Pore-forming a-subunit of the cardiac sodium channel，SCN5A)，并對(duì)其發(fā)揮調(diào)控 作用，GPD1L突變可通過自身失活或中斷與SCN5A的偶聯(lián)從而對(duì)心臟鈉離子通道起到拮 抗作用，具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步證實(shí)。因此，目前以GPD1L為主題的研究主要集中在 心律失常領(lǐng)域，除了心臟組織外，GPD1L在其他組織中的分布及其生理功能目前尚不清 楚，有學(xué)者甚至認(rèn)為GPD1L的生理功能是心臟特異性的（London B，Michalec M，Mehdi H, et al. Mutation in glycerol-3-phosphate dehydrogenase Hike gene (GPD1-L) decreases cardiac Na+current and causes inherited arrhythmias, Circulation, 200 7, 116:2260-2268 ；Valdivia CR, Ueda K, Ackerman MJ, et al. GPD1L links redox state to cardiac excitability by PKC-dependent phosphorylation of the sodium channel SCN5A, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297: H1446-1452)。近來，一項(xiàng)體外 研究發(fā)現(xiàn)，GPD1L還是逆向調(diào)節(jié)HIF-Ια降解和穩(wěn)定的重要調(diào)控因子（Fong GH，Takeda K.Role and regulation of prolyl hydroxylase domain proteins, Cell Death Differ, 2008, 15:635 - 641)，該蛋白可以通過增強(qiáng)脯氨酰輕化酶（prolyl hydroxylase, PHD)活性使HIF-Ια的兩個(gè)重要的脯氨酸殘基（脯氨酸402和564)發(fā)生羥基化，從而 降低了 HIF-Ια的穩(wěn)定性，致使羥基化后的HIF-Ια迅速與E3泛素連接酶相結(jié)合，并 被蛋白酶體降解，但目前為止，GPD1L對(duì)HIF-Ια羥基化調(diào)節(jié)的具體機(jī)制并不清楚（Min JH, Yang H, Ivan M, et al. Structure of an HIF-lalpha-pVHL complex:hydroxyproline recognition in signaling, Science, 2002, 296:1886 - 1889 ；Kelly TJ, Souza AL, Clish CB, et al. A hypoxia-induced positive feedback loop promotes hypoxia-inducible factor lalpha stability through miR-210suppression of glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1-like, Mol Cell Biol,2011，31:2696-2706)。
[0010] 本案發(fā)明人在研究中，通過制備口腔口咽鱗癌患者術(shù)后病理石蠟組織連續(xù)切片 (4 μ m)，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)每例組織標(biāo)本中GPD1L和HIF-1 α蛋白表達(dá)水平，將 口腔口咽鱗癌患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與石蠟組織標(biāo)本中的GPD1L和HIF-1 α蛋白表達(dá)水平 關(guān)聯(lián)，通過進(jìn)一步的研究分析，證實(shí)了 GPD1L和/或HIF-1 α可以作為口腔口咽鱗狀細(xì)胞 癌輔助診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)GPD1L和/或HIF-1 α的表達(dá)水平，可以為口腔口咽鱗 狀細(xì)胞癌輔助診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)提供依據(jù)。特別是，這兩種生物標(biāo)志物聯(lián)合在口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù) 后判斷、以及預(yù)測(cè)口腔口咽鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移效率上具有協(xié)同作用。具體而言，GPD1L 與HIFla表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，GPD1L低表達(dá)同時(shí)HIF-Ια高表達(dá)患者是口腔口咽鱗 癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危人群，而GPD1L高表達(dá)同時(shí)HIF-1 α低表達(dá)患者是口腔口咽鱗癌 頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低危人群。當(dāng)GPD1L與HIFla用于判斷口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù) 后，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，GPD1L高表達(dá)/HIF1 α低表達(dá)患者明顯較GPD1L低表達(dá)/ HIFla高表達(dá)者獲得更好的無病生存及癌相關(guān)生存，GPD1L和HIFla表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)效率明 顯高于兩種蛋白單獨(dú)預(yù)測(cè)，具有最強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值。
