基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含微流控芯片、至少一種能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠以及至少一種針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體，其中，所述的微流控芯片包括玻璃芯片基底，所述的玻璃芯片基底上設(shè)有微流控通道，微流控通道內(nèi)設(shè)有軟磁性微陣列。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)一次樣品進(jìn)樣即可捕獲檢測(cè)多種不同類別的稀有循環(huán)腫瘤干細(xì)胞，具有較高的靈敏度和特異性，操作方便快速，捕獲細(xì)胞易于收集，無需芯片內(nèi)部微流通道復(fù)雜的一抗二抗表面修飾過程等特點(diǎn)。
【專利說明】基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(簡稱肝癌)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在中國每年新診斷的肝癌約占全世界55 %，其死亡率在我國惡性腫瘤中列第二位。雖然手術(shù)切除是目前肝癌治療的首選方式，但即便是根治性切除5年內(nèi)仍有60-70%的病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是病人術(shù)后的主要死亡原因，它已成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。因此，探索肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的機(jī)制，尋找更有效的轉(zhuǎn)移早期預(yù)警及療效評(píng)估手段，以便進(jìn)行早期合理干預(yù)，已成為進(jìn)一步提高肝癌生存率的關(guān)鍵。
[0003]近來研究提示循環(huán)腫瘤細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中扮演關(guān)鍵角色。但是每天有數(shù)以千計(jì)的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤進(jìn)入循環(huán)血中，但并不是每個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞都能成為轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的“種子”。這除有環(huán)境(土壤)因素外，“種子”本身特性也決定著其能否在新環(huán)境中成功“定植”。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)具有干細(xì)胞特性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與肝癌切除術(shù)后早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，相對(duì)于較成熟的循環(huán)腫瘤細(xì)胞而言，那些循環(huán)腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的成瘤、抗凋亡能力。因此精確地捕獲分類這些導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的“種子”細(xì)胞具有重大的臨床和科研意義。然而這群細(xì)胞在外周血中極其稀有，平均IO7個(gè)白細(xì)胞中只有一個(gè)循環(huán)腫瘤干細(xì)胞。目前已有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲技術(shù)如梯度密度離心技術(shù)、濾膜技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)在實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤干細(xì)胞的捕獲分類方面均存在一定的缺陷。梯度密度離心和濾膜技術(shù)通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞之間物理特性的差異(密度、大小)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的捕獲，由于這兩種基于物理特性實(shí)現(xiàn)捕獲的技術(shù)其靈敏度和特異性較低，無法對(duì)捕獲細(xì)胞進(jìn)行分類，細(xì)胞易丟失，限制了其在循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲中的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)通過對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行特定的熒光標(biāo)記，然后利用復(fù)雜的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分選，該技術(shù)雖可實(shí)現(xiàn)不同類別腫瘤細(xì)胞的分類收集，但是設(shè)備本身成本昂貴、檢測(cè)效率低、需專人操作，同時(shí)檢測(cè)稀有細(xì)胞靈敏度差，無法對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，也很難廣泛應(yīng)用于循環(huán)腫瘤干細(xì)胞的捕獲。因此亟需開發(fā)一種廉價(jià)、操作簡單，一次性使用的，具有高靈敏度、特異性和多標(biāo)志物檢測(cè)的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞方法。
[0004]微流控芯片技術(shù)具有檢測(cè)高效、集成化、試劑消耗量小等諸多優(yōu)點(diǎn)正被越來越多地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并已發(fā)展出多種微流控細(xì)胞捕獲技術(shù)。然而目前大多數(shù)已報(bào)道的細(xì)胞捕獲芯片仍停留在單標(biāo)志物、單種細(xì)胞的捕獲，對(duì)于多標(biāo)志物、多類別細(xì)胞捕獲仍然缺乏相應(yīng)的手段。它們中的代表是Nagrath S等2007年于Nature上報(bào)道的一種單標(biāo)志物循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲芯片，該芯片在流道內(nèi)設(shè)置圓形的微柱陣列，經(jīng)過化學(xué)修飾，在流道內(nèi)壁及微柱表面結(jié)合上皮細(xì)胞黏附因子抗體，通過細(xì)胞流動(dòng)中與微柱的碰撞來捕獲靶細(xì)胞。這種方法捕獲細(xì)胞的成功與否完全取決于靶細(xì)胞是否碰撞微柱，因此其捕獲效率較低。該類芯片無法一次進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)多標(biāo)志物循環(huán)腫瘤干細(xì)胞捕獲的功能。此外這種芯片的應(yīng)用還受制于捕獲的細(xì)胞很難釋放收集和前期芯片化學(xué)修飾過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)多標(biāo)志物癌細(xì)胞捕獲的目的，Xu Y等2009年在Anal Chem上提出蛇形管道劃定不同捕獲區(qū)域，在每個(gè)捕獲區(qū)域的上下游設(shè)置進(jìn)出樣開孔，利用開孔的交替開放與封閉在不同區(qū)域固定上各自不同的核酸適體，以此來達(dá)到在同一管道中并行捕獲不同癌細(xì)胞的目的。