一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板及其制作方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板，氧化硅芯板一面是納米結(jié)構(gòu)，其納米空隙在40－100納米之間，在芯板納米結(jié)構(gòu)一面，涂有一層抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑、有耐高溫、摩擦系數(shù)極低的高分子材料；高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選；應(yīng)用于醫(yī)藥靶點(diǎn)小分子的分析檢測和篩選；藥物動(dòng)力學(xué)和藥理篩查；藥物毒理篩查；多重不同分子結(jié)構(gòu)小分子的同時(shí)檢測和篩選；核心是以納米結(jié)構(gòu)靶板為載體，表面激光解析質(zhì)譜掃描為檢測手段，可達(dá)到傳統(tǒng)高分辨率液相及氣相色譜的靈敏度，一天可完成傳統(tǒng)質(zhì)譜聯(lián)用篩選平臺(tái)1-2個(gè)月的工作，在成本上大大降低了原始科研成本，可被檢測和篩選的應(yīng)用對(duì)象廣泛。
【專利說明】一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板及其制作方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本技術(shù)屬于分析化學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及表面激光解析質(zhì)譜領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]表面激光解析質(zhì)譜是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其中以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)為最重要的實(shí)例，此項(xiàng)發(fā)明獲得過諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。主要由兩部分組成:基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，在電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測離子。MALD1-T0F-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測試手段。
[0003]然而，以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜為首的所有基于表面激光解析的質(zhì)譜都需要將樣品制備在特制靶板上面，其操作是將樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而被檢測，即通過離子的質(zhì)量電荷之比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量。焦點(diǎn)問題就在于通用的基質(zhì)分子的分子量在1000-3000da，造成了過量的背景質(zhì)譜峰。這就決定了所有此類基于表面激光解析的質(zhì)譜分析只能適用于大分子檢測，比如蛋白質(zhì)，長鏈多肽，核酸，高分子材料等等，而不能應(yīng)用于小分子檢測(分子量小于100da)，或者說基于表面激光解析的質(zhì)譜分析的高靈敏度/高通量等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)無法施展在小分子分析檢測上面.而分子量小于100da的小分子卻是對(duì)人類最重要的最具應(yīng)用價(jià)值的一類化學(xué)產(chǎn)品，例如95%以上的藥物小分子，所有的氨基酸，維生素等等和人類生活健康相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)。
[0004]目前現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)小分子檢測和篩選還停留在光譜法檢測，例如熒光發(fā)光檢測或者衍生出可以熒光檢測的底物，但此類檢測要求目標(biāo)小分子分子結(jié)構(gòu)具有光活性集團(tuán)，另一弊端就是往往光度法靈敏度較低，檢測不到微量的小分子濃度。液相質(zhì)譜(LC-MS)及氣相質(zhì)譜(GC-MS)的已經(jīng)開始應(yīng)用在小分子的檢測和高通量篩選。但需要消耗大量的人力和溶劑耗材，而且一個(gè)樣品從制備到質(zhì)譜分析再到出結(jié)果需要相當(dāng)長一個(gè)過程，根據(jù)要求不同，分析一個(gè)樣品從樣品制備到拿到結(jié)果需要30-60分鐘，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代生物醫(yī)藥發(fā)展的高通量篩選要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對(duì)小分子(分子量小于3000da)的定性定量分析檢測和高通量篩選。既達(dá)到液相質(zhì)譜(LC-MS)及氣相質(zhì)譜(GC-MS)在分析檢測小分子的高靈敏度，高準(zhǔn)確度的檢測能力，又具備表面激光解析質(zhì)譜快速高通量分析的特性。
