一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，其按照組成包括以下組分：0.002%-0.01%的順磁性微球、0.4μg/ml-1.0μg/ml吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體、復(fù)合睪酮釋放劑、發(fā)光液A和發(fā)光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睪酮校準(zhǔn)品與一定濃度的清洗液；所述睪酮釋放劑為雙氫睪酮、達(dá)那唑與肝素鈉的混合物。使本發(fā)明具有操作簡便、靈敏度高、檢測效率快、費(fèi)用低廉、便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，選用的復(fù)合釋放劑與不同結(jié)合球蛋白結(jié)合，可以將血清中結(jié)合態(tài)的睪酮充分釋放出來，使總睪酮的含量測定更為準(zhǔn)確。
【專利說明】—種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]睪酮是廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種類固醇類激素，準(zhǔn)確檢測其在生物體內(nèi)的含量，在判斷其生殖性能、正常生理指數(shù)及病理濃度而用于疾病的診治、計(jì)劃生育、動(dòng)物的繁殖與育種等方面都有重要的作用。男性體內(nèi)睪酮由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，男性血清中睪酮含量是證實(shí)可疑睪丸功能紊亂，證明雄性激素缺乏以及檢測睪酮代替治療的最重要的檢測參數(shù)。女性體內(nèi)睪酮主要在卵巢中合成，也在腎上腺皮質(zhì)內(nèi)合成，女性血清中的睪酮含量用于確定女性雄性激素過多癥。
[0003]目前對睪酮激素檢測所采用的方法多是放射免疫分析法和酶免疫分析法。由于放射性元素對環(huán)境的污染及其半衰期短等，給操作使用帶來不便，限制放射免疫分析的應(yīng)用；而酶免疫分析法存在靈敏度低、檢測范圍窄等缺陷無法滿足臨床要求。因此，現(xiàn)有技術(shù)有待于更進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，以提高檢測靈敏度與檢測效率。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明技術(shù)方案包括:
[0006]一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，其按照組成包括以下組分:0.002%-0.01%的順磁性微球、0.4 μ g/ml-1.0 μ g/ml的B丫唳酯標(biāo)記的睪酮抗體、復(fù)合睪酮釋放劑、發(fā)光液A和發(fā)光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睪酮校準(zhǔn)品與一定濃度的清洗液；所述睪酮釋放劑為雙氫睪酮、達(dá)那唑與肝素鈉的混合物。
[0007]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述睪酮釋放劑按照濃度組成包括以下組分:0.05mg/ml-0.2mg/ml 的雙氫睪酮、0.01mg/ml-0.05mg/ml 的達(dá)那唑與 5_20mg/ml 的肝素鈉，雙氫睪酮、達(dá)那唑與肝素鈉充分混合形成緩沖溶液。
[0008]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述順磁性微球?yàn)楸砻姘鼛в恤然虬被钚曰鶊F(tuán)的四氧化三鐵，其粒徑大小為0.1 μ m-5 μ m。
[0009]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體為單克隆抗體、多克隆抗體中的一種或其混合物。
[0010]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述發(fā)光液A為過氧化氫和硝酸水溶液，發(fā)光液B為
氫氧化鈉與聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。
[0011]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述的睪酮校準(zhǔn)品為含睪酮抗原濃度為Ong/dl-1500ng/dl 的溶液。
[0012]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述的清洗液包括70g/L的磷酸氫二鈉、10g/L的磷酸二氫鈉、180g/L的氯化鈉、10mL/L的Tween-20和2%的液體生物防腐劑Proclin_300。
[0013]所述的睪酮檢測試劑，其中，所述發(fā)光液A中過氧化氫的濃度為0.5%_5%，硝酸的濃度為l_2mol/L，發(fā)光液B中氫氧化鈉的濃度為0.01-2.5mol/L, TritonX-1OO的濃度為
0.1%-5%。
