一種基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，通過基頻信號(hào)調(diào)制激發(fā)光源作用于待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光，使熒光成周期性增強(qiáng)與衰減，再通過二倍頻方波信號(hào)，控制采樣周期，將熒光上升周期和衰減周期都一分為二，分別獨(dú)立采樣后計(jì)算兩部分采樣差值并相加得到熒光信號(hào)的強(qiáng)度表征值，得到待測(cè)標(biāo)的物的濃度值。本發(fā)明的方法不僅同樣可以消除樣品中底物的熒光干擾，還可以消除環(huán)境背景光、空間電磁波工頻干擾等信號(hào)，提升檢測(cè)樣品熒光測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，具備常規(guī)時(shí)間分辨熒光方法無法完成的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域標(biāo)的物的熒光強(qiáng)度檢測(cè)。
【專利說明】一種基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于借助于測(cè)定材料的化學(xué)或物理性質(zhì)來測(cè)試或分析材料的【技術(shù)領(lǐng)域】，特 別涉及一種可以消除樣品中底物的熒光干擾、消除環(huán)境背景光、消除空間電磁波工頻干擾 等信號(hào)以提升檢測(cè)樣品熒光測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度、提高熒光檢測(cè)精準(zhǔn)度的基于相均衡倍頻調(diào)制原 理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，免疫層析（lateral flow immunoassay, LFIA)快速檢測(cè)試紙條多以膠體 金或者熒光色素作為標(biāo)記物。近年來免疫熒光檢測(cè)領(lǐng)域在技術(shù)上取得突破，發(fā)展了時(shí)間分 辨熒光（Time-resolved fluorescence，TRF)免疫分析技術(shù)，此技術(shù)具有靈敏度高、特異性 強(qiáng)、熒光壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性好和無放射性污染等特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)，是未來 即時(shí)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的重要方向。
[0003] 時(shí)間分辨突光（Time-resolved fluorescence, TRF)免疫分析技術(shù)的具體操作過 程是：在試紙條上的檢測(cè)線（T)和質(zhì)控線（C)區(qū)域進(jìn)行熒光色素染色處理；將試紙條放入檢 測(cè)樣品，當(dāng)檢測(cè)樣品中含有能和熒光色素結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)的物時(shí)，即能對(duì)樣品的測(cè)量標(biāo)的物 進(jìn)行熒光色素染色；然后利用激發(fā)光照射樣品，激發(fā)熒光色素發(fā)出熒光，由最終的熒光的強(qiáng) 度值分析出測(cè)量標(biāo)的物的種類、濃度等信息。本技術(shù)要求在短時(shí)間根據(jù)熒光信息對(duì)測(cè)量標(biāo) 的物進(jìn)行正確的分析。
[0004] 然而，激發(fā)光照射激發(fā)出熒光的過程中，除了測(cè)量標(biāo)的物發(fā)射的熒光，也即是標(biāo)記 在樣品上的熒光色素的熒光信息外，還包括兩大類干擾熒光，干擾熒光包括環(huán)境背景熒光 和雜質(zhì)激發(fā)熒光。所謂環(huán)境背景熒光，包括有樣品底液或試紙條本身的自發(fā)熒光、反射的波 段較寬的熒光、檢測(cè)系統(tǒng)的漏光及電磁干擾等；雜質(zhì)激發(fā)熒光主要是由于樣品中包含非測(cè) 量標(biāo)的物的物質(zhì)，這類物質(zhì)也可能會(huì)被激發(fā)光激發(fā)出熒光，只是這類熒光的激發(fā)和淬滅過 程和測(cè)量標(biāo)的物熒光過程不同。上述這些干擾熒光波段與熒光色素發(fā)出的熒光波段相重疊 時(shí)，如果干擾突光和突光色素發(fā)出的突光相比，強(qiáng)度極其微弱，貝 1J利用傳統(tǒng)的時(shí)間分辨突光 檢測(cè)方法可以測(cè)量出標(biāo)的物的濃度信息，但是，當(dāng)熒光色素所發(fā)出的熒光的強(qiáng)度不足夠強(qiáng) 時(shí)，則會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)量分析的結(jié)果。
