一種食用香精香料中七種成分同時測定的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食用香精香料中七種成分同時測定的方法，包括以下步驟：萃取溶液的配制、標準溶液的配制、樣品溶液的制備、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析以及含量的計算。本發(fā)明通過對食用香精香料中七種成分測定方法的前處理條件、液相色譜條件和質譜條件的優(yōu)化，建立了一種簡便、快速、高通量的測定方法，本發(fā)明具有操作簡單、靈敏度高、回收率好、重現(xiàn)性好且檢測時間短、溶劑消耗小、檢測通量高、檢測效率高的優(yōu)點。
【專利說明】一種食用香精香料中七種成分同時測定的方法
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于理化檢驗【技術領域】，具體涉及一種食用香精香料中七種成分水楊酸、 環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯同時測定的方法。

【背景技術】
[0003] 水楊酸又名鄰羥基苯甲酸，是重要的精細化工原料，在醫(yī)藥工業(yè)中，水楊酸是一種 用途極廣泛的消毒、防腐劑，許多國家都將水楊酸列為限用添加劑，在我國水楊酸禁止用于 食品加工生產，我國國標GB 7916-1987規(guī)定其最高允許用量質量分數(shù)為0.15%。水楊酸為 有機酸類防腐劑，在酸性條件下具有較強的抗真菌性質，毒理學試驗研究表明，防腐劑成分 用量過多會對人體肝臟產生危害，甚至致癌。美國食品藥品管理局、美國皮膚病學會認為水 楊酸的安全限量為〇· 5%-2· 0%。目前已報道測定水楊酸的檢測方法有光度法、氣相色譜法、 液相色譜法等。
[0004] 苯甲酸是食品工業(yè)中常用的防腐劑，能有效防止酵母、霉菌、細菌的生長，但過量、 長期食用會危害人體肝臟、腎臟功能。國家標準GB2760 - 2007中明確規(guī)定了苯甲酸的最 大使用限量。在進出口貿易中，日本等國要求這種物質的檢出量小于lmg/kg，而我國標準 GB/T 23495-2009中苯甲酸為1.8mg/kg，GB/T 5009.29-2003中苯甲酸的檢出限均為lmg/ kg。目前已報道測定苯甲酸的檢測方法有氣相色譜-質譜法、高效液相色譜法等。
[0005] 對羥基苯甲酸酯(又稱尼泊金酯)，因其良好的殺菌能力和穩(wěn)定性，被廣泛應用于 食品、飲料、化妝品等諸多領域，主要作為防腐劑。尼泊金酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等， 其抑菌作用隨著醇烴基碳原子數(shù)的增加而增加，且碳鏈愈長，毒性愈小，用量愈少。生產過 程中，通常是將幾種酯混合使用，在提高溶解度的同時具有更好的防腐性能。國內外大量的 實際應用也證實了混用的尼泊金酯比單一的抑菌效果強。尼泊金酯雖有良好的防腐作用， 但也有一定的毒性。中國、加拿大、日本和歐盟等許多國家和國際組織對食品中對羥基苯甲 酸酯類防腐劑的使用制定了添加限量。Routledge等首次發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸酯具有雌激素 活性，且其過量使用會危害人體健康。中國食品添加劑的使用標準GB 2760-2011規(guī)定了單 一品種和混合使用的最大使用量，其中對羥基苯甲酸丙酯被明確禁止使用，對羥基苯甲酸 丁酯也未被列入允許使用名單。尼泊金酯的測定方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、 氣相色譜法、氣相色譜-質譜法等。
[0006] 甜蜜素，化學名為環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種低熱量人工合成甜味劑，是食品生產 中常用的人工合成非營養(yǎng)型甜味劑，其甜度是蔗糖30-40倍，使用成本低，因此在飲料、糕 點、蜜餞等食品中廣泛添加。近年來，食品中甜蜜素含量超標及在禁止添加甜蜜素的食品中 添加甜蜜素的報道日漸增多，因此，甜蜜素過量食用，就會因攝入過量對人體的肝臟和神經(jīng) 系統(tǒng)造成危害，特別是對代謝排毒的能力較弱的老人、孕婦、小孩危害更明顯。甜蜜素的測 定方法主要有氣相色譜/質譜法、離子色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法等。
[0007] 目前，國內外公開文獻無關于這七種成分同時檢測的方法。
[0008]


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種食用香精香料中七種成分水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸 鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯同時測定的方法。
[0010] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，通過長期的研究和探索，在方法對比、優(yōu)化的基礎上 提出了一種食用香精香料中七種成分(水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸 甲酯、乙酯、丙酯、丁酯）同時測定的方法，用于檢測食用香精香料中的水楊酸、環(huán)己基氨基 磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯。本發(fā)明考察研究了食用香精香料中 水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的前處理條件、液 相色譜條件和質譜條件，為簡便、快速、高通量的測定食用香精香料中的七種成分提供了技 術支持。