[0014]本發(fā)明提供的一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，檢測睪酮采用化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析方法，由于激素為小分子，因此選用競爭法進(jìn)行檢測，在血清中，只有2%左右的睪酮處于游離狀態(tài)，剩下的98%睪酮與性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)、白蛋白、皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白(CBG)、α I酸性糖蛋白和某些脂蛋白等結(jié)合，在體內(nèi)與游離睪酮保持一定的動(dòng)態(tài)平衡，其中睪酮與性激素結(jié)合球蛋白結(jié)合力最強(qiáng)，是特異性結(jié)合，不易解離；睪酮與白蛋白親和力較小，但結(jié)合的睪酮量極多，屬非特異性結(jié)合，比較疏松，睪酮易于解離而進(jìn)入靶組織；睪酮與皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白親和力小，所占比例較小，睪酮與血液中其他蛋白親和力很弱，結(jié)合的睪酮數(shù)量極少，起的作用不大，因此，要將結(jié)合態(tài)睪酮釋放出來需要復(fù)合釋放劑。其中，雙氫睪酮與性激素結(jié)合球蛋白的結(jié)合力遠(yuǎn)大于睪酮，能將睪酮從性激素球蛋白上置換出來；肝素鈉可以使睪酮與白蛋白的結(jié)合力減弱，從而使睪酮釋放出來；達(dá)那唑等皮質(zhì)醇類激素與皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白的結(jié)合力大于睪酮，從而使睪酮釋放出來，使本發(fā)明具有操作簡便、靈敏度高、檢測效率快、費(fèi)用低廉、便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，選用的復(fù)合釋放劑與不同結(jié)合球蛋白結(jié)合，可以將血清中結(jié)合態(tài)的睪酮充分釋放出來，使總睪酮的含量測定更為準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明提供了一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明提供了一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，其按照組成包括以下組分:0.002%-0.01%的順磁性微球、0.4μ g/ml-1.0y g/ml的吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體、復(fù)合睪酮釋放劑、發(fā)光液A和發(fā)光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睪酮校準(zhǔn)品與一定濃度的清洗液。
[0017]更具體的,所述睪酮釋放劑按照濃度組成包括以下組分:0.05mg/ml-0.2mg/ml的的雙氫睪酮、0.01mg/ml-0.05mg/ml的達(dá)那唑與5-20mg/ml的肝素鈉，雙氫睪酮、達(dá)那唑與肝素鈉充分混合形成緩沖溶液。
[0018]在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述順磁性微球?yàn)楸砻姘鼛в恤然虬被钚曰鶊F(tuán)的四氧化三鐵，其粒徑大小為0.1 μ m-5 μ m。并且所述吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體為單克隆抗體、多克隆抗體中的一種或其混合物。所述發(fā)光液為過氧化氫和硝酸水溶液以及氫氧化
鈉與聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。
[0019]更進(jìn)一步的，所述的睪酮校準(zhǔn)品為含一定量睪酮抗原的溶液。所述的清洗液包括70g/L的磷酸氫二鈉、10g/L的磷酸二氫鈉、180g/L的氯化鈉、10mL/L的Tween-20和2%的液體生物防腐劑Proclin-300。而且所述發(fā)光液中過氧化氫的濃度為0.5%_5%，硝酸的濃度為l_2mol/L，氫氧化鈉的濃度為0.01-2.5mol/L, TritonX-1OO的濃度為0.1%_5%之間。
[0020]順磁性微球-睪酮類似物懸液的制備:[0021]順磁性微球活化:取適量順磁性微球用磷酸緩沖液清洗，重懸于上述緩沖液中；采用EDC活化，在30-40°C條件下，震蕩混勻；
[0022]包被抗原:將適量的睪酮抗原類似物加入至順磁性微球重懸液中，25°C -37°C條件下反應(yīng)2-3小時(shí)；25°C -37°C條件下封閉20分鐘-40分鐘；將包被好的順磁性微球用磷酸緩沖液清洗，得到免疫順磁性微球，即免疫磁珠。
[0023]吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體的制備:
[0024]取適量睪酮抗體，用pH9.5，0.5mol/L的磷酸緩沖液稀釋至終濃度為20mg/ml，加入適量吖啶酯，緩慢震蕩，避光反應(yīng)二十四小時(shí)；混合液經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱純化后得到吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體。
[0025]釋放劑的制備:
[0026]取適量雙氫睪酮、達(dá)那唑分別用DMF溶解，使雙氫睪酮和達(dá)那唑的濃度為IOmg/ml，再將雙氫睪酮和達(dá)那唑的DMF溶液加入到上述磷酸緩沖液中，使雙氫睪酮終濃度為0.lmg/ml，達(dá)那唑終濃度為0.01mg/ml ;取適量的肝素鈉加入到上述磷酸緩沖液中，使肝素鈉的濃度為5mg/ml,制得釋放劑。
[0027]發(fā)光液的制備:
[0028]發(fā)光液包括A液和B液；
[0029]A液:過氧化氫的質(zhì)量濃度在0.5%-3%之間，硝酸的摩爾濃度在1-1.5M之間。
[0030]B液:氫氧化鈉的摩爾濃度在0.05-1.5M之間，TritonX-1OO的體積濃度在