[0005] 在傳統(tǒng)的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法中，激發(fā)光照射樣品激發(fā)熒光發(fā)射衰減的過程 中，在熒光發(fā)射最大值時(shí)并不檢測(cè)熒光，而是延遲200 μ s左右時(shí)間，等待雜質(zhì)激發(fā)熒光淬 滅，再開始檢測(cè)熒光，從而達(dá)到消除上述第二類干擾熒光的影響，以得到染色熒光色素所發(fā) 出的熒光強(qiáng)度，從而獲取測(cè)量標(biāo)的物相對(duì)準(zhǔn)確的信息。在此方法中，雖然能消除干擾物質(zhì)激 發(fā)熒光的影響，但是由于干擾物質(zhì)具有不確定性，控制檢測(cè)熒光延時(shí)也具有不確定性，故不 能肯定完全消除所有干擾物質(zhì)激發(fā)熒光，且上述方法并不能消除第一類環(huán)境背景光干擾， 如背景自發(fā)熒光、檢測(cè)系統(tǒng)漏光和電磁干擾等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，現(xiàn)有技術(shù)中，激發(fā)光照射激發(fā)出熒光的過程中，除了測(cè) 量標(biāo)的物發(fā)射的熒光，也即是標(biāo)記在樣品上的熒光色素的熒光信息外，還包括環(huán)境背景熒 光和雜質(zhì)激發(fā)熒光兩大類干擾熒光，而導(dǎo)致的雖然在傳統(tǒng)的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法中，可 以在激發(fā)光照射樣品激發(fā)熒光發(fā)射衰減的過程中，在熒光發(fā)射最大值的時(shí)間點(diǎn)延遲200 μ s 左右時(shí)間，等待雜質(zhì)激發(fā)熒光淬滅，再開始檢測(cè)熒光，從而達(dá)到消除上述第二類干擾熒光的 影響，以得到染色熒光色素所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，從而獲取測(cè)量標(biāo)的物相對(duì)準(zhǔn)確的信息，但是 由于干擾物質(zhì)具有不確定性，控制檢測(cè)熒光延時(shí)也具有不確定性，故不能肯定完全消除所 有干擾物質(zhì)激發(fā)熒光，且并不能消除第一類環(huán)境背景光干擾，如背景自發(fā)熒光、檢測(cè)系統(tǒng)漏 光和電磁干擾等的問題，進(jìn)而提供了一種優(yōu)化的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光 檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種采用基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光 檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟： 步驟1. 1 :采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成頻率為X的規(guī)則波信號(hào)作為基頻信號(hào)，所述頻率為 X的規(guī)則波信號(hào)調(diào)制激發(fā)光源，光源發(fā)射激發(fā)光，激發(fā)光作用于待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光； 步驟1. 2 :控制光電傳感器件以Ν倍于X的頻率對(duì)被觸發(fā)的熒光進(jìn)行采樣，得到采樣周 期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai ;i>0 ;30 < Ν < 80 ; 步驟1. 3 :將采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&進(jìn)行信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換，得到每 個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai對(duì)應(yīng)的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào)Di ;i>0 ; 步驟1. 4 :將每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)數(shù)字Di根據(jù)采樣時(shí)間作圖得到光譜曲線；所述 光譜曲線包括熒光發(fā)光周期S和熒光衰減周期R ; 步驟1. 5 :對(duì)頻率為X的基頻信號(hào)進(jìn)行倍頻調(diào)制，產(chǎn)生頻率為X'的倍頻信號(hào)，X' =2X ; 根據(jù)倍頻信號(hào)將熒光發(fā)光周期S分為時(shí)間相等的熒光發(fā)光周期Si和熒光發(fā)光周期S2，將熒 光衰減周期R分為時(shí)間相等的熒光衰減周期凡和熒光衰減周期R 2 ; 步驟1. 6 :對(duì)熒光發(fā)光周期SpS2和熒光衰減周期Ri、R2在光譜曲線上進(jìn)行積分運(yùn)算，得 到熒光發(fā)光周期Si的積分面積記為Φ 1，熒光發(fā)光周期S2的積分面積記為Φ 2,熒光衰減周 期札的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R2的積分面積記為Φ4 ;Φ2 > Φ1>0, Φ3>Φ4>0 ; 步驟1. 7 :將熒光發(fā)光周期S2的積分面積Φ2減去熒光發(fā)光周期Si的積分面積Φ 1， 得到S' =Φ2-Φ1，S'記為熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值；將熒光衰減周期&的積分面積 Φ3減去熒光衰減周期R2的積分面積Φ4,得到R' =Φ3-Φ4, R'記為熒光衰減周期的熒 光強(qiáng)度值；將熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值S'加上熒光衰減周期的熒光強(qiáng)度值R'，得到 Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3_Φ4,記為熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值；S' >0, R' >0 ; 步驟1. 