[0011] 本發(fā)明的技術方案為：所述的測定方法包括以下步驟： A、 萃取溶液的配制：取甲醇制備成體積比7:3的甲醇-水溶液即為萃取溶液； B、 標準溶液的配制：用含內標的萃取溶液分別配制水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲 酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的標準溶液； C、 樣品溶液的制備：使用含內標的萃取溶液萃取食用香精香料樣品，過有機相濾膜后 得到樣品溶液； D、 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析：利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分別對標準 溶液和樣品溶液進行檢測分析； E、 食用香精香料中七種成分水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、 乙酯、丙酯、丁酯含量的計算。
[0012] B步驟中所述標準溶液的配制是：分別稱取水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、 對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯各20mg，用甲醇溶解后轉移至100mL棕色容量瓶中，定 容至刻度，分別得到單一標準儲備液；稱取水楊酸-d4 10mg，用甲醇溶解后轉移至50mL棕 色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到內標儲備液；分別取單一標準儲備液0. 5~2mL至50mL棕 色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級混合標準溶液；取內標儲備液lmL至50mL棕色 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級內標標準溶液；分別準確移取0. lmL、0. 5mL、lmL、 2mL、5mL的一級混合標準溶液至50mL棕色容量瓶中，每個棕色容量瓶均加入lmL -級內標 標準溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列標準溶液。
[0013] 取〇· 4mL內標儲備液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含內標的 萃取溶液。所述含內標的萃取溶液中的內標物為水楊酸-d4。
[0014] C步驟中所述樣品溶液的制備方法是：稱取0· 5g試樣于50mL具塞錐形瓶中，準 確加入25mL含內標的萃取溶液，用I50r/min振蕩萃取2〇min，取上清液過有機相濾膜，濾 液為樣品溶液。所述的有機相濾膜為0.22 μ m聚醚砜濾膜。所述振蕩萃取的振蕩頻率為 120-180r/min，萃取時間為 l〇-3〇min。
[0015] D步驟中所述的色譜分析條件為：色譜柱：C18，1_ 7 μ m，2· IX 100mm柱；流動相為 甲醇A和0· 05%甲酸水溶液B ;流速：〇. 4mL/min ;進樣量：5μ L ;柱溫：40°C;樣品溫度：10°C; 采用梯度洗脫程序，即初始A是10%, B是90%，lmin時A是35%，B是65%，4min時A是65%， B 是 35%，6min 時初始 A 是 90%，B 是 10%，7min 時 A 是 90%，B 是 10%，8min 時 A 是 10%，B 是 90%，lOmin時A是10%, B是90%。所述的質譜條件為：電噴霧離子源（ESI)負離子模式，掃 描方式為多反應監(jiān)測模式，電噴霧電壓為-4500V，離子源溫度600°C，氣簾氣：25Psi ;霧化 氣：55Psi ;輔助加熱氣：50Psi ;水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙 酯、丙酯、丁酯和水楊酸_d4的定量離子對分別為：m/z 92. 9、79· 9、77· 0、92· 0、91· 9、92· 0、 92. 1、96. 9。其它質譜參數(shù)見表1。
[0016] E步驟中所述含量的計算是：首先以標準溶液所檢測出的目標物和內標物的色譜 峰面積比對應其相應濃度比進行回歸分析得到標準曲線線性方程，然后將樣品溶液檢出的 目標物的色譜峰面積，代入標準曲線線性方程，即得到樣品中水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、 苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的含量。
[0017] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，通過對食用香精香料中水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、 苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的前處理條件、色譜條件和質譜條件的優(yōu)化， 建立了一種簡便、快速、高通量的測定方法，為食用香精香料中的七種成分的檢測提供了技 術支持。本發(fā)明具有操作簡單、靈敏度高、回收率好、重現(xiàn)性好且檢測時間短、溶劑消耗小、 檢測通量高、檢測效率高的優(yōu)點，對于監(jiān)督食用香精香料的質量安全具有非常重要的意義。
[0018]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明的測定方法的流程圖。