[0011] 從而，一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)GPD1L和/或HIF1 α的表達(dá)水平的試劑在制備 用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽 鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的組合物中的應(yīng)用。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的表達(dá)水平包括檢測(cè) GPD1L和/或HIFla的基因表達(dá)水平，或者檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的蛋白表達(dá)水平。 可以采用所屬領(lǐng)域中已知的任何可行方法，例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP)、反轉(zhuǎn) 錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)、熒光原位雜交法（FISH)、放射性免疫分析、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法、 Western印跡分析法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、免疫組化等，檢測(cè)來自待測(cè)個(gè)體的樣品中 GPD1L和/或HIFla的表達(dá)水平。所述的檢測(cè)試劑即為這些檢測(cè)方法中用到的試劑，包括 但不限于蛋白、核酸、碳水化合物等。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的表達(dá)水平包括采用免 疫組化方法檢測(cè)來自待測(cè)個(gè)體的石蠟組織切片中GPD1L蛋白表達(dá)水平和/或HIF1 a蛋白 表達(dá)水平。該具體實(shí)施方案中所述的檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的表達(dá)水平的試劑即免疫 組化方法所用到的檢測(cè)試劑。具體而言，檢測(cè)GPD1L蛋白表達(dá)水平的試劑包括GPD1L蛋白 的抗體，檢測(cè)HIFla蛋白表達(dá)水平的試劑包括HIFla蛋白的抗體，所述的抗體可以是單克 隆抗體或多克隆抗體，這些抗體可以商購(gòu)或是按照現(xiàn)有技術(shù)的方法自行制備得到。
[0014] 在本發(fā)明的一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，GPD1L蛋白表達(dá)水平按以下公式計(jì)算評(píng)分，并 以GPD1L蛋白表達(dá)評(píng)分100作為閾值，評(píng)分〈100為低表達(dá)，評(píng)分彡100為高表達(dá)：
[0015] GPD1L 蛋白表達(dá)評(píng)分=PXIX100，
[0016] 其中：P為檢測(cè)樣本切片的陽性表達(dá)面積百分比（％)，
[0017] I為染色強(qiáng)度評(píng)分，陰性或弱陽性為1，陽性為2,強(qiáng)陽性為3。
[0018] 在本發(fā)明的一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，HIFla蛋白表達(dá)水平是以10%細(xì)胞核陽性 作為閾值，陽性細(xì)胞核〈10%為低表達(dá)，陽性細(xì)胞核彡10%為高表達(dá)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的技術(shù)用于預(yù)測(cè)待測(cè)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì) 胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，HIF1 a高表達(dá)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高 于HIF1 a低表達(dá)個(gè)體；GPD1L低表達(dá)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高于 GPD1L高表達(dá)個(gè)體。當(dāng)采用GPD1L聯(lián)合HIF1 a表達(dá)預(yù)測(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，GPD1L與HIF1 a 蛋白表達(dá)有呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，GPD1L低表達(dá)且HIF1 a高表達(dá)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌 頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高于GPD1L高表達(dá)且HIF1 a低表達(dá)個(gè)體。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的技術(shù)用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判 斷時(shí)，HIFla低表達(dá)的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存及癌相關(guān)生存好于HIFla高表 達(dá)個(gè)體；GPD1L高表達(dá)的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存及癌相關(guān)生存好于GPD1L低表 達(dá)個(gè)體。GPD1L高表達(dá)且HIF1 a低表達(dá)的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存及癌相關(guān)生存 好于GPD1L低表達(dá)且HIFla高表達(dá)個(gè)體。GPD1L與HIFla兩種標(biāo)志物表達(dá)水平協(xié)同分析 具有最強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、預(yù)后判斷、和 /或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的組合物，該組合物包括：檢測(cè)GPD1L以及HIF1 a表達(dá)水平的試 齊U。所述的檢測(cè)GPD1L以及HIFla表達(dá)水平的試劑可以是所屬領(lǐng)域中已知的任何可檢測(cè) 來自個(gè)體的待測(cè)樣品中GPD1L表達(dá)水平以及HIFla表達(dá)水平的試劑，例如前述的用于采 用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光原位雜交法、放射性免疫分 析、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法、Western印跡分析法、酶聯(lián)免疫吸附法或免疫組化等方法檢測(cè)GPD1L表 達(dá)水平以及HIF1 a表達(dá)水平的試劑。