8 :熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值△ Φ即表征待測(cè)標(biāo)的物的熒光信號(hào)測(cè)量值， 通過標(biāo)定方法得到待測(cè)標(biāo)的物濃度值。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟1. 1中，采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成的頻率為X的規(guī)則波信號(hào)為方 波信號(hào)。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟1. 1中的激發(fā)光源通過雙光源調(diào)制。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟1. 2中，N=50。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟1. 2中，光電傳感器件設(shè)為光電二極管。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟1. 3中的信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換包括以下步驟： 步驟2. 1 :將以N倍于X的采樣頻率采樣到的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai進(jìn)行信號(hào)放 大得到放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/ ; 步驟2. 2 :將放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/通過高通濾波模塊進(jìn)行濾波，濾除低頻噪聲和工頻 干擾； 步驟2. 3 :將濾波后的放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/通過模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到與所述 采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai對(duì)應(yīng)的采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào) Di〇
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟1. 3中的濾波為中值濾波。
[0014] 本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，通 過基頻信號(hào)調(diào)制激發(fā)光源作用于待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光，使熒光成周期性增強(qiáng)與衰減，再 通過二倍頻方波信號(hào)，控制采樣周期，將熒光上升周期和衰減周期都一分為二，分別獨(dú)立采 樣后計(jì)算兩部分采樣差值并相加得到熒光信號(hào)的強(qiáng)度表征值，得到待測(cè)標(biāo)的物的濃度值。 本發(fā)明的方法不僅同樣可以消除樣品中底物的熒光干擾，還可以消除環(huán)境背景光、空間電 磁波工頻干擾等信號(hào)，提升檢測(cè)樣品熒光測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，具備常規(guī)時(shí)間分辨熒光方法無法 完成的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域標(biāo)的物的熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明中基頻信號(hào)和倍頻信號(hào)的示意圖，其中A為基頻信號(hào)，B為倍頻信 號(hào)； 圖2為本發(fā)明中步驟1. 6的對(duì)熒光發(fā)光周期Sp S2和熒光衰減周期凡、R2在光譜曲線 上進(jìn)行積分運(yùn)算的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于 此。
[0017] 本發(fā)明涉及一種采用基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，所述方 法包括以下步驟： 步驟1. 1 :采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成頻率為X的規(guī)則波信號(hào)作為基頻信號(hào)，所述頻率為 X的規(guī)則波信號(hào)調(diào)制激發(fā)光源，光源發(fā)射激發(fā)光，激發(fā)光作用于待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光； 步驟1. 2 :控制光電傳感器件以N倍于X的頻率對(duì)被觸發(fā)的熒光進(jìn)行采樣，得到采樣周 期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai ;i>0 ;30 < N < 80 ; 步驟1. 