一種毛蚶蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種毛蚶蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多肽是毛蚶多肽，再用定氮法測(cè)定含量。制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多肽不得少于0.12g，含量越高，療效更好。這種方法可用于毛蚶提取物各種制劑的含量測(cè)定，使毛蚶制劑在生產(chǎn)和使用中有效的保證產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而保證藥品療效。
【專利說明】一種毛蚶蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥品檢測(cè)方法，具體涉及一種毛蚶蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法，屬藥品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]毛蚶肉含豐富的蛋白質(zhì)、維生素及人體所必需的氨基酸，自古就有著食用、藥用價(jià)值，《醫(yī)林纂要》注“蚶肉補(bǔ)心血、散瘀血、除煩醒酒、破結(jié)消痰”，《日華子本草》注“蚶肉益血色”。近年來，研究報(bào)道顯示毛蚶有抗腫瘤作用，具有清除體內(nèi)自由基、提高機(jī)體免疫力的功效。毛蚶肉制劑對(duì)肺癌、腎癌、胃癌、肝癌等多種癌癥具有較好的治療作用，且安全性良好。
[0003]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道毛蚶多肽是毛蚶的主要生物活性成分之一，具有保肝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的功效。暨南大學(xué)博士生導(dǎo)師于榮敏教授2011年I月5日?qǐng)?bào)道，新鮮毛蚶去殼，經(jīng)勻漿、離心、透析、凍干后制得毛蚶多肽提取物，法測(cè)定對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響及對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響；對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響；小鼠脾淋巴細(xì)胞周期的變化；對(duì)主要細(xì)胞因子IFN-Y和IL-4分泌水平的影響。結(jié)果毛蚶多肽提取物能夠顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅活性和小鼠NK細(xì)胞殺傷活性；促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞G0/G1期向DNA合成期(s期)轉(zhuǎn)化；協(xié)同ConA作用，能夠增加IFN-Y的分泌，并且能夠抑制IL-4的分泌。中國藥科大學(xué)竇昌貴等報(bào)道，用毛蚶肉水解液小鼠灌胃，結(jié)果:對(duì)四氯化碳、硫代乙胺和強(qiáng)的松龍引起的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高均有明顯的降低作用，表明毛蚶水解液對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有顯著的保護(hù)作用。
[0004]我們?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn)毛蚶多肽可明顯抑制乙肝表面抗原和E抗原的表達(dá)，并對(duì)乙肝DNA有抑制作用。
[0005]蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，所有動(dòng)植物生命體都含有蛋白質(zhì)和多妝，在無法確定蛋白質(zhì)來源的情況下，就不能保證藥品的有效性，不能準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，就無法在生產(chǎn)和使用中保證產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而藥品療效得不到保證。
[0006]現(xiàn)有文獻(xiàn)還沒有毛蚶多肽專屬性和含量測(cè)定的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種毛蚶多肽的含量測(cè)定方法，使毛蚶制劑在生產(chǎn)和使用中有效的保證產(chǎn)品質(zhì)量。
[0008]一種毛蚶蛋白質(zhì)多肽的含量測(cè)定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多肽是毛蚶多肽，再用定氮法測(cè)定含量，具體步驟如下:
(1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為280 nm ;柱溫:25°C ;流速0.4ml/min ;檢測(cè)波長280nm ;理論板數(shù)按蛋白質(zhì)分子量100000計(jì)算不低于5000 ；
(2)稱取樣品IOgJP12倍水超聲提取30 min，離心10 min，取上層液，濾過，濾液按體積分?jǐn)?shù)60% (w/v)加入硫酸銨，O?4°C放置過夜，離心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氫銨溶液為透析液，用截留分子量為3500的透析膜，O?4°C條件下充分透析，將透析膜內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50ml量瓶內(nèi)，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液；
(3)取毛蚶多肽溶液10μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄圖譜；圖譜中如果在保留時(shí)間15.6min±5%之內(nèi)有毛蚶多肽的特征峰，其分子量為88070，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無則判為偽品；
(4)稱取樣品0.5-2g，加20-40倍水，超聲使分散均勻，加10-20%三氯乙酸15_40ml，混勻，靜置20-50分鐘，過濾，取濾紙及濾渣干燥，照《中國藥典》2010年版一部附錄IX L第一法，氮測(cè)定法測(cè)定毛蚶多肽的含量；
我們經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g，含量越高，療效更好。
