一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，包括以下具體過(guò)程：1）取樣，采集志愿者尿液，2）逐一對(duì)志愿者尿液進(jìn)行處理、測(cè)定，得到每一個(gè)志愿者尿液樣品中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量；3）將每一志愿者尿液樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理，找出吸煙者尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量規(guī)律。本發(fā)明采用氘代標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過(guò)程中引起的誤差、串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準(zhǔn)確性和靈敏度。通過(guò)色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過(guò)程，縮短了色譜分析的時(shí)間，減少了有機(jī)溶劑的消耗量，并使用Excel和SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
【專利說(shuō)明】一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，主要涉及尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的測(cè)定技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-ES1-MS/MS)測(cè)定大規(guī)模人群尿液樣本中3-2-羥乙基腺嘌呤(3_H0EtA)方法的應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】:
3-2-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)是外源性化合物體內(nèi)代謝生成的自由基與腺嘌呤結(jié)合后的產(chǎn)物。由于尿中內(nèi)源性3-2-羥乙基腺嘌呤本底值低，又能較為準(zhǔn)確的反映原型化合物的特性，因此作為生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)廣泛用于環(huán)境烷基化污染物的生物監(jiān)測(cè)。據(jù)報(bào)道，尿液中3-輕乙基腺嘌呤(N3- (2-hydroxyethyl) adenine, 3-H0EtA)與吸煙者煙氣接觸水平有較強(qiáng)的相關(guān)性，能夠用于評(píng)價(jià)煙氣中有害成分亞硝胺的接觸水平。
[0003]目前，關(guān)于尿液中DNA加合物的分析檢測(cè)方法應(yīng)用的報(bào)道較多，但是大規(guī)模采集中國(guó)吸煙者尿液進(jìn)行分析的未見報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提出的一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)應(yīng)用于分析大規(guī)模尿液樣品中3-2-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的方法。該方法具有快速、準(zhǔn)確，可靠等特點(diǎn)，可用于大規(guī)模吸煙者尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的定性定量分析。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:包括以下具體過(guò)程:
(1)取樣，招募吸煙者、非吸煙者志愿者，對(duì)志愿者進(jìn)行篩選，采集志愿者24小時(shí)排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分別存放于_80°C超低溫冰箱中保存；
(2)逐一對(duì)志愿者尿液進(jìn)行處理、測(cè)定，得到每一個(gè)志愿者尿液樣品中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量；對(duì)志愿者尿液進(jìn)行處理、測(cè)定的具體步驟如下:
a、樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4mL尿液，加入4mL超純水，力口Λ 100 μ L內(nèi)標(biāo),用水浴鍋調(diào)節(jié)溫度到75-85°C,取超純水稀釋至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；所述內(nèi)標(biāo)為d5-3-EtA，內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng/mL。
[0006]固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，預(yù)先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上樣量為8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液(47.5: 47.5: 5)洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮?dú)獯抵粮?，然后?00 μ L水溶液溶解，供LC-MS/MS分離分析；
b、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:用乙腈配制不同濃度的3-2-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；C、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定，吸取配制好的不同濃度的3-2-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物
的含量。
[0007]在色譜測(cè)定中,選取了 Waters HILIC色譜柱,規(guī)格150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm,流動(dòng)相體系選取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5。洗脫條件:流動(dòng)相A:乙腈溶液，pH 4.0，流動(dòng)相8:甲酸銨/水溶液(10禮)，？!1 4.0 ;A:B為95:5。流速0.25 mL/min ;柱溫25 ° C ;進(jìn)樣量3 μ?，洗脫時(shí)間:0~20 min。
[0008]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；噴霧(IS)電壓為5500 V ;霧化氣(Gasl)壓力為 344.5 kPa(50 psi);氣簾氣(CUR)壓力為 206.7 kPa(30 psi);輔助霧化氣(Gas2)壓力為310.0 kPa(45 psi);離子源溫度(TEM)為500°C;去蔟電壓(DP)為85eV ;碰撞能(CE)為26 eV ;駐留時(shí)間為40 ms，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為3- HOEtA:180 — 136 (定量離子對(duì))，180 — 119 (定性離子對(duì))；內(nèi)標(biāo)d5-3-EtA為169 — 137。
[0009](3)將每一志愿者尿液樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理，找出吸煙者尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量規(guī)律，所述的數(shù)據(jù)分析軟件為Office excel或SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件。