3 :將采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&進(jìn)行信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換，得到每 個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai對(duì)應(yīng)的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào)Di ;i>0 ; 步驟1. 4 :將每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)數(shù)字Di根據(jù)采樣時(shí)間作圖得到光譜曲線；所述 光譜曲線包括熒光發(fā)光周期S和熒光衰減周期R ; 步驟1. 5 :對(duì)頻率為X的基頻信號(hào)進(jìn)行倍頻調(diào)制，產(chǎn)生頻率為X'的倍頻信號(hào)，X' =2X ; 根據(jù)倍頻信號(hào)將熒光發(fā)光周期S分為時(shí)間相等的熒光發(fā)光周期Si和熒光發(fā)光周期S2，將熒 光衰減周期R分為時(shí)間相等的熒光衰減周期凡和熒光衰減周期R 2 ; 步驟1. 6 :對(duì)熒光發(fā)光周期SpS2和熒光衰減周期Ri、R2在光譜曲線上進(jìn)行積分運(yùn)算，得 到熒光發(fā)光周期Si的積分面積記為Φ 1，熒光發(fā)光周期S2的積分面積記為Φ 2,熒光衰減周 期札的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R2的積分面積記為Φ4 ;Φ2 > Φ1>0, Φ3>Φ4>0 ; 步驟1. 7 :將熒光發(fā)光周期S2的積分面積Φ2減去熒光發(fā)光周期Si的積分面積Φ 1， 得到S' =Φ2-Φ1，S'記為熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值；將熒光衰減周期&的積分面積 Φ3減去熒光衰減周期R2的積分面積Φ4,得到R' =Φ3-Φ4, R'記為熒光衰減周期的熒 光強(qiáng)度值；將熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值S'加上熒光衰減周期的熒光強(qiáng)度值R'，得到 Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3_Φ4,記為熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值；S' >0, R' >0 ; 步驟1. 8 :熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值△ Φ即表征待測(cè)標(biāo)的物的熒光信號(hào)測(cè)量值， 通過標(biāo)定方法得到待測(cè)標(biāo)的物濃度值。
[0018] 本發(fā)明提供的方法中，測(cè)量標(biāo)的物通過激發(fā)光照射而發(fā)出熒光，并對(duì)得到的熒光 信號(hào)進(jìn)行處理，能夠迅速且容易的求出熒光強(qiáng)度值，繼而通過標(biāo)定方法得到標(biāo)的物濃度值。
[0019] 本發(fā)明中，步驟1. 1采用如圖1所示的頻率為X的基頻信號(hào)A，完成了控制激發(fā)光 源并對(duì)待測(cè)標(biāo)的物的觸發(fā)熒光的作業(yè)，步驟1. 2則是利用N倍于X的頻率控制采樣動(dòng)作對(duì) 被觸發(fā)的熒光進(jìn)行采樣，其優(yōu)勢(shì)在于由于頻率較大，可以獲得不失真的熒光發(fā)光和衰減過 程中的熒光強(qiáng)度光譜曲線。步驟1. 3是數(shù)模轉(zhuǎn)化的過程，并同時(shí)完成了采樣周期中每個(gè)時(shí) 刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&的信號(hào)解調(diào)及濾波，保證去除由于表面粗糙、有背景干擾物等原因會(huì) 發(fā)生的熒光的抖動(dòng)。步驟1. 4中，當(dāng)每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&轉(zhuǎn)化為每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng) 度信號(hào)數(shù)字Di后，實(shí)則是每個(gè)時(shí)刻的電壓值，即代表每個(gè)時(shí)刻的光強(qiáng)，可以用于制作基于 熒光檢測(cè)時(shí)間周期和熒光強(qiáng)度數(shù)值的光譜曲線，并根據(jù)光譜曲線進(jìn)行積分得到光譜積分曲 線，此時(shí)曲線有明顯的上升段和下降段，光譜曲線的上升段為熒光發(fā)光周期S，光譜曲線的 下降段為熒光衰減周期R。步驟1. 5中，采用如圖1所示的頻率為2X的倍頻信號(hào)B進(jìn)行倍 頻調(diào)制，將熒光發(fā)光周期S分為時(shí)間相等的兩部分，熒光衰減周期R分為時(shí)間相等的兩部 分，并在步驟1. 6中對(duì)熒光發(fā)光周期S的時(shí)間相等的兩部分和熒光衰減周期R時(shí)間相等的 兩部分在光譜曲線上進(jìn)行積分運(yùn)算，得到熒光發(fā)光周期S的兩部分的積分面積和熒光衰減 周期R的兩部分的積分面積，熒光發(fā)光周期&的積分面積記為Φ 1，熒光發(fā)光周期S2的積 分面積記為Φ2,熒光衰減周期&的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R 2的積分面積記為 Φ4,如圖2所示。