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、預(yù)后判斷、和 /或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括：檢測(cè)GPD1L和/或HIF1 a表達(dá)水平的試 齊U。所述的檢測(cè)GPD1L和/或HIFla表達(dá)水平的試劑可以是所屬領(lǐng)域中已知的任何可檢 測(cè)來自個(gè)體的待測(cè)樣品中GPD1L表達(dá)水平和/或HIF1 α表達(dá)水平的試劑，例如前述的用于 采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光原位雜交法、放射性免疫 分析、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法、Western印跡分析法、酶聯(lián)免疫吸附法或免疫組化等方法檢測(cè)GPD1L 表達(dá)水平和/或HIFla表達(dá)水平的試劑。在本發(fā)明的一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè) GPD1L和/或HIF1 a表達(dá)水平的試劑為采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)來自待測(cè)個(gè)體的石蠟組 織標(biāo)本中GPD1L和/或HIF1 a表達(dá)水平的試劑，這樣的檢測(cè)GPD1L表達(dá)水平的試劑通常包 括GPD1L的抗體，檢測(cè)HIF1 a表達(dá)水平的試劑通常包括HIF1 a的抗體。
[0023] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于治療口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌、和/或抑制口腔 口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組合物，該組合物含有：提高口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者 GPD1L表達(dá)水平的試劑，和/或降低口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者HIFla表達(dá)水平的試劑。本 發(fā)明中，由于GPD1L表達(dá)下降和HIF-1 a表達(dá)上升指示口腔口咽鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存 在，因此它們可能是癌瘤轉(zhuǎn)移的必需組分。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)相，有計(jì)劃地調(diào)控上述蛋白的表達(dá)很 可能抑制口腔口咽鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移，從而提高患者預(yù)后。
[0024] 綜上所述，本發(fā)明提供了兩種呈負(fù)相關(guān)表達(dá)并具有協(xié)同預(yù)測(cè)作用的生物標(biāo)志物 GPD1L和HIF-1 a，通過檢測(cè)其表達(dá)水平情況可以用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、口腔 口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)，也可作 為抗癌藥物的標(biāo)靶用于治療目的，本發(fā)明的標(biāo)志物具有高敏感度和特異度，對(duì)于口腔口咽 鱗癌頸部淋巴轉(zhuǎn)移高危患者進(jìn)行大規(guī)模篩查具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1A :頸清組GPD1L表達(dá)與無病生存的Kaplan-Meier曲線。
[0026] 圖1B :頸清組GPD1L表達(dá)與癌相關(guān)生存的Kaplan-Meier曲線。
[0027] 圖2A :頸清組HIF1 α表達(dá)與無病生存的Kaplan-Meier曲線。
[0028] 圖2B :頸清組HIF1 α表達(dá)與癌相關(guān)生存的Kaplan-Meier曲線。
[0029] 圖3A :頸清組GPD1L與HIF1 α表達(dá)協(xié)同作用與無病生存的Kaplan-Meier曲線。
[0030] 圖3B :頸清組GPD1L與HIF1 α表達(dá)協(xié)同作用與癌相關(guān)生存的Kaplan-Meier曲線。
[0031] 圖4 :GPD1L與HIF1 α蛋白表達(dá)典型圖片。兩者表達(dá)呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)性 Correlation coefficient: -0.341，Ρ〈0· 001，且 GPD1L 低表達(dá)同時(shí)HIFla 高表達(dá)患者是 早期口腔鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危人群。
[0032] 圖5A :驗(yàn)證組GPD1L表達(dá)與無病生存的Kaplan-Meier曲線。
[0033] 圖5B :驗(yàn)證組GPD1L表達(dá)與癌相關(guān)生存的Kaplan-Meier曲線。
[0034] 圖6A :驗(yàn)證組HIF1 α表達(dá)與無病生存的Kaplan-Meier曲線。
[0035] 圖6B :驗(yàn)證組HIF1 α表達(dá)與癌相關(guān)生存的Kaplan-Meier曲線。
[0036] 圖7A :驗(yàn)證組GPD1L與HIF1 α表達(dá)協(xié)同作用與無病生存的Kaplan-Meier曲線。
[0037] 圖7B :驗(yàn)證組GPD1L與HIF1 α表達(dá)協(xié)同作用與癌相關(guān)生存的Kaplan-Meier曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作、或按照制造廠商所建議的操作條件進(jìn)行。
[0039] 實(shí)施例1、GPD1L及HIF1 α蛋白表達(dá)及其與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析驗(yàn)證 [0040] (1)臨床病例選取
[0041] 隨機(jī)選取北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科1993年6月-2010年5月住院 治療并接受同期頸清掃術(shù)的原發(fā)口腔鱗癌患者125例，臨床分期為I -IV期（UICC/ AJCC. 7ed.，2010)，作為頸清組，進(jìn)行頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物分析。