[0020] 圖2為水楊酸的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0021]圖3為環(huán)己基氨基磺酸鈉的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0022] 圖4為苯甲酸的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0023]圖5為對羥基苯甲酸甲酯的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0024]圖6為對羥基苯甲酸乙酯的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0025]圖7為對羥基苯甲酸丙酯的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0026]圖8為對羥基苯甲酸丁酯的標準曲線線性方程及線性回歸系數(shù)坐標圖。
[0027]圖9為標準溶液中水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、 丙酯、丁酯的色譜圖。

【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0029] 實施例丄： 本發(fā)明所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，包括以下步驟： (1) 卒取溶液的配制：取甲醇制備成體積比7:3的甲醇-水溶液即為萃取溶液； (2) 標準溶液的配制：用含內標的萃取溶液分別配制水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲 酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的標準溶液； (3) 樣品溶液的制備：使用含內標的萃取溶液萃取食用香精香料樣品，過有機相濾膜后 得到樣品溶液； (4) 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析：利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分別對標 準溶液和樣品溶液進行檢測分析； (5) 食用香精香料中七種成分水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、 乙酯、丙酯、丁酯含量的計算。
[0030] B步驟中所述標準溶液的配制是：分別稱取水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉 、苯甲酸、 對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯各2〇mg,用甲醇溶解后轉移至1 〇〇mL棕色容量瓶中，定 容至刻度，分別得到單一標準儲備液；稱取水楊酸-d4 l〇mg，用甲醇溶解后轉移至50mL棕 色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到內標儲備液；分別取單一標準儲備液0. 5?2mL至50mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級混合標準溶液；取內標儲備液lmL至50mL棕 色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級內標標準溶液；分別準確移取0. lmL、0. 5mL、 lmL、2mL、5mL的一級混合標準溶液至50mL棕色容量瓶中，每個棕色容量瓶均加入lmL -級 內標標準溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列標準溶液。所述分別取單一標準儲備液 〇_5mL-2mL具體為分別取水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉 、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯 單一標準儲備液〇· 5mL和取苯甲酸單一標準儲備液2mL。
[0031] 取〇.4mL內標儲備液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含內標的 萃取溶液。所述含內標的萃取溶液中的內標物為水楊酸-d4。
[0032] C步驟中所述樣品溶液的制備方法是：稱取〇· 5g試樣于50mL具塞錐形瓶中，準確 加入25mL含內標的萃取溶液，用150r/min振蕩萃取20min，取上清液過有機相濾膜，濾液為 樣品溶液。樣品溶液用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀進行分析。
[0033] 所述的有機相濾膜為0. 22 μ m聚醚砜濾膜。D步驟所述的液相色譜分析條件為： 色譜柱：C18,1. 7 μ m, 2. 1 X 100_柱；流動相為甲醇A和0· 05%甲酸水溶液B ;流速：0. 4mL/ min;進樣量：5yL;柱溫：40°C ;樣品溫度：10°C ;采用梯度洗脫程序，即初始A是10%，B是 90%，lmin 時 A 是 35%，B 是 65%, 4min 時 A 是 65%，B 是 35%，6min 時初始 A 是 90%，B 是 10%， 7min 時 A 是 90%，B 是 10%, 8min 時 A 是 10%，B 是 90%，lOmin 時 A 是 10%，B 是 90%。所述 的質譜條件為：電噴霧離子源（ESI)負離子模式，掃描方式為多反應監(jiān)測模式，電噴霧電壓 為-4 5〇OV,離子源溫度600°C，氣簾氣：25Psi ;霧化氣：55Psi ;輔助加熱氣：50Psi ;水楊酸、 環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和水楊酸-d4的定量離子 對分別為：m/z 92. 9、79· 9、77· 0、92. 0、91. 9、92· 0、92. 1、96· 9。其它質譜參數(shù)見表 1。
[0034]表1食用香精香料中七種成分的質譜參數(shù)表 .... 而麗-~棚" ,μμμμμ,-1，- ΜΜ' ΜΙΜ? MmmmK==-mmm mmmm.....^immm.....' mmmmmmmi mrnii_____ "f·1 ~~爾? -丨丨丨… +..-.