在步驟1. 7中，將熒光發(fā)光周期S的兩部分積分面積相減，得到熒光發(fā)光 周期的熒光強(qiáng)度值Φ2-Φ1，將熒光衰減周期R的兩部分積分面積相減，得到熒光衰減周期 的熒光強(qiáng)度值Φ3-Φ4,此時(shí)的熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值和熒光衰減周期的熒光強(qiáng)度值 已經(jīng)消除了同樣處于熒光發(fā)光周期或熒光衰減周期的樣品底物的熒光干擾，亦消除了同樣 處于熒光發(fā)光周期或熒光衰減周期的環(huán)境背景光、空間電磁波工頻干擾等信號(hào)的干擾，且 由于采用的熒光發(fā)光周期和熒光衰減周期的積分面積分別時(shí)間相等，故只需要各減一次即 能得到熒光發(fā)光周期內(nèi)的熒光實(shí)際強(qiáng)度值和熒光衰減周期內(nèi)的熒光實(shí)際強(qiáng)度值，最后將其 相加，得到熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3-Φ4,簡(jiǎn)便易操作。步驟1.8將 熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值△ Φ通過標(biāo)定方法，最后得到待測(cè)標(biāo)的物濃度值，完成待測(cè) 標(biāo)的物濃度的檢測(cè)。
[0020] 本發(fā)明采用的方法不僅可以消除待測(cè)標(biāo)的物中底物的熒光干擾，還可以消除環(huán)境 背景光、空間電磁波工頻干擾等信號(hào)，提升了待測(cè)標(biāo)的物熒光測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，更為安全可 靠，可行性強(qiáng)，可操作性強(qiáng)，具有常規(guī)時(shí)間分辨熒光的方法無法具備的優(yōu)勢(shì)。
[0021] 本發(fā)明中，設(shè)置激發(fā)光源按一定頻率X開關(guān)，使觸發(fā)熒光成周期性增強(qiáng)與衰減，從 而實(shí)現(xiàn)控制待測(cè)標(biāo)的物的熒光發(fā)射周期和衰減周期的目的。
[0022] 本發(fā)明中，激發(fā)光可以為普通光源，如發(fā)光二極管，亦可以設(shè)置為激光。
[0023] 本發(fā)明中，激發(fā)光源的頻率X是根據(jù)熒光激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)決定的，不同的待 測(cè)標(biāo)的物，其激發(fā)波長(zhǎng)不相同。
[0024] 本發(fā)明中，步驟1. 8的標(biāo)定方法包括以下步驟： 步驟3. 1 :利用標(biāo)準(zhǔn)濃度樣本進(jìn)行熒光激發(fā)； 步驟3. 2 :測(cè)量出標(biāo)準(zhǔn)濃度樣本對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)值； 步驟3. 3 :通過分段線性插值對(duì)光強(qiáng)值進(jìn)行換算，得到不同的熒光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)的標(biāo)的 物濃度值； 步驟3. 4 :對(duì)應(yīng)查詢，從熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值△ Φ對(duì)應(yīng)得到待測(cè)標(biāo)的物的熒 光信號(hào)測(cè)量值。
[0025] 本發(fā)明中，采用標(biāo)定方法來確定熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值△ Φ對(duì)應(yīng)的待測(cè) 標(biāo)的物的熒光信號(hào)測(cè)量值，一則是為了使用標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)量方式對(duì)所檢測(cè)的熒光信號(hào)測(cè)量值的 精度進(jìn)行檢測(cè)是否符合標(biāo)準(zhǔn)，適用于精密度較高的測(cè)量，二則亦適用于校準(zhǔn)，保證熒光信號(hào) 測(cè)量值的精準(zhǔn)。
[0026] 所述步驟1. 1中，采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成的頻率為X的規(guī)則波信號(hào)為方波信號(hào)。
[0027] 本發(fā)明中，將采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成的頻率為X的規(guī)則波信號(hào)設(shè)置為方波信 號(hào)，因?yàn)槔硐氲姆讲ㄊ窃诟吆偷蛢蓚€(gè)值之間是瞬時(shí)變化的，本發(fā)明采用方波來作為基頻信 號(hào)并在后續(xù)的步驟中利用基頻信號(hào)產(chǎn)生同為方波信號(hào)的倍頻信號(hào)，整體數(shù)據(jù)處理更為簡(jiǎn) 便，亦更能直觀的顯示本發(fā)明中涉及到的光譜曲線。
[0028] 所述步驟1. 1中的激發(fā)光源通過雙光源調(diào)制。
[0029] 本發(fā)明中，采用雙光源調(diào)制激發(fā)光源，保證了激發(fā)光源的穩(wěn)定性，使得其在被激發(fā) 過程中能穩(wěn)定統(tǒng)一的作用在待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光。