[0010]本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大規(guī)模志愿者的招募，大量尿液樣品的保存條件的優(yōu)化，建立了分析、檢測(cè)中國(guó)吸煙者尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的含量水平的應(yīng)用方法，適合于分析大量的吸煙人群尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)水平。每個(gè)樣本在20 min內(nèi)就可完成3-2-羥乙基 腺嘌呤(3-HOEtA)的檢測(cè)，并使用Excel和SPSS軟件對(duì)大規(guī)模檢測(cè)樣品進(jìn)行分析，找出吸煙者尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量規(guī)律，為相應(yīng)的樣本生物監(jiān)測(cè)研究提供了具體的數(shù)據(jù)支撐，具有十分重要意義。
[0011]本發(fā)明具體的工藝過(guò)程進(jìn)一步詳述如下:
I樣品前處理
樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4 mL尿液，加入4mL超純水，加入100 UL內(nèi)標(biāo)(100ng/mL)，用水浴鍋調(diào)節(jié)溫度到80°C。取超純水稀釋后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取選取Waters Oasis MCX (6 mL, 500 mg)小柱,預(yù)先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上樣量為8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后I mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水(47.5: 47.5: 5)洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮?dú)獯抵粮?，然后?00 111^水溶液溶解，供^:-1^/^3分離分析。
[0012]2 LC-MS/MS 測(cè)定
(I)LC-MS/MS 條件
色譜條件:Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm)色譜柱,流動(dòng)相A:乙腈溶液，pH 4.0 (體積分?jǐn)?shù))，流動(dòng)相B:甲酸銨/水溶液(10mM)，pH 4.0, A:B=95:5 ;流速0.25 mL/min ;柱溫25 ° C ;進(jìn)樣量3 μ?。洗脫條件:0~20 min,。
[0013]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；噴霧(IS)電壓為5500 V ;霧化氣(Gasl)壓力為 344.5 kPa(50 psi);氣簾氣(CUR)壓力為 206.7 kPa(30 psi);輔助霧化氣(Gas2)壓力為310.0 kPa(45 psi);離子源溫度(TEM)為500°C ;去蔟電壓(DP)為100eV ;碰撞能(CE)為30 eV ;駐留時(shí)間為40 ms。監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其相應(yīng)的碰撞能量(CE)見表1。
[0014]表1多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下3-HOEtA及其氘代內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:包括以下具體過(guò)程: (1)取樣，招募吸煙者、非吸煙者志愿者，對(duì)志愿者進(jìn)行篩選，采集入選志愿者24小時(shí)排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分別存放于_80°C超低溫冰箱中保存； (2)逐一對(duì)志愿者尿液進(jìn)行處理、測(cè)定，得到每一個(gè)志愿者尿液樣品中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量； (3)將每一志愿者尿液樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理，找出吸煙者尿液中3-2-羥乙基腺嘌呤的含量規(guī)律。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:對(duì)志愿者尿液進(jìn)行處理、測(cè)定的具體步驟如下: a、樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4mL尿液，加入4mL超純水，加Λ 100 μ L內(nèi)標(biāo),用水浴鍋調(diào)節(jié)溫度到75-85°C,取超純水稀釋至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中； 固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，預(yù)先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上樣量為8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮?dú)獯抵粮?，然后?00 yL水溶液溶解，供LC-MS/MS分尚分析； b、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:用乙腈配制不同濃度的3-2-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； C、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定，吸取配制好的不同濃度的3-2-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:所述內(nèi)標(biāo)為氘代-3-乙基腺嘌呤，內(nèi)標(biāo)濃度為100ng/mL0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具體配比為47.5: 47.5: 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:在c步驟中，選取了 Waters HILIC色譜柱，規(guī)格150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm,流動(dòng)相體系選取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為 95:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:洗脫條件:流動(dòng)相A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5，pH 4.0;流速0.25 mL/min ;柱溫25 ° C ;進(jìn)樣量3 μ?，洗脫時(shí)間:0~20 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，正離子掃描方式；噴霧電壓為5500 V;霧化氣壓力為344.5 kPa ;氣簾氣壓力為206.7 kPa ;輔助霧化氣壓力為·310.0 kPa;離子源溫度為500°C ;去蔟電壓為85 eV ;碰撞能為26 eV ;駐留時(shí)間為40 ms,監(jiān)測(cè)尚子對(duì)為3_ HOEtA: 180 — 136定量尚子對(duì)，180 — 119定性尚子對(duì)；內(nèi)標(biāo)氣代_3_乙基腺嘌呤為169 — 137。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測(cè)3-2-羥乙基腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:過(guò)程(3)中所述的數(shù)據(jù)分析軟件為Office excel或SPSS統(tǒng)計(jì)分 析軟件。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103822988SQ201410093902
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】田永峰, 胡清源, 王安, 侯宏衛(wèi), 劉勇, 楊進(jìn), 陳歡, 韓書磊, 劉彤, 張小濤, 石龍凱, 劉洋 申請(qǐng)人:國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院