毛蚶提取物經(jīng)真空干燥后的樣品蛋白質(zhì)含量為60%，在毛蚶有效成分研究時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，小分子量的多肽為抗腫瘤的主要成分，而大分子量的蛋白生物活性低，藥理效果較差。而大分子量的毛蚶蛋白質(zhì)和魁蚶、泥蚶、花蛤、扇貝提取物，其所含的多肽分子量不同于毛蚶多肽，用凝膠色譜柱高效液相色譜法測(cè)定，圖譜中在保留時(shí)間15.6min±5%之內(nèi)無毛蚶多肽的特征峰，因此用本發(fā)明的方法測(cè)定毛蚶多肽的含量專屬性強(qiáng)，能夠保證用毛蚶制備的藥品有效和質(zhì)量可控。
[0009]為了便于理解本發(fā)明，特通過下面試驗(yàn)例進(jìn)一步說明:
一、兩批毛蚶提取物片劑樣品含量測(cè)定
(1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為280 nm ;柱溫:25°C ;流速0.4ml/min ;檢測(cè)波長280nm ;理論板數(shù)按蛋白質(zhì)分子量100000計(jì)算不低于5000 ；
(2)稱取樣品各IOg,分別加12倍水超聲提取30min,離心10 min,取上層液,濾過,濾液按體積分?jǐn)?shù)60% (w/v)加入硫酸銨，O?4°C放置過夜，離心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氫銨溶液為透析液，用截留分子量為3500的透析膜，O?4°C條件下充分透析，將透析膜內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50ml量瓶內(nèi)，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液；
(3)取毛蚶多肽溶液10μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄圖譜；毛蚶提取物制劑片劑A樣品圖譜中在保留時(shí)間15.537min有一尖銳的特征峰，其分子量為88070 ;毛蚶提取物制劑片劑B樣品特征圖譜中在保留時(shí)間15.698min有一尖銳的特征峰，其分子量為88070。結(jié)果顯示兩批毛蚶提取物片劑均是用毛蚶制得。繼續(xù)進(jìn)行含量測(cè)定；
(4)稱取樣品各0.5-2g，分別加20-40倍水，超聲使分散均勻，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混勻，靜置20-50分鐘，過濾，取濾紙及濾渣干燥，照《中國藥典》2010年版一部附錄IX L第一法，氮測(cè)定法測(cè)定毛蚶多肽的含量，計(jì)算得:制劑A樣品中每g毛蚶多肽0.45g ；制劑B樣品中每g毛蚶多肽0.15。
[0010]二、兩批毛蚶提取物片劑藥效比較
試驗(yàn)方法:選取健康小鼠10只，接種肺癌細(xì)胞株(2*105/只)，接種14d后，無菌條件下剝離腫瘤，用組織勻漿器制成細(xì)胞懸液。將健康小鼠30只，隨機(jī)分為3組，各組均尾靜脈接受上述制備的細(xì)胞懸液0.2ml (含細(xì)胞數(shù)1*105/只)。分別給予制劑A、B 0.25g/kg靜脈注射，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。各組均每日一次，連續(xù)10天。
[0011]觀察項(xiàng)目:停藥后觀察各組體重質(zhì)量變化，生存天數(shù)，按以下公式計(jì)算生存延長率LS=[(用藥組生存天數(shù)/對(duì)照組生存天數(shù))]-1*100%。處死動(dòng)物稱肺重，計(jì)算肺重指數(shù)。肺重指數(shù)=小鼠肺重(mg) /體重量(IOg)之比*100%。
[0012]結(jié)果見表:
【權(quán)利要求】
1.一種毛蚶蛋白質(zhì)多肽的含量測(cè)定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多肽是毛蚶多肽，再用定氮法測(cè)定含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多肽是毛蚶多肽，其特征在于具體步驟如下: (1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為280 nm ;柱溫:25°C ;流速0.4ml/min ;檢測(cè)波長280nm ;理論板數(shù)按蛋白質(zhì)分子量100000計(jì)算不低于5000 ； (2)稱取樣品IOgJP12倍水超聲提取30 min，離心10 min，取上層液，濾過，濾液按體積分?jǐn)?shù)60% (w/v)加入硫酸銨，O?4°C放置過夜，離心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氫銨溶液為透析液，用截留分子量為3500的透析膜，O?4°C條件下充分透析，將透析膜內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50ml量瓶內(nèi)，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液； (3)取毛蚶多肽溶液10μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄圖譜；圖譜中如果在保留時(shí)間15.6min±5%之內(nèi)有毛蚶多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的定氮法測(cè)定含量方法，其特征在于稱取樣品0.5-2g，加20-40倍水，超聲使分散均勻，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混勻，靜置20-50分鐘，過濾，取濾紙及濾渣干燥，照《中國藥典》2010年版一部附錄IX L第一法，氮測(cè)定法測(cè)定毛蚶多肽的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)力要求3的一種毛蚶蛋白質(zhì)多肽的含量測(cè)定方法，其特征在于制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多肽不得少于0.12g，含量越高，療效更好。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2或權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的一種毛蚶蛋白質(zhì)多肽的含量測(cè)定方法，其特征在于可用于毛蚶提取物各種制劑的含量測(cè)定。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK103954704SQ201410186505
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】蘇靜, 王麗, 趙穎, 許翠萍, 張晶 申請(qǐng)人:濟(jì)南康眾醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司