篩選體外血漿中h7n9生物標(biāo)記物的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選體外血漿中H7N9生物標(biāo)記物的方法及其應(yīng)用。1）制備多例H7N9患者的血漿樣本，2）檢測(cè)血漿樣本的細(xì)胞因子及趨化因子，獲得細(xì)胞因子及趨化因子的數(shù)據(jù)，3）比較H1N1患者、健康對(duì)照血漿中的細(xì)胞因子及趨化因子，分析處理數(shù)據(jù)，獲得H7N9生物標(biāo)記物，4）從步驟3）所述的H7N9生物標(biāo)記物中確定死亡風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)記物。本發(fā)明從免疫分子角度對(duì)H7N9患者的細(xì)胞因子及趨化因子進(jìn)行檢測(cè)分析，從而建立有效的H7N9免疫分子圖譜，并將其用于體外評(píng)估H7N9患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。該方法的靈敏度及特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。
【專利說(shuō)明】篩選體外血漿中H7N9生物標(biāo)記物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及新的免疫標(biāo)志物-H7N9患者血漿細(xì)胞因子及趨化因子，可在體外檢測(cè)H7N9患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]人禽流感病毒依據(jù)禽甲型流感病毒外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前已發(fā)現(xiàn)并確定為17個(gè)H亞型(H1?H17)和10個(gè)N亞型(NI?N10)。上述H亞型和N亞型相互組合形成了上百種不同HxNx亞型的禽甲型流感病毒，禽類特別是水禽一般是這些流感病毒的自然宿主，且主要在禽類中存在和傳播流行。
[0003]2013年以前H7N9亞型流感病毒僅在禽類中發(fā)現(xiàn)，在荷蘭、日本及美國(guó)等地曾發(fā)生過(guò)禽間暴發(fā)疫情，但未發(fā)現(xiàn)過(guò)人感染情況。2013年3月底，新型的H7N9亞型禽流感病毒在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。從2013年4月至2014年3月7日，全國(guó)人感染H7N9禽流感確診病例總計(jì)384例，其中死亡100例。之前報(bào)道的111例患者中，76.6%的患者收住ICU治療，其中有70%的患者發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征?；颊咂骄挲g為61歲，65歲以上患者比例達(dá)42.3%，31.5%患者為女性。盡管進(jìn)行了綜合的治療，患者死亡率仍高達(dá)27%。
[0004]H7N9感染者外周血中存在高細(xì)胞因子血癥。據(jù)報(bào)道H5N1感染患者的血中也存在高細(xì)胞因子血癥。然而，尚無(wú)預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物標(biāo)志物報(bào)道。重癥H7N9感染者死亡率高，盡管迫切需要預(yù)測(cè)潛在致命禽流感感染的疾病進(jìn)展及預(yù)后的生物標(biāo)志物，但是目前尚無(wú)公開(kāi)的報(bào)道。
[0005]液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片，是基于xMAP技術(shù)的生物芯片技術(shù)平臺(tái)，它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過(guò)紅、綠兩束激光分別檢測(cè)微球編碼和報(bào)告熒光來(lái)達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供篩選體外血漿中H7N9生物標(biāo)記物的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明建立了一套有效的方法，用于在分離的血漿中體外檢測(cè)H7N9患者細(xì)胞因子及趨化因子水平用以評(píng)估H7N9患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)，即通過(guò)測(cè)定H7N9患者、HlNl患者及健康對(duì)照組的細(xì)胞因子及趨化因子，進(jìn)行差異分析，尋找新的免疫標(biāo)志物，從而對(duì)H7N9患者進(jìn)行更全面的早期篩查和檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下所述。
[0008]一種篩選體外血漿中H7N9生物標(biāo)記物的方法，包括下列步驟:
O制備多例H7N9患者的血漿樣本，
2)檢測(cè)血漿樣本的細(xì)胞因子及趨化因子，獲得細(xì)胞因子及趨化因子的數(shù)據(jù)，
3)比較HlNl患者、健康對(duì)照血漿中的細(xì)胞因子及趨化因子，分析處理數(shù)據(jù)，獲得H7N9生物標(biāo)記物，
4)從步驟3)所述的H7N9生物標(biāo)記物中確定死亡風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)記物 步驟2)所述的檢測(cè)采用液相芯片技術(shù)。
[0009]步驟3)所述的分析處理數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行處理。
[0010]步驟3)所述的H7N9生物標(biāo)記物為至少包括以下生物標(biāo)記物中多種的組合，所述的生物標(biāo)記物選自 MIF、SCF、MCP-U HGF, SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
