一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于抗藥性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法及應(yīng)用。該方法包括以下步驟：用微量點樣器把草甘膦藥液滴至待測植株的葉子中脈兩側(cè)，繼續(xù)種培，觀察點樣處及整株植株7天，評級確定抗藥性，稱重計算抑制中劑量。本發(fā)明方法只需對待測樣品進行微量點樣，7天觀察即可鑒定其抗藥性，對于待測樣品無明顯選擇條件，直接進行檢測即可，且7天即可鑒定結(jié)果，相比現(xiàn)有整株檢測需時長具有明顯優(yōu)勢，結(jié)果與整株測定的結(jié)果一致，具有方便、省時、省力、省空間及對田間樣品直接進行檢測等優(yōu)點，可以作為早期抗性監(jiān)測的方法。
【專利說明】一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗藥性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]從20世紀(jì)80年代開始，世界范圍內(nèi)大量應(yīng)用除草劑，全球抗藥性雜草的發(fā)展幾乎呈直線上升。截至2014年I月，全球已有222種(129種雙子葉，93種單子葉)雜草的416個生物型在各類農(nóng)田系統(tǒng)對21類化學(xué)除草劑產(chǎn)生了抗藥性。雜草的抗藥性問題已經(jīng)成為雜草治理的難題。
[0003]草甘膦屬于內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，其作用靶標(biāo)酶為5-烯醇丙酮莽草酸-3-憐酸合成酶(5-enolpyruvyl-2shikimate_3-phosphate synthase,簡稱 EPSPS)。通過競爭性抑制莽草酸途徑中EPSPS的活性，導(dǎo)致植物體內(nèi)莽草酸積累過量，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成受阻而死亡。其在土壤中殘留量極低，使人們一度認(rèn)為不可能出現(xiàn)抗草甘膦的雜草。自20世紀(jì)70年代商品化以來，其在農(nóng)田和果園應(yīng)用范圍和使用量不斷擴大。然而自1996年澳大利亞首次報道瑞士黑麥草(Lolium rigidum)對草甘膦產(chǎn)生抗性以來，世界范圍內(nèi)抗草甘膦的雜草生物型出現(xiàn)的頻率逐漸加快。截止到目前，全世界抗草甘膦的雜草已上升至25種，這給其應(yīng)用帶來了前所未有的挑戰(zhàn)，也給雜草的治理帶來的一定的難度，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，已經(jīng)引起了國內(nèi)外專家的極大關(guān)注。因此為了防止抗藥性雜草的產(chǎn)生和蔓延，采用快速有效的方法對抗性雜草進行早期鑒定，及早控制抗草甘膦雜草的蔓延傳播，對于田間雜草治理具有重要意義。
[0004]目前，雜草抗藥性檢測常用的方法有整株植物測定法和種子測定法。采用整株測定法鑒定雜草的抗藥性，存在耗時長(15?20天)，工作量大，占地空間大的缺點，且植株生長中個體間的差異如高矮、精細(xì)等也會影響試驗結(jié)果；種子測定法雖具有方便、省時、省力等優(yōu)點，但種子發(fā)芽后生長差異較大，結(jié)果差異性很大。而抗草甘膦雜草的鑒定方法主要為整株植物測定法、PCR檢測法。其中使用最廣泛的是整株植物測定法，一直是篩選和鑒定抗藥性雜草生物型的有效手段。此方法實驗技術(shù)簡單，且直觀有效，基本上可模擬田間情況，適用于大部分雜草的抗藥性檢測，但是存在如上所述缺點；而PCR檢測法操作具有一定的技術(shù)性，且需要費用昂貴。因此有必要選擇一種快速、簡單、可靠的方法來鑒定抗草甘膦雜草的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法。該方法操作簡單、見效快，試驗植株少、占地空間少，且可同時對田間采集樣品進行檢測。
[0006]本發(fā)明再一目的在于提供上述快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法在檢測植物抗藥性中的應(yīng)用。[0007]本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn):
[0008]一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，包括以下步驟:
[0009]用微量點樣器把草甘膦藥液滴至待測植株的葉子中脈兩側(cè)，繼續(xù)種培，觀察點樣處及整株植株7天，評級確定抗藥性，稱重計算抑制中劑量。