[0042] 另隨機(jī)選取頸部"坐觀"的原發(fā)早期口腔鱗癌病例106例，臨床分期（I - II期）， 作為驗(yàn)證組，觀察該組患者延遲性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，重點(diǎn)檢驗(yàn)"頸清組"中已經(jīng)鑒定的分 子標(biāo)志物在指導(dǎo)早期口腔鱗癌頸部治療上的價(jià)值。
[0043] 隨訪截止日期為2013年6月1日，頸清組中生存患者的中位隨訪時(shí)間為73個(gè)月 (四分位數(shù)：68. 3-103個(gè)月），觀察組中生存患者的中位隨訪時(shí)間為62個(gè)月（四分位數(shù)： 52-91個(gè)月）。所有患者均簽署知情同意書并匿名編號(hào)，臨床病理學(xué)資料經(jīng)查詢既往臨床病 歷獲得，所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療，且全身檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
[0044] (2)治療方案
[0045] 頸清組：原發(fā)腫瘤擴(kuò)大切除+頸淋巴清掃術(shù)土修復(fù)重建術(shù)土術(shù)后放療。
[0046] 驗(yàn)證組：原發(fā)腫瘤擴(kuò)大切除土修復(fù)重建術(shù)。
[0047] 放療：pN+的頸清組患者在術(shù)后2-6周內(nèi)接受放射治療，采用常規(guī)（或調(diào)強(qiáng)）五 分割放療方式，每周一至周五，每次劑量為200 cGy?？倓┝繛椋涸l(fā)灶及淋巴結(jié)陽性頸部 >6000 cGy;淋巴結(jié)陰性頸部>5000 cGy;如果原發(fā)灶切緣陽性>6500 cGy。觀察組患者頸部 未行預(yù)防性放療。
[0048] 頸部復(fù)發(fā)或延遲性轉(zhuǎn)移治療：全頸清掃術(shù)土術(shù)后放療。
[0049] (3)檢測(cè)試劑材料
[0050] 所有切片為4微米厚連續(xù)切片，共231例，行GPD1L及HIFla蛋白免疫組化檢測(cè)。 GPD1L蛋白的免疫組化一抗采用瑞典Atlas公司的兔多克隆抗體（HPA035284，1:50稀釋）； HIFla蛋白免疫組化一抗采用美國(guó)Novus Biologicals公司的鼠單克隆抗體（NB100-105， 1:200稀釋）。其他除非另有說明，否則免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)所有使用的試劑均來自北京中杉 金橋生物技術(shù)有限公司。
[0051] (4)實(shí)驗(yàn)方法
[0052] 石蠟組織標(biāo)本烤片50_60°C，2-3小時(shí)以上；常規(guī)脫蠟至水化，二甲苯I、II、III各 10分鐘，無水乙醇，95 %，85 %，75 %乙醇，各2分鐘，水洗2分鐘；PBS洗3分鐘X 3次，3 % H202作用20分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗3分鐘X 3次；將切片置于pH6. 0 的檸檬酸緩沖液中，l〇〇°C水浴煮沸20分鐘，自然冷卻至室溫；PBS洗3分鐘X3次；1%正 常馬血清封閉，室溫孵育1小時(shí)；按預(yù)定濃度加一抗，4°C孵育過夜；次日PBS洗3分鐘X3 次；加入二抗，室溫下孵育1小時(shí)；PBS洗3分鐘X3次；0. 04% DAB顯色1-5分鐘，鏡下控 制顯色；自來水洗，復(fù)染（蘇木素襯染2分鐘，水洗，鹽酸酒精分化2秒，水洗分化30分鐘）； 脫水，常規(guī)樹脂封片。
[0053] (5)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0054] 所有切片的陽性表達(dá)面積（P)采用IPP 6. 0軟件的手動(dòng)計(jì)數(shù)方法評(píng)分；染色強(qiáng)度 (I)評(píng)分為：1 (陰性或弱陽性），2 (陽性）及3 (強(qiáng)陽性）三級(jí)。每張切片評(píng)分均采用10個(gè) 隨機(jī)高倍視野下至少1000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分，最終評(píng)分結(jié)果再由2名獨(dú)立的病理專家進(jìn)行評(píng) 估，如對(duì)高低表達(dá)評(píng)判有爭(zhēng)議，要經(jīng)過討論得出最后結(jié)論。最終評(píng)分結(jié)果取10個(gè)視野的評(píng) 分平均值作為最終結(jié)果。GPD1L蛋白表達(dá)評(píng)分=P X I X 100,并以評(píng)分的中位數(shù)100作為閾 值，將所有患者表達(dá)分為低表達(dá)（評(píng)分〈100)和高表達(dá)（評(píng)分> 100)兩組。HIFla蛋白表 達(dá)評(píng)分參照以往同類研究方法僅計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，以10%細(xì)胞核陽性作為閾值將所有 患者分為低表達(dá)（陽性細(xì)胞核〈10% )和高表達(dá)（陽性細(xì)胞核> 10% )。
[0055] (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0056] 本發(fā)明中，采用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。"頸清組"與"驗(yàn)證組"各項(xiàng) 臨床病理學(xué)參數(shù)（除發(fā)病年齡外）轉(zhuǎn)化為計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析；兩組發(fā)病年齡比 較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。GPD1L與HIF1 a蛋白表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理學(xué)參數(shù)比較及其與淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后延遲性轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析均采用卡方檢驗(yàn)。對(duì)于生存分析，計(jì)算無病生存和癌 相關(guān)生存，單因素分析應(yīng)用Kaplan-Meier檢驗(yàn)進(jìn)行分析，進(jìn)而應(yīng)用多因素生存分析對(duì)無病 生存和癌相關(guān)生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0057] (7)頸清組檢測(cè)結(jié)果