[0006]技術(shù)方案:一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板，氧化硅芯板一面是納米結(jié)構(gòu)，其納米空隙在40 - 100納米之間，在芯板納米結(jié)構(gòu)一面，涂有一層抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑、有耐高溫、摩擦系數(shù)極低的高分子材料。其制作方法如下:
[0007]①將氧化硅芯板單面拋光，達(dá)到電阻率0.01-0.02歐姆厘米；
[0008]②將拋光的原始芯板切割成根據(jù)需要的大?。?br> [0009]③用體積比為75 %硫酸和體積比為I % — 3 %的氫氟酸混合物侵泡表面5分鐘，同時(shí)加以5v電壓30分鐘，幫助芯板整體表面納米結(jié)構(gòu)化，其納米空隙在40 - 100納米之間；
[0010]④使用離子純凈水清洗N次，N蘭2 ;
[0011]⑤晾干；
[0012]⑥在芯板表面均勻涂上一層抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑、有耐高溫、摩擦系數(shù)極低的高分子材料。
[0013]高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選；應(yīng)用于醫(yī)藥靶點(diǎn)小分子的分析檢測和篩選；藥物動(dòng)力學(xué)和藥理篩查；藥物毒理篩查；多重不同分子結(jié)構(gòu)小分子的同時(shí)檢測和篩選。
[0014]樣品制備:包括細(xì)胞培養(yǎng)液樣品制備試劑盒或細(xì)囷培養(yǎng)液樣品制備試劑盒或血液樣品制備試劑盒或水各易樣品制備試劑盒；
[0015]樣品分析步驟:①根據(jù)不同小分子檢測對(duì)象加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液離心，取上清液點(diǎn)在靶板上，放進(jìn)ABI 5800 MALD1-T0F或者其他表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測。
[0016]細(xì)胞培養(yǎng)液樣品制備試劑盒，具體步驟如下:將細(xì)胞培養(yǎng)液樣本放置室溫，充分解凍；加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心；收集上清液；基本裂解液為QLl或QL2，QLl物質(zhì)組成及體積比為:10-30%甲醇、70-90%乙氰、1-7%甲酸；QL2物質(zhì)組成及體積比為:10-50%甲醇、50-90%乙氰、1-7%甲酸；
[0017]血液樣品制備試劑盒，具體步驟如下:將血液樣本放置室溫，充分解凍；加入抗凝劑抗凝，離心得血漿；加入基本裂解液QL3經(jīng)沉淀蛋白，離心后收集上清液；QL3物質(zhì)組成及體積比為:80-100%乙氰，1-7%甲酸;
[0018]水容易樣品制備試劑盒，，具體步驟如下:將水溶液樣本放置室溫，充分解凍；力口入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液QL4，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心，收集上清液；QL4物質(zhì)組成及體積比為:50-100%甲醇，體積比1-7%的甲酸；
[0019]增強(qiáng)電離緩沖液QLBA:若待測目標(biāo)小分子是酸性結(jié)構(gòu)，PH<4.加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLBl ;充分混合后，取樣品點(diǎn)在靶板上即可送入表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸；
[0020]增強(qiáng)電離緩沖液QLBB:待測目標(biāo)小分子是堿性性結(jié)構(gòu)，PH>8.加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLB2 ;充分混合后，取樣品點(diǎn)在靶板上即可送入表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析；QLB2物質(zhì)組成及體積比為:100%離子水，1-7%甲酸。