[0010]所述評級指對植株癥狀分級，判斷標(biāo)準(zhǔn)為:點樣處及整株無任何藥害癥狀定為O級；點樣處出現(xiàn)失綠，而整株無癥狀定為I級；點樣處出現(xiàn)失綠，且整株枯黃萎蔫定為2級。其中，O級為具有抗藥性，I級為可能存在抗藥性的風(fēng)險，2級不具有抗藥性。
[0011]對于I級植株應(yīng)進行后續(xù)跟蹤，以便及時確定其抗藥性。
[0012]所述稱重指點樣后第7天，將植株地上部剪下，稱鮮重，取相同葉期不點樣處理植株作為對比，計算草甘膦對植株的鮮重抑制率。
[0013]用SPSS軟件數(shù)量型數(shù)據(jù)分析法得出抑制中劑量(ED5tl),與敏感植物生物型ED5tl值281.4g a.1./ha相比，若所測植物生物型ED5tl >敏感植物生物型ED5tl，證實存在抗藥性。
[0014]所述敏感植物生物型為廣東省農(nóng)科院植保所雜草室保存的敏感型植株，2011年采集于廣州市番禺東升菜場田埂。
[0015]所述的ED5tl值表示草甘膦抑制植物鮮重50%生長所需的劑量，此值越小，表明植物存在抗藥性的可能性越小。
[0016]所述滴加的草甘膦藥液總量為10?16uL，分為多次滴加，每次luL，分滴于中脈兩偵1K優(yōu)選地，每側(cè)滴加5?8滴,每滴相隔0.5mm。
[0017]優(yōu)選地，所述的葉子優(yōu)選為4?5葉期的第2或第3片葉子。
[0018]優(yōu)選地,所述的待測植株為牛筋草(Eleusine indica(L.)Gaertn)。
[0019]優(yōu)選地，所述的草甘膦藥液的劑量為1230?3075g/ha。
[0020]優(yōu)選地，所述的微量點樣器指微量移液器、點滴儀或移液槍。
[0021]上述快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法在檢測植物抗藥性中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明方法只需對待測樣品進行微量點樣，7天觀察即可鑒定其抗藥性，對于待測樣品無明顯選擇條件，直接進行檢測即可，且7天即可鑒定結(jié)果，相比現(xiàn)有整株檢測需時長具有明顯優(yōu)勢，結(jié)果與整株測定的結(jié)果一致，具有方便、省時、省力、省空間及對田間樣品直接進行檢測等優(yōu)點，可以作為早期抗性監(jiān)測的方法。
[0023]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果:
[0024](I)本發(fā)明的以微量點滴法為基礎(chǔ)的快速檢測植株對草甘膦抗藥性的方法，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，對早期抗藥性檢測具有指導(dǎo)作用。
[0025](2)本發(fā)明的鑒定方法操作簡便，一般實驗人員即可操作；目測即可估計植株是否產(chǎn)生抗藥性，從而進一步通過數(shù)據(jù)證實；且可田間直接操作檢測。
[0026](3)本發(fā)明的鑒定方法見效快，待測樣品只需7天即可確定其是否存在抗藥性。
[0027](4)本發(fā)明的鑒定方法成本低，不需購置特殊儀器設(shè)備，只需微量點樣器即可。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為草甘膦對牛筋草的鮮重抑制率曲線。
【具體實施方式】[0029]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0030]下列實施例中所用草甘膦為農(nóng)達(dá)，其含量為41%草甘膦異丙胺鹽水劑。美國孟山都公司生產(chǎn)。所用微量點樣器為手動微量移液器，英國BURKARD公司生產(chǎn)，或2.5uL移液槍，德國eppendorf公司生產(chǎn)。
[0031]實施例1
[0032]對廣東省農(nóng)科院植保所雜草室保留的兩種牛筋草(惠州楊村，2011年9月采集于廣東省惠州市楊村番石榴園；番禺東升，2011年9月采集于廣州市番禺東升菜場田埂)牛筋草生物型(3~4葉期)進行測定，每個生物型選擇64株，分別單株移栽至裝有土的塑料杯中，待生長正常至4~5葉期，選擇第2或第3片葉，用微量點滴法將IOuL不同劑量的草甘膦藥液滴至所選葉片的中脈兩側(cè)(每滴luL，共10滴)，滴加劑量分別為1538、1845和2152.5g a.1./ha，每個劑量16株平行，兩個生物型分別留取16株不滴加草甘膦作為對比。處理后3天，番禹牛 筋草生物型不同濃度草甘膦點樣處均表現(xiàn)出黃化癥狀，即出現(xiàn)I級癥狀，而惠州楊村生物型未出現(xiàn)黃化癥狀，癥狀級別為O級；隨著處理時間的延長，處理后7天，番禹牛筋草生物型草甘膦各劑量處理組均表現(xiàn)出整株黃化干枯，即出現(xiàn)2級癥狀，鑒定不具有抗藥性；而惠州楊村生物型生長正常，與對照無差異，癥狀級別為O級，鑒定具有抗藥性。