【權利要求】
1. 一種食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于包括以下步驟： A、 萃取溶液的配制：取甲醇制備成體積比7:3的甲醇-水溶液即為萃取溶液； B、 標準溶液的配制：用含內標的萃取溶液分別配制水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲 酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的標準溶液； C、 樣品溶液的制備：使用含內標的萃取溶液萃取食用香精香料樣品，過有機相濾膜后 得到樣品溶液； D、 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析：利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分別對標準 溶液和樣品溶液進行檢測分析； E、 食用香精香料中七種成分水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、 乙酯、丙酯、丁酯含量的計算。
2. 根據(jù)權利要求1所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于B步驟 中所述標準溶液的配制是：分別稱取水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲 酯、乙酯、丙酯、丁酯各20mg，用甲醇溶解后轉移至lOOmL棕色容量瓶中，定容至刻度，分別 得到單一標準儲備液；稱取水楊酸-d4 10mg，用甲醇溶解后轉移至50mL棕色容量瓶中，甲 醇定容至刻度，得到內標儲備液；分別取單一標準儲備液〇. 5~2mL至50mL棕色容量瓶中，用 甲醇定容至刻度，得到一級混合標準溶液；取內標儲備液lmL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇 定容至刻度，得到一級內標標準溶液；分別準確移取〇. lmL、0. 5mL、lmL、2mL、5mL的一級混 合標準溶液至50mL棕色容量瓶中，每個棕色容量瓶均加入lmL -級內標標準溶液,用萃取 溶液定容至刻度，得到系列標準溶液。
3. 根據(jù)權利要求1所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于取 0.4mL內標儲備液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含內標的萃取溶液。
4. 根據(jù)權利要求1或3所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于所 述含內標的萃取溶液中的內標物為水楊酸-d4。
5. 根據(jù)權利要求1所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于C步驟 中所述樣品溶液的制備方法是：稱取〇. 5g試樣于50mL具塞錐形瓶中，準確加入25mL含內 標的萃取溶液，用150r/min振蕩萃取20min，取上清液過有機相濾膜，濾液為樣品溶液。
6. 根據(jù)權利要求1或5所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于所 述的有機相濾膜為〇. 22 μ m聚醚砜濾膜。
7. 根據(jù)權利要求1所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于D步驟 中所述的液相色譜分析條件為：色譜柱采用C18,1. 7 μ m，2. 1 X 100mm色譜柱；流動相為甲 醇A和0. 05%甲酸水溶液B ;流速：0. 4mL/min ;進樣量：5 μ L ;柱溫：40°C ;樣品溫度：10°C ; 采用梯度洗脫程序，即初始A是10%，B是90%，lmin時A是35%，B是65%，4min時A是65%， B 是 35%，6min 時初始 A 是 90%，B 是 10%，7min 時 A 是 90%，B 是 10%，8min 時 A 是 10%，B 是 90%，lOmin時A是10%，B是90% ;所述的質譜條件為采用電噴霧離子源（ESI)負離子模式，掃 描方式為多反應監(jiān)測模式，電噴霧電壓為-4500V，離子源溫度600°C，氣簾氣：25Psi，霧化 氣：55Psi，輔助加熱氣：50Psi，水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、乙 酯、丙酯、丁酯和水楊酸-d4的定量離子對分別為：m/z 92. 9、79. 9、77. 0、92. 0、91. 9、92. 0、 92. 1 λ 96. 9 〇
8. 根據(jù)權利要求1所述食用香精香料中七種成分同時測定的方法，其特征在于Ε步驟 中所述含量的計算是：首先以標準溶液所檢測出的目標物和內標物的色譜峰面積比對應其 相應濃度比進行回歸分析得到標準曲線線性方程，然后將樣品溶液檢出的目標物的色譜峰 面積，代入標準曲線線性方程，即得到樣品中水楊酸、環(huán)己基氨基磺酸鈉、苯甲酸、對羥基苯 甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK104297359SQ201410362880
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權日:2014年7月28日
【發(fā)明者】王素娟, 繆明明, 秦云華, 張承明, 夏建軍, 王嵐, 蔣次清, 陳進雄, 羅林 申請人:云南中煙工業(yè)有限責任公司