[0021]針對(duì)小肽分子檢測的樣品制備試劑QLP和方法:用權(quán)利要求5中任一裂解液進(jìn)行裂解制備樣本，取上清后，加入同等體積的制備試劑QLP ;充分混合；取溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置后進(jìn)樣檢測；QLP物質(zhì)組成及體積比為:70-90%離子水，10-30%甲醇，1-5%甲酸；
[0022]氨基酸分子檢測的樣品制備試劑QLA和方法:用權(quán)利要求5中任一裂解液進(jìn)行裂解制備樣本，取上清后，加入同等體積的制備試劑QLA ;充分混合；取溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置后進(jìn)樣檢測；QLA物質(zhì)組成及體積比為:30%離子水，30-50%甲醇，20-40%正丙醇1-5%甲酸；
[0023]脂肪酸分子檢測的樣品制備試劑QLF和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLF，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLF物質(zhì)組成及體積比為:50-90%甲醇，10-50毫摩爾的氨水；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸；
[0024]膽堿及脂類分子檢測的樣品制備試劑QLPC和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLPC，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLPC物質(zhì)組成及體積比為:50-90%甲醇，10-50毫摩爾的氨水；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸；
[0025]食品中三聚氰胺分子檢測的樣品制備試劑QLN和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLN，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLN物質(zhì)組成及體積比為:50-80%甲醇，20-50%乙氰，1-5%三氟乙酸；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸；
[0026]在飲用水及污水中污染物小分子檢測的樣品制備試劑QLW和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLW，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLW物質(zhì)組成及體積比為:50-100%甲醇，1-5%三氟乙酸；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70 %甲醇，30-50 %離子水，1-7 %三氟乙酸。
[0027]有益效果:
[0028]1、徹底避免了基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜中的基質(zhì)分子的使用，徹底避免了基質(zhì)分子對(duì)于小分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
[0029]2、靶板特殊化處理和納米結(jié)構(gòu)化，從而引起表面積指數(shù)數(shù)量級(jí)增大，吸附能量并局部爆破的能力大大加強(qiáng)，使得待測樣品的吸收能量后電離更容易。
[0030]3、本發(fā)明發(fā)放可適應(yīng)于絕大多數(shù)分子量小于3000da的小分子，這其中涉及到大多數(shù)的醫(yī)藥靶向小分子的分析檢測和高通量篩選。醫(yī)藥靶向小分子多數(shù)為極性分子，且溶于水，通過對(duì)這個(gè)小分子和這個(gè)小分子和靶點(diǎn)作用后產(chǎn)生產(chǎn)物的篩選，就可以表征出此靶點(diǎn)藥物小分子的活性。活性=產(chǎn)物小分子濃度/剩余靶點(diǎn)小分子濃度。這個(gè)活性指數(shù)越高，既反映此靶向小分子和靶點(diǎn)的作用越強(qiáng)烈。
[0031]4、核心是以納米結(jié)構(gòu)靶板為載體，表面激光解析質(zhì)譜掃描為檢測手段，可達(dá)到傳統(tǒng)高分辨率液相及氣相色譜的靈敏度，比光譜法比如熒光，紫外法要高出1000倍靈敏度。
[0032]5、具備表面激光解析質(zhì)譜的高通量特性，一天可完成傳統(tǒng)質(zhì)譜聯(lián)用篩選平臺(tái)1-2個(gè)月的工作，在成本上大大降低了原始科研成本。
[0033]6、可被檢測和篩選的應(yīng)用對(duì)象廣泛，從幾十分子量的小分子比如氨基酸到上萬的多肽及高分子材料，都可以被檢測到。