此時，將兩種牛筋草生物型植株地上部剪下，稱量鮮重，用EXCEL軟件計算了不同劑量草甘膦對兩種牛筋草鮮重的抑制率，結(jié)果表明當(dāng)劑量達(dá)2152.5g/ha (約常規(guī)劑量1.7倍)時，對番禺東升牛筋草生物型的鮮重抑制率為用67.8%，而對惠州楊村牛筋草生物型的鮮重抑制率為26.1%(見圖1)。用SPSS軟件數(shù)量型數(shù)據(jù)分析法得出草甘膦對兩種牛筋草生物型抑制中劑量(ED5tl)15結(jié)果表明，惠州楊村牛筋草生物型ED5tl值為2429.2g a.1./ha，番禺東升牛筋草生物型ED5tl值為285.5g a.1./ha,與標(biāo)準(zhǔn)敏感牛筋草生物型ED5tl值281.4 g a.1./ha相比，惠州楊村ED5tl值遠(yuǎn)大于281.4 g a.1./ha,證實惠州楊村牛筋草存在抗藥性，而番禺東升ED5tl值接近281.4g a.1./ha,證實不存在抗藥性。
[0033]實施例2
[0034]從廣東省白云區(qū)石井兩地(均為2011年9月采集于廣州市白云區(qū)石井不同農(nóng)戶菜田田埂)采集到2~3葉期牛筋草A和B，室內(nèi)移栽至盆缽中，每盆5株，返活生長至4~5葉期待測。選擇第2或第3片葉，用微量點滴法將10 uL不同劑量的草甘膦藥液滴至所選葉片的中脈兩側(cè)(每滴I uL，共10滴)，滴加劑量分別為1538、1845和2152.5g a.1./ha，每個劑量5株平行，兩個生物型分別留取5株不滴加草甘膦作為對比。處理后7天的結(jié)果表明，三個劑量的白云區(qū)石井牛筋草A在設(shè)計劑量范圍內(nèi)的點樣處和植株均無任何癥狀，癥狀級別為O級，鑒定具有抗藥性；而牛筋草B在三個設(shè)計劑量范圍內(nèi)的點樣處和整株均出現(xiàn)黃化干枯癥狀，癥狀級別為2級，鑒定為無抗藥性(結(jié)果見表1)。
[0035]表1草甘膦點樣處理牛筋草后7天出現(xiàn)的癥狀級別及抗性情況
[0036]
fmj癥狀級別j抗性與否
白云區(qū)牛筋草A 點樣處及整株均無?W
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟:用微量點樣器把草甘膦藥液滴至待測植株的葉子中脈兩側(cè)，繼續(xù)種培，觀察點樣處及整株植株7天，評級確定抗藥性，稱重計算抑制中劑量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述評級指對植株癥狀分級，判斷標(biāo)準(zhǔn)為:點樣處及整株無任何藥害癥狀定為O級；點樣處出現(xiàn)失綠，而整株無癥狀定為I級；點樣處出現(xiàn)失綠，且整株枯黃萎蔫定為2級。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述O級為具有抗藥性；所述I級為可能存在抗藥性的風(fēng)險；所述2級不具有抗藥性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述稱重指點樣后第7天，將植株地上部剪下，稱鮮重，取相同葉期不點樣處理植株作為對t匕，計算草甘膦對植株的鮮重抑制率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述滴加的草甘膦藥液總量為10?16uL，分為多次滴加，每次luL，分滴于中脈兩側(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述的葉子為4?5葉期的第2或第3片葉子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述的待測植株為牛筋草(Eleusine indica(L.)Gaertn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述的草甘膦藥液的劑量為1230?3075g/ha。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法，其特征在于:所述的微量點樣器指微量移液器、點滴儀或移液槍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項所述的快速檢測植物對草甘膦抗藥性的鑒定方法在檢測植物抗藥性中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N5/00GK103837656SQ201410088332
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】楊彩宏, 馮莉, 田興山, 岳茂峰, 高家東, 張?zhí)﹦? 崔燁, 陳國奇 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所