[0011]一種H7N9疾病的嚴(yán)重程度的評(píng)估方法、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展或評(píng)價(jià)治療的方法，通過(guò)定量或定性比較患者與正常對(duì)照的H7N9生物標(biāo)記物得知疾病嚴(yán)重程度，或者監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，或者評(píng)價(jià)治療。
[0012]所述的H7N9生物標(biāo)記物為至少包括以下生物標(biāo)記物中多種的組合，所述的生物標(biāo)記物選自 MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-10 及 IFN-Y。
[0013]一種評(píng)估H7N9疾病嚴(yán)重程度的試劑盒，主要在于定量檢測(cè)H7N9生物標(biāo)記物。
[0014]所述的H7N9生物標(biāo)記物為至少包括以下生物標(biāo)記物中多種的組合，所述的生物標(biāo)記物選自 MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-10 及 IFN-Y。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:由于本發(fā)明應(yīng)用液相芯片技術(shù)，從免疫分子角度對(duì)H7N9患者的細(xì)胞因子及趨化因子進(jìn)行檢測(cè)分析，從而建立有效的H7N9免疫分子圖譜，并將其用于體外評(píng)估H7N9患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。該方法的靈敏度及特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017]圖1 (A)是比較6例健康對(duì)照組、21例HlNl患者細(xì)胞因子/趨化因子水平；
圖1 (B)是比較6例健康對(duì)照組、21例HlNl患者與46例H7N9患者細(xì)胞因子/趨化因子水平；
其中，圖1 (A)和圖1 (B)中，
a:對(duì)照組與HlNl患者發(fā)病第I周組比較，
b:對(duì)照組與HlNl患者發(fā)病第2周組比較，
c:對(duì)照組與HlNl患者發(fā)病15天后組比較，
d: HlNl患者發(fā)病第I周組與發(fā)病第2周組比較，
e: HlNl患者發(fā)病第I周組與發(fā)病15天后組比較，
f: HlNl患者發(fā)病第2周組與發(fā)病15天后組比較，
g:對(duì)照組與H7N9患者發(fā)病第I周組比較，
h:對(duì)照組與H7N9患者發(fā)病第2周組比較，
i:對(duì)照組與H7N9患者發(fā)病15天后組比較，
j: H7N9患者發(fā)病第I周組與發(fā)病第2周組比較比較，
k: H7N9患者發(fā)病第I周組與發(fā)病15天后組比較，
I: H7N9患者發(fā)病第2周組與發(fā)病15天后組比較， m: HlNl患者發(fā)病第I周組與H7N9患者發(fā)病第I周組比較， n: HlNl患者發(fā)病第2周組與Η7Ν9患者發(fā)病第2周組比較，
O: HlNl患者發(fā)病15天后組與Η7Ν9患者發(fā)病15天后組比較；圖2是與H7N9感染者CT值高度相關(guān)的細(xì)胞因子/趨化因子；
圖3是與H7N9感染者APACHE II評(píng)分高度相關(guān)的細(xì)胞因子/趨化因子；
圖4是與H7N9患者預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞因子/趨化因子；
圖5是H7N9患者發(fā)病第二周血漿MIF的ROC曲線；
圖6是H7N9患者發(fā)病第二周血漿SCF的ROC曲線；
圖7是H7N9患者發(fā)病第二周血漿MCP-1的ROC曲線表；
圖8是H7N9患者發(fā)病第二 周血漿HGF的ROC曲線表；
圖9是H7N9患者發(fā)病第二周血漿SCGF-beta的ROC曲線表；
圖10是H7N9患者發(fā)病第二周血漿IP-10的ROC曲線表；
圖11是H7N9患者發(fā)病第二周血漿IL-18的ROC曲線表；
圖12是H7N9患者發(fā)病第二周血漿IFN-gamma的ROC曲線表；
圖13是H7N9患者發(fā)病第二周CRP的ROC曲線表；
圖14是H7N9患者發(fā)病第二周Pa02/Fi02的ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明的具體方案由以下實(shí)施例給出:
H7N9患者血漿免疫因子的測(cè)定
(一)實(shí)驗(yàn)樣本
1、H7N9患者46例，發(fā)病2周內(nèi)的患者35例，血漿樣本80份。平均年齡61歲，其中男性22人。
[0019]2，HlNl患者21例，平均年齡53.9歲，其中男性14人。
[0020]3、對(duì)照樣本6人，均取自健康志愿者。
[0021](二)實(shí)驗(yàn)材料
I，試劑 Bio-Plex Pro Human Cytokine Array 27-Plex Group 1、21_Plex GroupII，濾紙，Iml排槍，200ul排槍，Iml無(wú)菌槍頭，200ul無(wú)菌槍頭，IOul無(wú)菌槍頭2，儀器Luminex200，水平震蕩儀，磁力架，1.5mlEP管，2mlEP管。
[0022](三)實(shí)驗(yàn)步驟
1、病例的米集