[0034]7、后期結(jié)合定向模型和生物統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)為一體的高通量篩選平臺(tái)，已經(jīng)徹底顛覆了該領(lǐng)域的傳統(tǒng)技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于涉及生物醫(yī)藥、工業(yè)用酶及微生物菌種改良、生物能源開發(fā)、以及食品安全檢測等領(lǐng)域，并能作為重要科研手段支持癌癥及重大疾病早期診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1納米靶板示意圖；
[0036]圖2SEM電子顯微鏡下芯板結(jié)構(gòu)；
[0037]圖3利用本發(fā)明檢測到的小肽分子質(zhì)譜圖；
[0038]圖4利用本發(fā)明檢測到的酵母菌質(zhì)譜圖；
[0039]圖5檢測到8種短鏈脂肪酸質(zhì)譜圖；
[0040]圖6同時(shí)檢測多種不同類別和分子結(jié)構(gòu)的小分子質(zhì)譜圖；
[0041]圖7本申請(qǐng)與MALDI，ESI同時(shí)檢測異搏定(維拉帕米片)Verapamil質(zhì)譜圖對(duì)比；
[0042]圖8本申請(qǐng)與MALDI, ESI同時(shí)檢測丙三醇-憐酸膽喊1-Palmitoyllysophosphatidylcholine質(zhì)譜對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043]本發(fā)明技術(shù)是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)的革新和應(yīng)用范圍的革命性拓展。本技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)是徹底避免了基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜中的基質(zhì)分子的使用，將靶板特殊化處理和納米結(jié)構(gòu)化，從而引起表面積指數(shù)數(shù)量級(jí)增大，吸附能量并局部爆破的能力大大加強(qiáng)，這樣直接將樣品點(diǎn)加在靶板表面，在激光的激發(fā)下，表面會(huì)引起無數(shù)個(gè)小型爆炸，這小型的爆炸是指激光在靶板局部激發(fā)，由于納米結(jié)構(gòu)的高表面積，瞬間引起小型爆炸。在爆炸中靶板高分子涂層沖向真空的同時(shí)也把樣品小分子帶進(jìn)真空。在此過程中小分子會(huì)被電離，如小分子為酸性結(jié)構(gòu)，在樣品制備過程中電離曾強(qiáng)液QLB2或者QLBl的作用下，帶正電飛進(jìn)真空，進(jìn)入質(zhì)譜檢測器。如小分子為堿性結(jié)構(gòu)，在樣品制備過程中電離曾強(qiáng)液QLBl的作用下，帶負(fù)電飛進(jìn)真空進(jìn)入質(zhì)譜檢測器。氣化進(jìn)入真空質(zhì)譜檢測器。這樣就可以避免基質(zhì)分子的干擾直接檢測分子量小于3000da的小分子，同時(shí)達(dá)到質(zhì)譜的高靈敏度和高通量。具體靶板制作如下:
[0044]I)將p-type/Boron, 2cm的氧化娃芯板單面拋光，達(dá)到電阻率0.01-0.02歐姆厘米。
[0045]2)將上一步拋光的原始芯板切割成根據(jù)需要的大小，控制在長5-8厘米，寬3-5厘米。
[0046]3)用50-75%硫酸，1_3%氫氟酸混合物侵泡表面5分鐘，同時(shí)加以5v電壓30分鐘，幫助芯板整體表面納米結(jié)構(gòu)化。
[0047]4)使用離子純凈水清洗表面三次。
[0048]5)晾干5分鐘。
[0049]6)在芯板表面均勻涂上一層類似Teflon的高分子材料。如圖1所示，使用的是類似聚四氟乙烯的高分子涂層。涂層的目的第一是在激光激發(fā)下迅速加熱爆炸，將樣品小分子在完整不被降解的情況下蹦進(jìn)真空。第二是聚四氟乙烯類似的結(jié)構(gòu)的高分子不會(huì)被電離，意味著在質(zhì)譜檢測器中沒有雜質(zhì)峰，降低背景峰。首先，類似Teflon結(jié)構(gòu)的高分子材料在激光激發(fā)輻射下降解率非常低，不會(huì)產(chǎn)生任何碎片跟隨樣品小分子進(jìn)入到質(zhì)譜檢測器，這就降低了背景峰。其次，類似Teflon結(jié)構(gòu)高分子多鏈材料幾乎無法被電離和解析，電荷質(zhì)量比幾乎為零，這就決定了即便有非常小量的高分子片段飛進(jìn)真空，也不會(huì)造成影響，因?yàn)椴粠щ姾蛇M(jìn)不了質(zhì)譜檢測器。最后，類似telfon—類的高分子沸點(diǎn)較低，在激光激發(fā)下會(huì)整體氣化，而點(diǎn)在其上面的小分子樣品就集體被沖到真空從而進(jìn)入質(zhì)譜檢測。
[0050]2.表征
[0051]制作好的芯板無需添加基質(zhì)分子，可以直接在板上點(diǎn)加液體及固體樣品。點(diǎn)樣只需要微量樣品，體積很小會(huì)迅速蒸發(fā)，并且自己均勻的鋪在板面，所以均勻性不是問題。
[0052]如圖2所示，為SEM電子顯微鏡拍下的芯板表面。經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)化后的芯板具有均勻的40-100納米空隙.
