一種新型熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸的方法
【專利摘要】一種新型熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸的方法，該方法是：以氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)作氫受體，乳酸脫氫酶(LDH)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，熒光蛋白Frex特異性的與生成的NADH結(jié)合并激發(fā)熒光，熒光的強(qiáng)弱與乳酸的濃度成線性關(guān)系；通過(guò)記錄熒光強(qiáng)度即可根據(jù)熒光強(qiáng)度推算出乳酸濃度，用已知濃度的乳酸測(cè)出的熒光強(qiáng)度，做出乳酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知濃度的乳酸樣品就可從該標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出來(lái)；它具有操作便捷，靈敏度高，檢測(cè)更安全，有利于環(huán)境保護(hù)，線性范圍寬等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種新型熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種采用新型熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn) 測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸是體內(nèi)糖代謝的中間產(chǎn)物，主要由紅細(xì)胞、橫紋肌和腦組織產(chǎn)生，血液中的乳 酸濃度主要取決于肝臟及腎臟的合成速度和代謝率。在某些病理情況下（如呼吸衰竭或 循環(huán)衰竭時(shí)），可引起組織缺氧，由于缺氧可引起體內(nèi)乳酸升高。另外，體內(nèi)葡萄糖代謝過(guò) 程中，如糖酵解速度增加，劇烈運(yùn)動(dòng)、脫水時(shí)，也可引起體內(nèi)乳酸升高。體內(nèi)乳酸升高可引起 乳酸中毒。檢查血乳酸水平，可提示潛在疾病的嚴(yán)重程度。同時(shí)，血乳酸測(cè)定對(duì)指導(dǎo)重癥監(jiān) 護(hù)患者救治有非常重要的作用，尤其是處理心肌梗塞、心功能不全、血流不足引起的組織缺 氧。因此，要求通過(guò)快速反應(yīng)，在較短時(shí)間內(nèi)提交具有診斷價(jià)值的檢測(cè)結(jié)果。
[0003] 我們獲得了微生物來(lái)源經(jīng)改造的遺傳編碼熒光探針Frex，該探針特異性結(jié)合 NADH后，其開(kāi)放的二聚體構(gòu)象轉(zhuǎn)化為封閉構(gòu)象，同時(shí)在激發(fā)波長(zhǎng)500nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm有 最強(qiáng)熒光強(qiáng)度。熒光探針Frex能夠精確測(cè)定人體細(xì)胞不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)自由NADH分布水 平，并實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)看到人類等哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝、線粒體呼吸鏈功能、氧化還原調(diào)控 條件下NADH代謝情況，并發(fā)現(xiàn)NADH可以自由跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)調(diào)控多種生命活動(dòng)。Frex熒 光探針可以特異性的高度靈敏地監(jiān)測(cè)到細(xì)胞內(nèi)和線粒體中微小的NADH變化，通過(guò)與能量 代謝相關(guān)的各種脫氫酶（糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等）相偶聯(lián)，開(kāi)發(fā)出新型的檢 測(cè)血乳酸試劑盒。Frex只特異性的與NADH結(jié)合后發(fā)生強(qiáng)熒光激發(fā)，通過(guò)熒光強(qiáng)度可以定 量NADH的水平。Frex并不與NADH類似物如NAD+，ADP，ATP，NADP+和NADPH結(jié)合并激發(fā)熒 光，這是本發(fā)明的基礎(chǔ)及關(guān)鍵。
[0004] 目前普遍使用的血乳酸測(cè)定方法有分光光度法。分光光度法是在NAD存在下，LDH 催化L-乳酸脫氫，氧化成丙酮酸。加入硫酸肼使丙酮酸不斷被轉(zhuǎn)換消除，并促進(jìn)反應(yīng)完成。 反應(yīng)完成后生成的NADH與乳酸為等摩爾，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定NADH的量來(lái)計(jì)算乳酸的含 量。該方法的的不足之處在于：1.線性范圍窄，對(duì)于高濃度樣品需經(jīng)稀釋后測(cè)定，帶來(lái)一定 的不便。2.