[0030] 本發(fā)明中，不同波長(zhǎng)激發(fā)光源采用的激發(fā)光顏色不同。
[0031] 本發(fā)明中，由于步驟1. 1中的激發(fā)光源通過雙光源調(diào)制，故光學(xué)檢測(cè)模塊一般設(shè) 置為雙光源反射式的光學(xué)檢測(cè)模塊，涉及雙共軛結(jié)構(gòu)的光路設(shè)計(jì)，在實(shí)際工作過程中，一般 以高穩(wěn)定性的LED為激發(fā)光源，并以光電傳感器件檢測(cè)當(dāng)前掃描位置的熒光光強(qiáng)，將信息 傳輸回控制電路進(jìn)行分析處理，最終得到待測(cè)標(biāo)的物的濃度數(shù)據(jù)。
[0032] 本發(fā)明中，一般采用LED完成激發(fā)光源的作業(yè)，因 LED具有光譜帶寬窄，溫度系數(shù) 低，散射角度小等優(yōu)點(diǎn)。
[0033] 所述步驟1. 2中，N=50。
[0034] 本發(fā)明中，將步驟1. 2中控制光電傳感器件的對(duì)被觸發(fā)的熒光進(jìn)行采樣N倍于X 的頻率設(shè)置為N為50, 一般情況下，N為50時(shí)的采樣頻率可以較好的采樣到各點(diǎn)信號(hào)，又不 會(huì)由于采樣過于密集導(dǎo)致光譜曲線的失真。
[0035] 所述步驟1. 2中，光電傳感器件設(shè)為光電二極管。
[0036] 本發(fā)明中，光電傳感器件是常用的采用光電元件作為檢測(cè)元件的傳感器，其能將 光信號(hào)的變化借助光電元件將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。本發(fā)明中，只要能將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電 信號(hào)的光電傳感器件在步驟1. 2中均適用。一般情況下，采用光電二極管即能滿足發(fā)明需 求。
[0037] 所述步驟1. 3中的信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換包括以下步驟： 步驟2. 1 :將以N倍于X的采樣頻率采樣到的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai進(jìn)行信號(hào)放 大得到放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/ ; 步驟2. 2 :將放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/通過高通濾波模塊進(jìn)行濾波，濾除低頻噪聲和工頻 干擾； 步驟2. 3 :將濾波后的放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/通過模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到與所述 采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai對(duì)應(yīng)的采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào) Di〇
[0038] 本發(fā)明中，信號(hào)解調(diào)中需要將光源的光信號(hào)調(diào)制至頻率X并轉(zhuǎn)化成有效的電壓信 號(hào)，然后通過放大采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&并通過高通濾波模塊，濾除低頻 噪聲和工頻干擾，濾除噪聲和干擾后，利用頻率為X的基頻信號(hào)和頻率為X'的倍頻信號(hào)進(jìn) 行同步的解調(diào)，最后將解調(diào)后的結(jié)果送入模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到對(duì)應(yīng)熒光光強(qiáng)的數(shù) 字信號(hào)A。
[0039] 本發(fā)明中，模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊可以用過高精度、低噪聲的24位Σ-Λ型AD轉(zhuǎn)換芯片來 完成。
[0040] 本發(fā)明中，由于由光電傳感器件掃描采樣的結(jié)果仍存在一定的干擾信號(hào)，故步驟 1. 3中將采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai進(jìn)行信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換，得到每個(gè)時(shí)刻的 熒光強(qiáng)度信號(hào)A對(duì)應(yīng)的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào)Dy -般情況下，設(shè)置控制電路，滿足 光電傳感器件將掃描采樣的信息反饋給CPU，并通過光電信號(hào)IV轉(zhuǎn)換模塊將光源的光信號(hào) 調(diào)制至一定頻率并轉(zhuǎn)化成有效的電壓信號(hào)，然后通過信號(hào)放大濾波模塊濾除低頻噪聲和工 頻干擾并最后通過AD轉(zhuǎn)換模塊熒光強(qiáng)度信號(hào)由模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，得到轉(zhuǎn)換為數(shù) 字信號(hào)的熒光強(qiáng)度并進(jìn)行后續(xù)的分析計(jì)算，最終得到待測(cè)標(biāo)的物的實(shí)際濃度值。