[0053]3.應(yīng)用
[0054]針對(duì)不同分子量小于3000da的小分子，我們同時(shí)發(fā)明了一系列樣品制備試劑盒和配套分析檢測方法，我們使用的質(zhì)譜儀器為ABI 5800 MALD1-T0F，但不局限于這個(gè)名牌的質(zhì)譜，我們的靶板和配套技術(shù)是通用于所有表面激光解析質(zhì)譜。同時(shí)我們也做了和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)的平行對(duì)比。
[0055]I)樣品制備方法和分析方法
[0056]本技術(shù)的樣品制備方法簡易，而且成本較低。主要分為細(xì)胞培養(yǎng)液樣品制備，細(xì)菌培養(yǎng)液樣品制備，血液樣品制備，水容易樣品制備。同時(shí)也要根據(jù)待測目標(biāo)小分子的物理化學(xué)性質(zhì)來使用緩沖液?；舅悸窞閷⒈景l(fā)明技術(shù)中的基本裂解液系列加入同等體積的樣品中，作用10分鐘，然后3000離心10分鐘，收集上清液，根據(jù)不同小分子檢測對(duì)象加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLBl或者QLB2。然后離心5分鐘，取上清液0.5微升點(diǎn)在靶板上，放進(jìn)ABI 5800 MALD1-T0F或者其他表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測。
[0057]2)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品制備試劑盒基本裂解液QLl及樣品制備方法
[0058]將細(xì)胞培養(yǎng)液樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液QLl (物質(zhì)體積比為:10-30% ,70-90%乙氰，1-7%甲酸)，作用5分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。
[0059]3)細(xì)菌培養(yǎng)液樣品制備試劑盒基本裂解液QL2及樣品制備方法
[0060]將細(xì)菌培養(yǎng)液樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液QL2 (10-50%甲醇，50-90%乙氰，體積比1-7%的甲酸)，作用5分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后,收集上清液。
[0061]4)血液樣品制備試劑盒基本裂解液QL3及樣品制備方法
[0062]將血液樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入抗凝劑抗凝，離心15分鐘得血漿。加入基本裂解液QL3 (80-100%乙氰，1-7%甲酸)經(jīng)沉淀蛋白，離心15分鐘后收集上清液。
[0063]5)常規(guī)水容易樣品制備試劑盒基本裂解液QL4及樣品制備方法
[0064]將水溶液樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液QL4 (50-100%甲醇，體積比1_7%的甲酸)，作用5分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。
[0065]6)增強(qiáng)電離緩沖液QLBl
[0066]此緩沖液是針對(duì)酸性小分子的表面激光解析質(zhì)譜分析，經(jīng)過以上之一的樣品制備后，目標(biāo)小分子已經(jīng)聚集在上清液中。如果待測目標(biāo)小分子是酸性結(jié)構(gòu)，PH〈4.加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLBl (50-70%甲醇，30-50%離子水，1_7%三氟乙酸)。充分混合后，取0.5微升樣品點(diǎn)在靶板上即可送入表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析。
[0067]7)增強(qiáng)電離緩沖液QLB2
[0068]此緩沖液是針對(duì)堿性性小分子的表面激光解析質(zhì)譜分析，經(jīng)過以上之一的樣品制備后，目標(biāo)小分子已經(jīng)聚集在上清液中。如果待測目標(biāo)小分子是堿性性結(jié)構(gòu)，PH>8.加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLB2 (100%離子水，1-7%甲酸)。充分混合后，取0.5微升樣品點(diǎn)在靶板上即可送入表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析。
[0069]8)醫(yī)藥靶點(diǎn)小分子分析檢測和篩選
[0070]本發(fā)明發(fā)放可適應(yīng)于絕大多數(shù)的醫(yī)藥靶點(diǎn)小分子的分析檢測和篩選。醫(yī)藥靶點(diǎn)小分子多數(shù)為極性分子，且溶于水，通過對(duì)這個(gè)小分子和這個(gè)小分子和靶點(diǎn)作用后產(chǎn)生產(chǎn)物的篩選，就可以表征出此靶點(diǎn)藥物小分子的活性。
[0071]活性=產(chǎn)物小分子濃度/剩余靶點(diǎn)小分子濃度