[0058] 125例入選的頸清組患者的相關(guān)原始資料參見表1，各項(xiàng)基線資料與頸部淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析見表2。
[0059] 表1.用于本發(fā)明的125例頸清組患者原始資料
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的表達(dá)水平的試劑在制備用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助 診斷、口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷、和/或口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù) 測(cè)的組合物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，檢測(cè)GPD1L和/或HIF1 a的表達(dá)水平包括檢測(cè) GPD1L和/或HIFla的基因表達(dá)水平，或者檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的蛋白表達(dá)水平。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，檢測(cè)GPD1L和/或HIFla的表達(dá)水平包括采用 免疫組化方法檢測(cè)來自待測(cè)個(gè)體的石蠟組織切片中GPD1L蛋白表達(dá)水平和/或HIF1 a蛋 白表達(dá)水平。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中， GPD1L蛋白表達(dá)水平按以下公式計(jì)算評(píng)分，并以GPD1L蛋白表達(dá)評(píng)分100作為閾值，評(píng) 分〈100為低表達(dá)，評(píng)分> 100為高表達(dá)： GPD1L蛋白表達(dá)評(píng)分=PXIX100， 其中：P為檢測(cè)樣本切片的陽性表達(dá)面積百分比， I為染色強(qiáng)度評(píng)分，陰性或弱陽性為1，陽性為2,強(qiáng)陽性為3 ; HIFla蛋白表達(dá)水平是以10%細(xì)胞核陽性作為閾值，陽性細(xì)胞核〈10%為低表達(dá)，陽 性細(xì)胞核彡10 %為高表達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中： HIFla高表達(dá)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高于HIFla低表達(dá)個(gè) 體；GPD1L低表達(dá)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高于GPD1L高表達(dá)個(gè)體； GPD1L低表達(dá)且HIF1 a高表達(dá)個(gè)體的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高于GPD1L 高表達(dá)且HIF1 a低表達(dá)個(gè)體； HIFla低表達(dá)的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存及癌相關(guān)生存好于HIFla高表達(dá) 個(gè)體；GPD1L高表達(dá)的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存及癌相關(guān)生存好于GPD1L低表達(dá) 個(gè)體；GPD1L高表達(dá)且HIF1 a低表達(dá)的口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存及癌相關(guān)生存好 于GPD1L低表達(dá)且HIFla高表達(dá)個(gè)體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為早期口 腔口咽鱗狀細(xì)胞癌延遲性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；所述口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌包括口腔鱗狀細(xì)胞癌 和/或口咽鱗狀細(xì)胞癌。
7. -種用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、預(yù)后判斷、和/或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的 組合物，該組合物包括： 檢測(cè)GPD1L以及HIF1 a表達(dá)水平的試劑。
8. -種用于口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌輔助診斷、預(yù)后判斷、和/或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的 試劑盒，該試劑盒包括： 檢測(cè)GPD1L和/或HIF1 a表達(dá)水平的試劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述檢測(cè)表達(dá)水平的試劑為采用免疫組織化 學(xué)技術(shù)檢測(cè)來自待測(cè)個(gè)體的石蠟組織標(biāo)本中GPD1L和/或HIF1 a表達(dá)水平的試劑；優(yōu)選包 括GPD1L的抗體和/或HIF1 a的抗體。
10. -種用于治療口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌、和/或抑制口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移的組合物，該組合物含有： 提高口腔口咽鱗狀細(xì)胞癌患者GPD1L表達(dá)水平的試劑，和/或降低口腔口咽鱗狀細(xì)胞 癌患者HIFla表達(dá)水平的試劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104267191SQ201410455666
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】馮芝恩, 郭傳瑸 申請(qǐng)人:北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院