H7N9患者的確診根據(jù)流行病學(xué)接觸史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，可作出人感染H7N9禽流感的診斷。在流行病學(xué)史不詳?shù)那闆r下，根據(jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，特別是從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性，或動(dòng)態(tài)檢測(cè)雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高，可作出人感染H7N9禽流感的診斷
HlNl患者確診:出現(xiàn)流感樣臨床表現(xiàn)，同時(shí)有以下一種或幾種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果:(I)甲型HlNl流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性(可采用real-time RT-PCR和RT-PCR方法)；(2)分離到甲型HlNl流感病毒；(3)雙份血清甲型HlNl流感病毒的特異性抗體水平4倍或4倍以上升高。
[0023]2、血漿的制備:
患者及對(duì)照組于清晨空腹取外周血3ml置于EDTA抗凝的一次性玻璃采血管內(nèi)，4° C3000轉(zhuǎn)離心lOmin，分離得到的血漿_80°C冰箱保存。
[0024]3、液相芯片處理
值得指出的是，本發(fā)明以液相芯片為例對(duì)細(xì)胞因子及趨化因子進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)其它高通量的方法也足于勝任檢測(cè)分析任務(wù)。
[0025]根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置標(biāo)準(zhǔn)品、coupledbeads、detection antibodies 以及Streptavidin-PEo detection antibodies 用前 15 分鐘配置，Streptavidin-PE 用前 10 分
鐘配置。
[0026]I)每孔加入IOOul wash buffer潤(rùn)板,棄上清,板底用濾紙吸干。
[0027]2)每孔加入 50ul coupled beads,洗板 2 次。
[0028]3)加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本。封口避光后將孔板置于振蕩器上室溫下孵育30分鐘。
[0029]4)用 wash buffer 洗板 3 次。每孔加入 25ul detection antibody,封口避光后將孔板置于振蕩器上室溫下孵育30分鐘。
[0030]5)將孔板置于磁力架上,棄去上清,板底用濾紙吸干,用wash buffer洗板3次。每孔加入50ul str印tavidin-PE，封口避光后將孔板置于振蕩器上室溫下孵育10分鐘。
[0031]6)將孔板置于磁力架上,棄去上清,板底用濾紙吸干,用wash buffer洗板3次。每孔加入125 μ I assay buffer,封口避光，1，100 rpm振蕩器震蕩30秒。Luminex上機(jī)檢測(cè)及其數(shù)據(jù)分析。
[0032]4、芯片檢測(cè)及數(shù)據(jù)的采集
利用χΡΟΝΕΝΤ 3.1 software進(jìn)行初始數(shù)據(jù)分析。利用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0033]5、數(shù)據(jù)分析
1)H7N9患者相關(guān)免疫因子模型的建立
根據(jù)距離發(fā)病時(shí)間的不同將46份H7N9患者血漿樣本、21份HlNl患者血漿樣本分為發(fā)病第一周樣本(H1N1樣本10份，H7N9樣本24份)，發(fā)病第二周樣本(H1N1樣本7份，H7N9樣本11份)，發(fā)病15天以后的血漿樣本(H1N1樣本4份，H7N9樣本11份)。健康對(duì)照血漿6例。建立免疫因子的H7N9患者血漿差異模型。利用Mann-Whitney U檢驗(yàn)檢測(cè)不同組的細(xì)胞因子及趨化因子間差異的顯著性。Spearman’s rank correlation coefficientanalysis用于免疫因子與病毒載量及疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析。Benjamini & Hochbergmethod用于控制多重檢驗(yàn)的假陽(yáng)性率。ROC曲線用于預(yù)測(cè)分析。設(shè)定雙側(cè)檢驗(yàn)顯著性水平為 Ρ〈0.05
2)Η7Ν9患者相關(guān)免疫因子預(yù)測(cè)致命預(yù)后模型的建立
收集患者采血當(dāng)天的CRP及APACHE II，計(jì)算CRP及APACHE II對(duì)Η7Ν9患者疾病嚴(yán)重程度及死亡預(yù)測(cè)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，評(píng)價(jià)該模型的有效性。
[0034]6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
I)Η7Ν9患者相關(guān)免疫因子模型的數(shù)據(jù)分析:采用SPSS16.0對(duì)46例Η7Ν9患者、21例HlNl患者及6例健康志愿者免疫因子進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示所檢測(cè)的Η7Ν9禽流感患者外周血48種細(xì)胞因子及趨化因子中有34種在發(fā)病I周組較健康對(duì)照組表達(dá)有顯著差異(Ρ〈0.05)，水平顯著升高。Η7Ν9禽流感患者發(fā)病第I周組有28種細(xì)胞因子及趨化因子水平顯著高于發(fā)病同期的HlNl患者。以上升高的細(xì)胞因子包括Thl型細(xì)胞因子(如IP-10、IL-2、IFN-Y、TNF-a 和 IL-1 β 等)、Th2 型細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10 和 IL-13)及TH17型細(xì)胞因子(IL-17)，H7N9禽流感患者發(fā)病第2周組有類似的變化趨勢(shì)。這些均表明H7N9禽流感患者存在顯著的細(xì)胞因子風(fēng)暴。如圖1 (A)、l (B)所示。