[0041] 所述步驟1. 3中的濾波為中值濾波。
[0042] 本發(fā)明中，中值濾波是基于排序統(tǒng)計(jì)理論的一種能有效抑制噪聲的非線性信號(hào)處 理技術(shù)，其基本原理是把數(shù)字圖像或數(shù)字序列中一點(diǎn)的值用該點(diǎn)的一個(gè)鄰域中各點(diǎn)值的中 值代替，讓周圍的像素值接近的真實(shí)值，從而消除孤立的噪聲點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)在于能保護(hù)邊緣信 息，是經(jīng)典的平滑噪聲的方法。
[0043] 本發(fā)明中，基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法可以通過設(shè)置相關(guān) 的設(shè)備來完成，設(shè)備可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的方法基礎(chǔ)上設(shè)置。一般情況下，在設(shè) 備的殼體內(nèi)設(shè)置光學(xué)檢測(cè)機(jī)構(gòu)和控制電路，設(shè)有待測(cè)標(biāo)的物的試紙條自殼體的試紙條插入 口插入，控制電路控制光學(xué)檢測(cè)模塊對(duì)試紙條上的待測(cè)標(biāo)的物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)、掃描 采樣，采集熒光層析試紙條上控制線（C)與測(cè)量線（T)的熒光標(biāo)記物發(fā)射光強(qiáng)，記錄光譜采 樣信息曲線并顯示，由控制電路對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，得到標(biāo)的物的濃度。
[0044] 本發(fā)明中，可以通過選擇基于時(shí)間分辨熒光技術(shù)的層析試紙條，加入不同濃度的 檢測(cè)樣品，待試紙條完全干燥之后多次檢測(cè)其控制線（C)、測(cè)量線信號(hào)（T)，考察其T/C值的 穩(wěn)定性，由于熒光漂白效果，C線、T線絕對(duì)光強(qiáng)都會(huì)衰減，而T/C值保持相對(duì)穩(wěn)定，能達(dá)到 〇. 5 %的檢測(cè)靈敏度指標(biāo)。
[0045] 本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中，激發(fā)光照射激發(fā)出熒光的過程中，除了測(cè)量標(biāo)的物發(fā) 射的熒光，也即是標(biāo)記在樣品上的熒光色素的熒光信息外，還包括環(huán)境背景熒光和雜質(zhì)激 發(fā)熒光兩大類干擾熒光，而導(dǎo)致的雖然在傳統(tǒng)的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法中，可以在激發(fā)光 照射樣品激發(fā)熒光發(fā)射衰減的過程中，在熒光發(fā)射最大值的時(shí)間點(diǎn)延遲200 μ s左右時(shí)間， 等待雜質(zhì)激發(fā)熒光淬滅，再開始檢測(cè)熒光，從而達(dá)到消除上述第二類干擾熒光的影響，以得 到染色熒光色素所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，從而獲取測(cè)量標(biāo)的物相對(duì)準(zhǔn)確的信息，但是由于干擾 物質(zhì)具有不確定性，控制檢測(cè)熒光延時(shí)也具有不確定性，故不能肯定完全消除所有干擾物 質(zhì)激發(fā)熒光，且并不能消除第一類環(huán)境背景光干擾，如背景自發(fā)熒光、檢測(cè)系統(tǒng)漏光和電磁 干擾等的問題，通過基頻信號(hào)調(diào)制激發(fā)光源作用于待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光，使熒光成周期 性增強(qiáng)與衰減，再通過二倍頻方波信號(hào)，控制采樣周期，將熒光上升周期和衰減周期都一分 為二，分別獨(dú)立采樣后計(jì)算兩部分采樣差值并相加得到熒光信號(hào)的強(qiáng)度表征值，得到待測(cè) 標(biāo)的物的濃度值。本發(fā)明的方法不僅同樣可以消除樣品中底物的熒光干擾，還可以消除環(huán) 境背景光、空間電磁波工頻干擾等信號(hào)，提升檢測(cè)樣品熒光測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，具備常規(guī)時(shí)間分 辨熒光方法無法完成的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域標(biāo)的物的熒光強(qiáng)度檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征在于：所述方法包 括以下步驟： 步驟1. 1 :采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成頻率為X的規(guī)則波信號(hào)作為基頻信號(hào)，所述頻率為 X的規(guī)則波信號(hào)調(diào)制激發(fā)光源，光源發(fā)射激發(fā)光，激發(fā)光作用于待測(cè)標(biāo)的物上，觸發(fā)熒光； 步驟1. 2 :控制光電傳感器件以N倍于X的頻率對(duì)被觸發(fā)的熒光進(jìn)行采樣，得到采樣周 期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)& ;i>0 ;30 < N < 80 ; 步驟1. 