一種測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，屬于檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明技術(shù)方案包括發(fā)酵液的粗提取、樣品的酸解、衍生化、通過氣相色譜檢測(cè)水解的甘露糖單體的含量，進(jìn)而表征發(fā)酵液中甘露聚糖肽含量，排除其他雜質(zhì)的干擾，為發(fā)酵過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控提供可靠方法。本發(fā)明提供的方法可靠可重復(fù)性高，較簡(jiǎn)單、快捷且靈敏度高，可通過測(cè)定甘露糖含量表征甘露聚糖肽發(fā)酵情況。
【專利說明】一種測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，尤其是一種基于氣相色譜的表征甘露聚糖肽含量的方法，屬于檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]甘露聚糖肽(Mannatide)曾用名:多抗甲素(PolyactinA, PAA),是由α -溶血性鏈球菌(alpha-Hemolytic streptococci) 33#菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng),提取制備的多糖類物質(zhì)。它具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝，促進(jìn)造血干細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞活化增殖及特異抗體生成,提高外周血白細(xì)胞數(shù),改善機(jī)體抗應(yīng)激能力及抗炎等多種生理活性。該藥作為治療腫瘤的輔助藥物，能夠減輕放、化療的毒副作用，增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫功能；對(duì)貧血、血細(xì)胞減少癥、過敏性關(guān)節(jié)炎、多種口腔粘膜病等非腫瘤疾病都有很好的治療效果。
[0003]甘露聚糖肽不僅可以治療人體的多種疾病，在畜牧生產(chǎn)中合理運(yùn)用該藥品，也可以起到很好的效果，具有光明的市場(chǎng)前景。但在發(fā)酵生產(chǎn)當(dāng)中，對(duì)發(fā)酵情況的監(jiān)控多依靠對(duì)發(fā)酵液中菌體的形態(tài)學(xué)觀察及發(fā)酵時(shí)間等經(jīng)驗(yàn)值，缺乏對(duì)發(fā)酵情況的有效評(píng)估質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而以發(fā)酵產(chǎn)物甘露聚糖肽，含量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一種可行的方案。甘露聚糖肽可以分解為堿性多肽和甘露聚糖兩部分，甘露聚糖肽經(jīng)水解后測(cè)得含甘露糖含量為87.7-90.3%，根據(jù)甘露聚糖的特性可對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)以表征甘露聚糖肽的含量。馮鎖民利用Molisch反應(yīng)使甘露糖與α -萘酚顯色形成橙紅色物，在490nm處檢測(cè)甘露糖吸收度表征產(chǎn)物含量，但是培養(yǎng)基中添加的其他還原糖也會(huì)與α-萘酚發(fā)生顯色反應(yīng)，從而干擾測(cè)定結(jié)果。張運(yùn)濤建立了紫外分光法直接測(cè)定啤酒酵母中甘露糖含量的方法。甘露糖在90% H2SO4溶液中脫水生成5-羥甲基-2-呋喃醛，添加NaCl-H3BO3,使5-羥甲基-2-呋喃醛轉(zhuǎn)化為5-氯甲基-2-呋喃醛，此轉(zhuǎn)化量與甘露糖的量呈線性關(guān)系，測(cè)定前后兩次在280nm處的吸光值之差，得出甘露糖含量。
[0004]然而，發(fā)酵液成分較復(fù)雜，可能含有其他有紫外吸收的物質(zhì)對(duì)甘露糖的含量測(cè)定有干擾，有很大局限性，不能準(zhǔn)確反應(yīng)甘露聚糖的含量。為此，本發(fā)明通過先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行粗提純，甘露聚糖的酸解，衍生化及氣相色譜(GC)分離-氫火焰離子鑒定器(FID)檢測(cè)發(fā)酵液中甘露糖單體含量，排除其他單糖因素的干擾，表征產(chǎn)物甘露聚糖肽的含量，為發(fā)酵過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控提供有據(jù)可依的數(shù)據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確可靠、較簡(jiǎn)便且有應(yīng)用價(jià)值的測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是對(duì)甘露聚糖肽進(jìn)行酸解獲得甘露糖單體，再將甘露糖單體進(jìn)行衍生化，利用氣相色譜檢測(cè)甘露糖含量，進(jìn)而表征甘露聚糖肽的含量。