[0072]這個(gè)活性指數(shù)越高，既反映此靶點(diǎn)小分子和靶點(diǎn)的作用越強(qiáng)烈。本發(fā)明方法特別適合此方向的篩選，可以應(yīng)用在藥物動(dòng)力學(xué)和藥理篩查，藥物毒理篩查。
[0073]9)針對(duì)小肽分子檢測的樣品制備試劑QLP和方法
[0074]本技術(shù)方法適合小肽分子，因?yàn)樾‰姆肿咏Y(jié)構(gòu)上帶有多個(gè)氨基，天然結(jié)合靶板，力口上本發(fā)明的多肽分子曾強(qiáng)電離緩沖液，使得5000da以下分子量的小肽分子接近100%電離和氣化飛向質(zhì)譜檢測器。
[0075]首先通過以上2)-4)某種裂解方式制備樣本，取上清后，加入同等體積的制備試劑QLP (70-90%離子水，10-30%甲醇，1_5%甲酸)。充分混合后，取0.5微升溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置10分鐘后進(jìn)樣即可。
[0076]我們做了以下實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證此方法:將牛血清白蛋白裂解樣品進(jìn)行分析，可以看到我們的發(fā)明技術(shù)可以檢測到至少10種小肽分子，靈敏度高達(dá)納納摩爾每升的級(jí)別。而基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜并不能檢測到任何小肽分子。如圖3所示。
[0077]10)氨基酸分子檢測的樣品制備試劑QLA和方法
[0078]針對(duì)氨基酸分子的，本方法可以同時(shí)檢測7種關(guān)鍵氨基酸分子，其中四種氨基酸分子的檢測線可到達(dá)納摩爾每升的超高靈敏度。同時(shí)通量可達(dá)到每日9000個(gè)樣品的分析處理能力。
[0079]首先通過以上2)-4)某種裂解方式制備樣本，取上清后，加入同等體積的制備試劑QLA (30 %離子水，30-50 %甲醇，20-40 %正丙醇1_5 %甲酸)。充分混合后，取0.5微升溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置10分鐘后進(jìn)樣即可。
[0080]如圖4所示為酵母菌發(fā)酵后，裂解細(xì)菌的產(chǎn)物分析。我們可以從此方法來快速篩選高產(chǎn)菌種。
[0081]11)脂肪酸分子檢測的樣品制備試劑QLF和方法
[0082]飽和與不飽和脂肪酸均含有長鏈的烷烴碳鏈，這一特殊的結(jié)構(gòu)決定了脂肪酸分子的疏水性和在堿緩沖液的強(qiáng)烈反應(yīng)性。疏水性促進(jìn)了脂肪酸分子和靶板的非化學(xué)性結(jié)合，更易被解離。
[0083]將樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的試劑QLF(50-90%甲醇，10-50毫摩爾的氨水)，作用15分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。
[0084]取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl (50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸)。充分混合后，取0.5微升溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置10分鐘后進(jìn)樣即可。
[0085]如圖5所示為將高產(chǎn)脂肪酸的微生物細(xì)胞裂解后的篩選結(jié)果，靈敏度達(dá)到納摩爾級(jí)別。我們同時(shí)可以檢測到高達(dá)8種短鏈脂肪素，包括飽和和非飽和類型。同時(shí)通量可達(dá)到每日9000個(gè)樣品的分析處理能力。
[0086]12)膽堿及脂類分子檢測的樣品制備試劑QLPC和方法
[0087]和脂肪酸相似，膽堿及脂類分子同樣含有長鏈的烷烴碳鏈，這一特殊的結(jié)構(gòu)決定了其疏水性和在堿緩沖液的強(qiáng)烈反應(yīng)性。疏水性促進(jìn)了和靶板的非化學(xué)性結(jié)合，更易被解離。
[0088]將樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的試劑QLPC (50-90%甲醇，10-50毫摩爾的氨水)，作用15分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。
[0089]取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl (50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸)。充分混合后，取0.5微升溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置10分鐘后進(jìn)樣即可。
[0090]13)食品中三聚氰胺分子檢測的樣品制備試劑QLN和方法