3 :將采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&進(jìn)行信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換，得到每 個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai對(duì)應(yīng)的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào)Di ;i>0 ; 步驟1. 4 :將每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)數(shù)字Di根據(jù)采樣時(shí)間作圖得到光譜曲線；所述 光譜曲線包括熒光發(fā)光周期S和熒光衰減周期R ; 步驟1. 5 :對(duì)頻率為X的基頻信號(hào)進(jìn)行倍頻調(diào)制，產(chǎn)生頻率為X'的倍頻信號(hào)，X' =2X ; 根據(jù)倍頻信號(hào)將熒光發(fā)光周期S分為時(shí)間相等的熒光發(fā)光周期Si和熒光發(fā)光周期S2，將熒 光衰減周期R分為時(shí)間相等的熒光衰減周期凡和熒光衰減周期R 2 ; 步驟1. 6 :對(duì)熒光發(fā)光周期SpS2和熒光衰減周期Ri、R2在光譜曲線上進(jìn)行積分運(yùn)算，得 到熒光發(fā)光周期Si的積分面積記為Φ 1，熒光發(fā)光周期S2的積分面積記為Φ 2,熒光衰減周 期札的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R2的積分面積記為Φ4 ;Φ2 > Φ1>0, Φ3>Φ4>0 ; 步驟1. 7 :將熒光發(fā)光周期S2的積分面積Φ2減去熒光發(fā)光周期Si的積分面積Φ 1， 得到S' =Φ2-Φ1，S'記為熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值；將熒光衰減周期&的積分面積 Φ3減去熒光衰減周期R2的積分面積Φ4,得到R' =Φ3-Φ4, R'記為熒光衰減周期的熒 光強(qiáng)度值；將熒光發(fā)光周期的熒光強(qiáng)度值S'加上熒光衰減周期的熒光強(qiáng)度值R'，得到 Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3_Φ4,記為熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值；S' >0, R' >0 ; 步驟1. 8 :熒光色素發(fā)射的熒光總強(qiáng)度值△ Φ即表征待測(cè)標(biāo)的物的熒光信號(hào)測(cè)量值， 通過標(biāo)定方法得到待測(cè)標(biāo)的物濃度值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1. 1中，采用基頻信號(hào)發(fā)生器生成的頻率為X的規(guī)則波信號(hào)為方波信號(hào)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1. 1中的激發(fā)光源通過雙光源調(diào)制。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1. 2中，N=50。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1. 2中，光電傳感器件設(shè)為光電二極管。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1. 3中的信號(hào)濾波和AD轉(zhuǎn)換包括以下步驟： 步驟2. 1 :將以N倍于X的采樣頻率采樣到的每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)&進(jìn)行信號(hào)放 大得到放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/ ; 步驟2. 2 :將放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/通過高通濾波模塊進(jìn)行濾波，濾除低頻噪聲和工頻 干擾； 步驟2. 3 :將濾波后的放大熒光強(qiáng)度信號(hào)A/通過模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到與所述 采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度信號(hào)Ai對(duì)應(yīng)的采樣周期中每個(gè)時(shí)刻的熒光強(qiáng)度數(shù)字信號(hào) Di〇
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于相均衡倍頻調(diào)制原理的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1. 3中的濾波為中值濾波。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104101587SQ201410353200
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】蔣凱, 湯亞偉, 王萍, 張濤 申請(qǐng)人:蘇州和邁精密儀器有限公司