[0006]所述甘露聚糖肽的含量(％)=甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(%)，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0007]所述酸解是將甘露聚糖肽用1-2M H2SO4于105°C進(jìn)行酸解反應(yīng)，IM與2M H2SO4可以達(dá)到同樣的水解效果，反應(yīng)結(jié)束后加入肌醇內(nèi)標(biāo)、混勻，用BaCO3分次加入中和，振蕩、離心取上清液，進(jìn)行冷凍干燥。所述甘露聚糖肽經(jīng)過粗純化，去除分子量小于1KD及大于100KD的雜質(zhì)。
[0008]所述甘露糖單體的衍生化，是稱取1mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將甘露聚糖肽酸解產(chǎn)物的凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90°C水浴30min，冷卻至室溫，力口入0.5mL乙酸酐，90°C水浴30min。
[0009]所述氣相色譜檢測(cè)甘露糖含量的條件是:
[0010]色譜柱:0V1701石英毛細(xì)管柱，30m, 1.D.0.53mm ；
[0011 ] 檢測(cè)器:FID (氫火焰離子鑒定器);
[0012]氣化室溫度:260°C，檢測(cè)器溫度:250°C ；
[0013]柱溫:程序升溫:起始溫度120°C，保持3min，每分鐘升10°C，至195 °C，保留0.1min,每分鐘升 3°C,至 240°C，保留 1min ；
[0014]載氣壓力(N2):0.60kg/cm2 ;
[0015]燃?xì)鈮毫?H2):0.65kg/cm2 ；
[0016]助燃?xì)鈮毫?空氣):0.50kg/cm2 ;
[0017]分流比為30: I。
[0018]所述方法應(yīng)用于測(cè)定發(fā)酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的步驟為:
[0019](I)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行粗提純，利用1KD與100KD的超濾管對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分子截留，去除小分子及大分子雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)甘露聚糖肽的粗提純；
[0020](2)對(duì)甘露聚糖肽進(jìn)行酸解，獲得甘露糖單體；
[0021](3)將甘露糖單體衍生化，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，得出甘露糖含量，表征甘露聚糖肽的含量。
[0022]所述方法應(yīng)用于測(cè)定發(fā)酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的具體步驟為:
[0023](I)發(fā)酵產(chǎn)物的粗提純:
[0024]量取發(fā)酵液20-30mL于50mL離心管中，1000rpm離心20min，去沉淀取上清液，轉(zhuǎn)至100KD超濾管，5000g離心20min，收集流出液，再加5mL去離子水至100KD超濾管，5000g離心20min，重復(fù)一次，合并流出液。將流出液轉(zhuǎn)移至1KD超濾管中，7500g離心20min，截留液轉(zhuǎn)移至新離心管，用去離子水多次沖洗1KD超濾管，合并截留液，將截留液進(jìn)行冷凍干燥。
[0025](2)甘露聚糖肽的酸解:
[0026]稱取20mg凍干物于15mL離心管中，加2mL 1_2M H2SO4于105°C反應(yīng)8h (用保鮮膜封口，膜上戳少許小孔)，反應(yīng)后每管添加ImL lmg/mL的肌醇內(nèi)標(biāo)，混勻，稱取2g BaCO3分兩次加入中和，振蕩，12000rpm離心20min，取上清液于新1.5mL離心管中，進(jìn)行冷凍干燥。
[0027](3)酸解樣品的衍生化:
[0028]稱取1mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90°C水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90°C水浴30min，冷卻后進(jìn)行氣相色譜分析。
[0029](4)氣相色譜條件:
[0030]色譜柱:0V1701石英毛細(xì)管柱，30m, 1.D.0.53mm ;[0031 ] 檢測(cè)器:FID (氫火焰離子鑒定器)；
[0032]氣化室溫度:260°C，檢測(cè)器溫度:250°C ；
[0033]柱溫；程序升溫:起始溫度120 0C，保持3min，每分鐘升10°C，至195 °C，保留
0.1min0 每分鐘升 3°C,至 240°C，保留 1min ；
[0034]載氣壓力(N2):0.60kg/cm2 ；
[0035]燃?xì)鈮毫?H2):0.65kg/cm2 ；
[0036]助燃?xì)鈮毫?空氣):0.50kg/cm2 ；
[0037]分流比:30: I。
[0038](5)單糖結(jié)果分析:
[0039]單糖組分比例以肌醇為內(nèi)標(biāo)，以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定出甘露糖含量，甘露聚糖肽的含量(%)=甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)。
[0040]所述方法應(yīng)用于測(cè)定甘露聚糖肽精制產(chǎn)品中甘露聚糖肽中甘露糖含量時(shí)，不需要進(jìn)行純化，其他步驟與測(cè)定發(fā)酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的具體步驟相同。
[0041]目前其他測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，都會(huì)存在諸如雜單糖等的干擾因素，從而得不到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明通過先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行粗提純、甘露聚糖的酸解、衍生化及氣相色譜(GC)分離-氫火焰離子鑒定器(FID)檢測(cè)發(fā)酵液中甘露糖單體含量，根據(jù)甘露聚糖肽中甘露糖的含量表征產(chǎn)物甘露聚糖肽的含量，排除了其他雜質(zhì)，尤其是其他單糖的干擾，為發(fā)酵過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控提供有據(jù)可依的數(shù)據(jù)，并且適用于其他發(fā)酵過程中糖復(fù)合物中單糖組分含量的測(cè)定，具有顯著地技術(shù)進(jìn)步。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1:六種單糖標(biāo)樣氣相色譜峰
[0043]圖2:甘露聚糖肽精制樣品(140401)通過氣相色譜測(cè)甘露糖含量
[0044]圖3:甘露聚糖肽精制樣品(140501)通過氣相色譜測(cè)甘露糖含量
[0045]圖4:48h的發(fā)酵粗提液通過氣相色譜測(cè)甘露糖含量
[0046]圖5:60h的發(fā)酵粗提液通過氣相色譜測(cè)甘露糖含量

【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合精制的甘露聚糖肽產(chǎn)品對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0048]實(shí)施例1測(cè)定精制甘露聚糖肽樣品中甘露糖的含量
[0049]樣品:兩批次的精制甘露聚糖肽樣品均由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，成都利爾藥業(yè)有限公司將發(fā)酵液經(jīng)過多步分離純化得到的甘露聚糖肽樣品作為精制甘露聚糖肽樣品O
[0050]試劑:濃硫酸、NaOH,乙醇、BaCO3、肌醇、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0051](I)精制甘露聚糖肽樣品的酸解
[0052]稱取20mg甘露聚糖肽樣品于15mL離心管中，加2mL 1-2M H2SO4于105°C反應(yīng)8hr(用保鮮膜封口，膜上戳少許小孔)，反應(yīng)后每管添加ImL lmg/mL的肌醇內(nèi)標(biāo)，混勻，稱取2g BaCO3分兩次加入中和,振蕩，12000rpm離心20min,取上清液于新1.5mL離心管中，進(jìn)行冷凍干燥。
[0053](2)酸解樣品的衍生化
[0054]稱取1mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90°C水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90°C水浴30min，冷卻后進(jìn)行氣相色譜分析。
[0055](3)高效液相色譜分析
[0056]色譜柱:0V1701石英毛細(xì)管柱，30m，1.D.0.53mm ;檢測(cè)器:FID (氫火焰離子鑒定器)；氣化室溫度:260°C，檢測(cè)器溫度:250°C ;柱溫，程序升溫:起始溫度120°C，保持3min，每分鐘升10°C, S 1950C，保留0.1min0每分鐘升3°C，至240°C，保留1min ;載氣壓力(N2):
0.60kg/cm2，燃?xì)鈮毫?H2):0.65kg/cm2，助燃?xì)鈮毫?空氣):0.50kg/cm2，分流比:30: I
[0057](4)單糖結(jié)果分析
[0058]單糖組分比例以肌醇為內(nèi)標(biāo)，以內(nèi)標(biāo)法定出各單糖含量。
[0059]某單糖含量(%) = (Ai/AIi) X (AIs/As) X (ffs/WIs) X (ffli/ff) X 100
[0060]式中:Ai表示某單糖樣品峰面積，
[0061]AIi表示樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積，
[0062]AIs表示標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積，
[0063]As表示某單糖標(biāo)樣峰面積，
[0064]Ws表示某單糖標(biāo)樣的質(zhì)量mg,
[0065]WIs表示標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量mg，