[0091]此方法還可以應(yīng)用在三聚氰胺等食品安全檢測，將樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的試劑QLN(50-80%甲醇，20-50%乙氰，1-5%三氟乙酸)，作用15分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl (50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸)。充分混合后，取0.5微升溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置10分鐘后進(jìn)樣即可。
[0092]14)在飲用水及污水中污染物小分子檢測的樣品制備試劑QLW和方法
[0093]此發(fā)明方法還可以應(yīng)用在飲用水及污水處理中極性污染物的檢測。操作簡單，高效。將樣本(單個(gè)離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的試劑QLW(50-100%甲醇，1_5%三氟乙酸)，作用15分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置10分鐘后進(jìn)樣檢測；QLW物質(zhì)組成及體積比為:50-100%甲醇，1-5%三氟乙酸；QLBl物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-5%三氟乙酸。
[0094]15)多重不同分子結(jié)構(gòu)小分子的同時(shí)檢測和篩選
[0095]本技術(shù)發(fā)明還可以同時(shí)檢測多種不同類別和分子結(jié)構(gòu)的小分子。如圖6所示。
[0096]我們對(duì)小分子藥物異搏定(維拉帕米片)Verapamil進(jìn)行檢測.如圖7所示的質(zhì)譜圖可以看到=MALDI和ESI并不能檢測到該分子，而本發(fā)明技術(shù)對(duì)此小分子的靈敏度達(dá)到0.7納摩爾每升的高靈敏度。
[0097]我們還分析檢測了丙三醇-磷酸膽堿1-Palmitoyllysophosphatidylcholine,是一種重要的靶向藥物中間體。同樣的，MALDI和ESI檢測不到該小分子，而我們的技術(shù)可以檢測到0.5納摩爾每升的濃度。質(zhì)譜截圖如圖8所示。
【權(quán)利要求】
1.一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板，其特征在于，氧化硅芯板一面是納米結(jié)構(gòu)，其納米空隙在40 - 100納米之間，在芯板納米結(jié)構(gòu)一面，涂有一層抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑、有耐高溫、沸點(diǎn)低，摩擦系數(shù)極低的高分子材料。
2.權(quán)利要求1所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的制作方法，其特征在于， ①將氧化硅芯板單面拋光，達(dá)到電阻率0.01-0.02歐姆厘米； ②將拋光的原始芯板切割成根據(jù)需要的大??； ③用體積比為50-75%硫酸和體積比為I% — 5%的氫氟酸混合物侵泡表面5分鐘，同時(shí)加以5v電壓30分鐘，幫助芯板整體表面納米結(jié)構(gòu)化，其納米空隙在40 - 100納米之間； ④使用離子純凈水清洗N次，N蘭2; ⑤晾干； ⑥在芯板表面均勻涂上一層抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑、有耐高溫、摩擦系數(shù)極低的高分子材料。
3.權(quán)利要求1所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選過程中樣品制備和分析兩步， 樣品制備:包括細(xì)胞培養(yǎng)液樣品制備試劑盒或細(xì)囷培養(yǎng)液樣品制備試劑盒或血液樣品制備試劑盒或水溶液樣品制備試劑盒； 樣品分析步驟:①根據(jù)不同小分子檢測對(duì)象加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液；②離心，取上清液點(diǎn)在靶板上，放進(jìn)ABI 5800 MALD1-TOF或者其他表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的應(yīng)用，其特征在于， 細(xì)胞培養(yǎng)液樣品制備試劑盒，具體步驟如下:將細(xì)胞培養(yǎng)液樣本放置室溫，充分解凍；加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心；收集上清液；基本裂解液為QLl或QL2，QL1物質(zhì)組成及體積比為:10-30%甲醇、70-90%乙氰、1_7%甲酸；QL2物質(zhì)組成及體積比為:10-50%甲醇、50-90%乙氰、1-7%甲酸； 血液樣品制備試劑盒，具體步驟如下:將血液樣本放置室溫，充分解凍；加入抗凝劑抗凝，離心得血漿；加入基本裂解液QL3經(jīng)沉淀蛋白，離心后收集上清液；QL3物質(zhì)組成及體積比為:80-100%乙氰，1-7%甲酸； 水溶液樣品制備試劑盒，，具體步驟如下:將水溶液樣本放置室溫，充分解凍；加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液QL4，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心，收集上清液；QL4物質(zhì)組成及體積比為:50-100%甲醇，體積比1-7%的甲酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的應(yīng)用，其特征在于，增強(qiáng)電離緩沖液的種類: ①若待測目標(biāo)小分子是酸性結(jié)構(gòu)，PH<4.