測(cè)試所需時(shí)間長(zhǎng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、適 用范圍廣，便于普及和安全的熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸濃度的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：以氧化型輔酶I (NAD+)作氫受體， 乳酸脫氫酶（LDH)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，熒光蛋白Frex特異性的與生成 的NADH結(jié)合并激發(fā)熒光，熒光的強(qiáng)弱與乳酸的濃度成線性關(guān)系；通過(guò)記錄熒光強(qiáng)度即可根 據(jù)熒光強(qiáng)度推算出乳酸濃度；用已知濃度的乳酸測(cè)出的熒光強(qiáng)度，做出乳酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線， 未知濃度的乳酸樣品就可從該標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出來(lái)。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述乳酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)如下試劑、按照表一和 表二制作而成，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行如下的推算：
[0008] 1.試劑：
[0009] ①50mmol/L乳酸標(biāo)準(zhǔn)母液；
[0010] ② 0· lmmol/L Tris-HCl 緩沖液（ρΗ8· 6);
[0011] ③ 6mmol/L NAD+溶液；
[0012] ④ 3mmol/L NADH 溶液；
[0013] ⑤終濃度為45 μ g/mL Frex蛋白溶液；
[0014] ⑥活力為3600U/L乳酸脫氫酶（LDH);
[0015] 2).檢測(cè)程序：
[0016] 2). 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
[0017] 按照以下表一和表二進(jìn)行加樣，加樣的單位為uL;加好樣后室溫反應(yīng)5min后檢測(cè) 熒光強(qiáng)度（Em530/Ex500)，由此得到兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別標(biāo)柱為標(biāo)準(zhǔn)曲線一和標(biāo)準(zhǔn)曲線二。
[0018] 表一
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種新型熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸的方法，其特征在于該方法是： 以氧化型輔酶I (NAD+)作氫受體，乳酸脫氫酶（LDH)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸 和NADH，熒光蛋白Frex特異性的與生成的NADH結(jié)合并激發(fā)熒光，熒光的強(qiáng)弱與乳酸的濃度 成線性關(guān)系；通過(guò)記錄熒光強(qiáng)度即可根據(jù)熒光強(qiáng)度推算出乳酸濃度，用已知濃度的乳酸測(cè) 出的熒光強(qiáng)度，做出乳酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知濃度的乳酸樣品就可從該標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出來(lái)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光蛋白Frex體外檢測(cè)血乳酸的方法，其特征在于所述乳酸 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)如下試劑、按照表一和表二制作而成，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行如下推算：
1. 試劑： ① 50mmol/L乳酸標(biāo)準(zhǔn)母液； ② 0· lmmol/L Tris-HCl 緩沖液（ρΗ8· 6); ③ 6mmo1 /T, NAD+ 溶液； ④ 3mmol/L NADH 溶液； ⑤ 終濃度為45 μ g/mL Frex蛋白溶液； ⑥ 活力為3600U/L乳酸脫氫酶（LDH); 2).檢測(cè)程序： 2. 1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 按照以下表一和表二進(jìn)行加樣，加樣的單位為μ L ;加好樣后室溫反應(yīng)5min后檢測(cè)突 光強(qiáng)度（Em530/Ex500)，由此分別得到兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別標(biāo)注為標(biāo)準(zhǔn)曲線一和標(biāo)準(zhǔn)曲線 --〇 表一
表一

2. 2)樣品檢測(cè)： 按表三進(jìn)行加樣，加樣單位為μ L,總反應(yīng)體積為lOOyL; 表二：
3).反應(yīng)5min后測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)樣品的激發(fā)熒光與Frex本底熒光的差值，在標(biāo)準(zhǔn)曲 線中可得出其在100 μ L反應(yīng)體系中的乳酸濃度，再由公式求出原溶液的乳酸濃度：乳酸濃 度(mmol /1,) = X*100/a。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104155269SQ201410293387
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】歐文斌, 嚴(yán)子琴, 孟凡國(guó), 劉麗, 劉俊, 李海龍 申請(qǐng)人:浙江清華長(zhǎng)三角研究院, 嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司