[0035]2) H7N9患者相關(guān)免疫因子與患者病毒載量的相關(guān)性分析:采用SPSS16.0進(jìn)行 Spearman’s rank correlation coefficient analysis,石開(kāi)究發(fā)現(xiàn) IP-10, MIG, MIF,HGF及IL-18在患者發(fā)病第一周、第二周與患者的病毒載量正相關(guān)；SCF，beta_NGF及SCGF-beta在患者發(fā)病第二周與患者的病毒載量正相關(guān)。研究結(jié)果表明H7N9病毒誘導(dǎo)了高細(xì)胞因子血癥，如圖2所示。
[0036]3)H7N9患者相關(guān)免疫因子與患者疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析:采用SPSS16.0進(jìn)行 Spearman’s rank correlation coefficient analysis,石開(kāi)究發(fā)現(xiàn) SCF、HGF、MIF、IL-18、IP-10及MIG在患者發(fā)病第一周、第二周與患者的APACHE II評(píng)分正相關(guān)，SCGF-beta在患者發(fā)病第二周與患者的APACHE II評(píng)分正相關(guān)。研究結(jié)果表明H7N9病毒誘導(dǎo)的高細(xì)胞因子血癥與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)，如圖3所不。
[0037]4) H7N9患者相關(guān)免疫因子與患者致命預(yù)后的相關(guān)性分析:根據(jù)患者的死亡與否，將患者分為好轉(zhuǎn)組及死亡組，通過(guò)Mann-Whitney U檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)死亡患者發(fā)病第二周相關(guān)免疫因子HGF, SCF, IL-18, IP-10, MIF及SCGF-beta水平較好轉(zhuǎn)組發(fā)病第二周顯著升高，如圖4所示。
[0038]5) H7N9患者相關(guān)免疫因子預(yù)測(cè)患者致命的預(yù)后:采用SPSS16.0計(jì)算所有顯著升高的相關(guān)免疫因子以及Pa02/Fi02 ratios及CRP的ROC曲線的曲線下面積。研究發(fā)現(xiàn)MIF，SCF, MCP-1, HGF, SCGF-beta, IP-10, IL-18 及 IFN-Y 較其他免疫因子 ROC 的曲線下面積更高，且 MIF、SCF、MCP-1、HGF 及 SCGF-beta 較 Pa02/Fi02 ratios 及 CRP 的曲線下面積更高，更能預(yù)測(cè)患者致命的預(yù)后，如圖5-圖14所示。
【權(quán)利要求】
1.一種篩選體外血漿中H7N9生物標(biāo)記物的方法，其特征在于，包括下列步驟: O制備多例H7N9患者的血漿樣本， 2)檢測(cè)血漿樣本的細(xì)胞因子及趨化因子，獲得細(xì)胞因子及趨化因子的數(shù)據(jù)， 3)比較HlNl患者、健康對(duì)照血漿中的細(xì)胞因子及趨化因子，分析處理數(shù)據(jù)，獲得H7N9生物標(biāo)記物， 4)從步驟3)所述的H7N9生物標(biāo)記物中確定死亡風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的檢測(cè)采用液相芯片技術(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的分析處理數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的H7N9生物標(biāo)記物為至少包括以下生物標(biāo)記物中多種的組合，所述的生物標(biāo)記物選自MIF、SCF, MCP-U HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
5.—種H7N9疾病的嚴(yán)重程度的評(píng)估方法、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展或評(píng)價(jià)治療的方法，其特征在于，通過(guò)定量或定性比較患者與正常對(duì)照的H7N9生物標(biāo)記物得知疾病嚴(yán)重程度，或者監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，或者評(píng)價(jià)治療。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的H7N9生物標(biāo)記物為至少包括以下生物標(biāo)記物中多種的組合，所述的生物標(biāo)記物選自MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
7.一種評(píng)估H7N9疾病嚴(yán)重程度的試劑盒，其特征在于，主要在于定量檢測(cè)H7N9生物標(biāo)記物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的H7N9生物標(biāo)記物為至少包括以下生物標(biāo)記物中多種的組合，所述的生物標(biāo)記物選自MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103954748SQ201410127951
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】李蘭娟, 郭靜, 陳瑜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)