加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLBl ;充分混合后，取樣品點(diǎn)在靶板上即可送入表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸； ②待測目標(biāo)小分子是堿性結(jié)構(gòu)，PH>8.加入同等體積的增強(qiáng)電離緩沖液QLB2;充分混合后，取樣品點(diǎn)在靶板上即可送入表面激光解析質(zhì)譜進(jìn)行分析；QLB2物質(zhì)組成及體積比為:100%離子水，1-7%甲酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于分子量小于3000da的小分子的分析檢測和高通量篩選；新藥及藥物中間體的分析檢測和高通量篩選，藥物動(dòng)力學(xué)和藥理高通量篩查；藥物毒理高通量篩查；多重不同分子結(jié)構(gòu)小分子的同時(shí)檢測和高通量篩選。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種高通量、高靈敏度、表面激光解析質(zhì)譜納米靶板的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于分子量小于3000da的小分子的分析檢測和高通量篩選包括:針對(duì)小肽分子檢測的樣品制備試劑QLP和方法；氨基酸分子檢測的樣品制備試劑QLA和方法；脂肪酸分子檢測的樣品制備試劑QLF和方法；膽堿及脂類分子檢測的樣品制備試劑QLPC和方法；牛奶及飲品中三聚氰胺分子檢測的樣品制備試劑QLN和方法；在飲用水及污水中污染物小分子檢測的樣品制備試劑QLW和方法； 針對(duì)小肽分子檢測的樣品制備試劑QLP和方法:用權(quán)利要求5中任一裂解液進(jìn)行裂解制備樣本，取上清后，加入同等體積的制備試劑QLP ;充分混合；取溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置后進(jìn)樣檢測；QLP物質(zhì)組成及體積比為:70-90%離子水，10-30%甲醇，1_5%甲酸；氨基酸分子檢測的樣品制備試劑QLA和方法:用權(quán)利要求5中任一裂解液進(jìn)行裂解制備樣本，取上清后，加入同等體積的制備試劑QLA ;充分混合；取溶液點(diǎn)在靶板上，通風(fēng)處下靜置后進(jìn)樣檢測；QLA物質(zhì)組成及體積比為:30%離子水，30-50%甲醇，20-40%正丙醇1-5%甲酸； 脂肪酸分子檢測的樣品制備試劑QLF和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLF，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLF物質(zhì)組成及體積比為:50-90%甲醇，10-50毫摩爾的氨水；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸； 膽堿及脂類分子檢測的樣品制備試劑QLPC和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLPC，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLPC物質(zhì)組成及體積比為:50-90%甲醇，10-50%乙氰，10-50毫摩爾的氨水；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-7%三氟乙酸； 食品中三聚氰胺分子檢測的樣品制備試劑QLN和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLN，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣進(jìn)樣檢測；QLN物質(zhì)組成及體積比為:50-80%甲醇，20-50%乙氰，1-5%三氟乙酸；QLB1物質(zhì)組成及體積比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-5%三氟乙酸； 在飲用水及污水中污染物小分子檢測的樣品制備試劑QLW和方法:將樣本放置室溫，充分解凍，加入-20度同等體積的試劑QLW，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心后，收集上清液；取上清后，加入同等體積的制備試劑QLBl ;充分混合后，取溶液點(diǎn)在靶板上，靜置后進(jìn)樣檢測；QLW物質(zhì)組成及體積比為:50-100%甲醇，1-5%三氟乙酸；QLB1物質(zhì)組成及體積 比為:50-70%甲醇，30-50%離子水，1-5%三氟乙酸。
【文檔編號(hào)】G01N27/64GK104251878SQ201410452870
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】成曉亮, 鄭可嘉 申請(qǐng)人:武漢品生科技有限公司