0.1%_2% 之間。
[0031]睪酮校準(zhǔn)品的配制:
[0032]將睪酮抗原用含3%BSA的去睪酮人血清基質(zhì)校準(zhǔn)品稀釋液配制成校準(zhǔn)品濃儲液，以國家校準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，將校準(zhǔn)品濃儲液用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至工作濃度，分別為0，75，250,500,750,1000,1500ng/dL。
[0033]清洗液的配制:
[0034]清洗液洗液包括70g/L磷酸氫二鈉，10g/L磷酸二氫鈉，180g/L NaCl,10mL/L,Tween-20和2%的液體生物防腐劑Proclin-300，將上述物質(zhì)充分混合得到清洗液。
[0035]睪酮檢測試劑盒由上述順磁性微球、吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體、睪酮釋放劑、發(fā)光液、睪酮校準(zhǔn)品與清洗液組成。。
[0036]當(dāng)然，以上說明僅僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，本發(fā)明并不限于列舉上述實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)說明的是，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本說明書的教導(dǎo)下，所做出的所有等同替代、明顯變形形式，均落在本說明書的實(shí)質(zhì)范圍之內(nèi)，理應(yīng)受到本發(fā)明的保護(hù)。
[0037]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0038]分析靈敏度定義為:對20次零校準(zhǔn)品的測定，取其2倍的平均偏差，其在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的濃度即為分析靈敏度;分析靈敏度〈10ng/dl，符合標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)如下表I所示:
[0039]表I
[0040]
[Hs
靈敏度9.98ng/dl[0041]線性范圍:用Logit-1og模型擬合，濃度范圍為10-1500ng/dL，對于濃度大于1500ng/dL的標(biāo)本應(yīng)先進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行測定；線性系數(shù)^ 0.99 ;如表2所示
[0042]表2
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的睪酮檢測試劑，其按照組成包括以下組分:0.002%-0.01%的順磁性微球、0.4 μ g/ml -1.0 μ g/ml 口丫唳酯標(biāo)記的睪酮抗體、復(fù)合睪酮釋放劑、發(fā)光液A和發(fā)光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睪酮校準(zhǔn)品與一定濃度的清洗液；所述睪酮釋放劑為雙氫睪酮、達(dá)那唑與肝素鈉的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的睪酮檢測試劑，其特征在于，所述睪酮釋放劑按照濃度組成包括以下組分:0.05mg/ml-0.2mg/ml的雙氫睪酮、0.01mg/ml-0.05mg/ml的達(dá)那唑與5-20mg/ml的肝素鈉，雙氫睪酮、達(dá)那唑與肝素鈉充分混合形成緩沖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的睪酮檢測試劑，其特征在于，所述順磁性微球?yàn)楸砻姘鼛в恤然虬被钚曰鶊F(tuán)的四氧化三鐵，其粒徑大小為0.1 μ m -5 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的睪酮檢測試劑，其特征在于，所述吖啶酯標(biāo)記的睪酮抗體為單克隆抗體、多克隆抗體中的一種或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的睪酮檢測試劑，其特征在于，所述發(fā)光液A為過氧化氫和硝酸水溶液，發(fā)光液B為氫氧化鈉與聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的睪酮檢測試劑，其特征在于，所述的睪酮校準(zhǔn)品為含睪酮抗原濃度為0ng/dl-1500ng/dl的溶液； 所述的清洗液包括70g/L的磷酸氫二鈉、10g/L的磷酸二氫鈉、180g/L的氯化鈉、IOmL/L的Tween-20和2%的液體生物防腐劑Proclin_300。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的睪酮檢測試劑，其特征在于，所述發(fā)光液A中過氧化氫的濃度為0.5%-5%，硝酸的濃度為l-2mol/L，發(fā)光液B中氫氧化鈉的濃度為0.01-2.5 mol/L,TritonX-1OO 的濃度為 0.1%_5% 之間。
【文檔編號】G01N21/76GK103954779SQ201410091245
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】孫成艷, 顧小豐, 闞洪晶, 高威, 王香琪, 王皓 申請人:長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司