[0066]WIi表示樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量mg，
[0067]W表示稱取糖樣品的質(zhì)量mg。
[0068]其中，六種單糖標(biāo)樣氣相色譜信息如下表:
[0069]表1:六種六碳糖標(biāo)樣的氣相色譜信息
[0070]

【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是對(duì)甘露聚糖肽進(jìn)行酸解、衍生化獲得甘露糖單體，再將甘露糖單體進(jìn)行衍生化，通過氣相色譜檢測(cè)甘露糖含量，進(jìn)而表征甘露聚糖肽的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸解是將甘露聚糖肽用1-2M&304于105°C進(jìn)行酸解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用BaCO3分次加入中和，振蕩、離心取上清液，加入肌醇內(nèi)標(biāo)、混勻，進(jìn)行冷凍干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述甘露聚糖肽經(jīng)過粗純化，去除分子量小于1KD及大于100KD的雜質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘露糖單體的衍生化，是稱取1mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將甘露聚糖肽酸解產(chǎn)物的凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90°C水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90°C水浴30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣相色譜檢測(cè)甘露糖含量的氣相色譜條件是: 色譜柱:0V1701石英毛細(xì)管柱，30m, 1.D.0.53mm ； 檢測(cè)器:氫火焰離子鑒定器； 氣化室溫度:260°C，檢測(cè)器溫度:250°C ； 柱溫:程序升溫:起始溫度120°C，保持3min，每分鐘升10°C，至195°C，保留0.1min,每分鐘升3°C，至2400C，保留1min ； 載氣壓力:0.60kg/cm2,載氣為N2 ； 燃?xì)鈮毫?0.65kg/cm2，燃?xì)鉃镠2 ； 助燃?xì)鈮毫?0.50kg/cm2，助燃?xì)鉃榭諝猓? 分流比為30: I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的測(cè)定步驟為: (1)發(fā)酵產(chǎn)物的粗提純:量取發(fā)酵液20-30mL于50mL離心管中，1000rpm離心20min，去沉淀取上清液，轉(zhuǎn)至100KD超濾管，5000g離心20min，收集流出液，再加5mL去離子水至100KD超濾管，5000g離心20min，重復(fù)一次，合并流出液；將流出液轉(zhuǎn)移至1KD超濾管中，7500g離心20min，截留液轉(zhuǎn)移至新離心管，用去離子水多次沖洗1KD超濾管，合并截留液，將截留液進(jìn)行冷凍干燥； (2)甘露聚糖肽的酸解:稱取20mg凍干物于15mL離心管中，加2mLlM&504于1051:反應(yīng)8h，反應(yīng)后每管添加lmLlmg/mL的肌醇內(nèi)標(biāo)，混勻，稱取2g BaCO3分兩次加入中和,振蕩，12000rpm離心20min,取上清液于新1.5mL離心管中，進(jìn)行冷凍干燥； (3)酸解樣品的衍生化:稱取1mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90°C水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90°C水浴30min，冷卻后進(jìn)行氣相色譜分析； (4)氣相色譜條件: 色譜柱:0V1701石英毛細(xì)管柱，30m, 1.D.0.53mm ； 檢測(cè)器:氫火焰離子鑒定器； 氣化室溫度:260°C，檢測(cè)器溫度:250°C ； 柱溫:程序升溫:起始溫度120°C，保持3min，每分鐘升10°C，至195°C，保留0.1min,每分鐘升3°C，至2400C，保留1min ； 載氣壓力:0.60kg/cm2,載氣為N2 ； 燃?xì)鈮毫?0.65kg/cm2，燃?xì)鉃镠2 ； 助燃?xì)鈮毫?0.50kg/cm2，助燃?xì)鉃榭諝猓? 分流比為30:1 ; (5)單糖結(jié)果分析: 單糖組分比例以肌醇為內(nèi)標(biāo)，以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定出甘露糖含量，甘露聚糖肽的含量(％)=甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104181243SQ201410406752
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】劉波, 駱俊清, 魏嵐, 武朝松, 宛燕飛 申請(qǐng)人:成都利爾藥業(yè)有限公司