該方法雖然可以實(shí)現(xiàn)多標(biāo)志物細(xì)胞的捕獲，但多次重復(fù)的流道固定使芯片制備過程時(shí)間長、步驟多，又由于在同一管道內(nèi)進(jìn)行流動(dòng)固定，容易產(chǎn)生上下游的交叉污染，使假陽性增高，而為了控制假陽性率，必須加長各區(qū)域的長度，這對(duì)芯片的進(jìn)一步集成造成了障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，無需對(duì)其芯片的內(nèi)部進(jìn)行繁復(fù)的化學(xué)修飾，具備一次樣品進(jìn)樣就能對(duì)完成包括單、多標(biāo)志物循環(huán)腫瘤干細(xì)胞的捕獲、鑒定和回收等功能，同時(shí)還具有操作簡便、集成度高的特點(diǎn)。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含微流控芯片、至少一種能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠以及至少一種針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體，其中，所述的微流控芯片包括玻璃芯片基底，所述的玻璃芯片基底上設(shè)有微流控通道，微流控通道內(nèi)設(shè)有軟磁性微陣列。
[0007]優(yōu)選地，所述的軟磁性微陣列由鎳鐵合金圓柱構(gòu)成，相鄰兩列鎳鐵合金圓柱交錯(cuò)排列。
[0008]更優(yōu)選地，所述的相鄰兩列鎳鐵合金圓柱的距離為100 μ m,鎳鐵合金圓柱的直徑為30 μ m，每列中相鄰兩個(gè)鎳鐵合金圓柱之間的距離為50 μ m。
[0009]優(yōu)選地，所述的腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物包括EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24、⑶13、ICAM-1、SALL4、CD44 和 ALDH 的至少一種。
[0010]本發(fā)明還提供了上述基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的第一種使用方法，其特征在于，具體步驟包括:
[0011]步驟1:裂解外周血紅細(xì)胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細(xì)胞懸液；
[0012]步驟2:將能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠摻入外周血有核細(xì)胞懸液，孵育，得到標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液；
[0013]步驟3:在微流控芯片底部施加外磁場(chǎng)，將標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液泵入微流控芯片的微流控通道中；
[0014]步驟4:將相應(yīng)的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體泵入微流控芯片的微流控通道(2)中，孵育，顯微鏡鑒定循環(huán)腫瘤干細(xì)胞；
[0015]步驟5:撤除微流控外磁場(chǎng)，回收循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0016]本發(fā)明還提供了上述基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的另一種使用方法，其特征在于，具體步驟包括:
[0017]步驟A:裂解外周血紅細(xì)胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細(xì)胞懸液；
[0018]步驟B:將針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體摻入外周血有核細(xì)胞懸液，孵育，得到含有針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體的外周血有核細(xì)胞懸液；
[0019]步驟C:將相應(yīng)的能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠摻入有針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體的外周血有核細(xì)胞懸液，孵育，得到標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液；
[0020]步驟D:在微流控芯片底部施加外磁場(chǎng)，將標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液泵入微流控芯片的微流控通道中，顯微鏡鑒定循環(huán)腫瘤干細(xì)胞；
[0021]步驟E:撤除微流控外磁場(chǎng)，回收循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0022]圖2中的上面一行顯示了基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的第一種使用方法的流程，其余部分顯示了基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的第二種使用方法的流程。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0024]本發(fā)明利用標(biāo)記有循環(huán)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫磁珠摻入外周血與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合，通過微流控芯片內(nèi)軟磁性微陣列捕獲循環(huán)腫瘤干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外周血稀有循環(huán)腫瘤干細(xì)胞的多標(biāo)志物分類檢測(cè)，撤除外加磁場(chǎng)后去磁化，使吸附的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞脫落以便于收集。本發(fā)明結(jié)合了免疫磁珠對(duì)細(xì)胞高效率結(jié)合以及微流控芯片高通量動(dòng)態(tài)捕獲的這兩大優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)一次樣品進(jìn)樣即可捕獲檢測(cè)多種不同類別的稀有循環(huán)腫瘤干細(xì)胞，具有較高的靈敏度和特異性，操作方便快速，捕獲細(xì)胞易于收集，無需芯片內(nèi)部微流通道復(fù)雜的一抗二抗表面修飾過程等特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]圖2為基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒使用流程圖；
[0027]圖3為對(duì)EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24陽性的循環(huán)肝癌干細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖。右上，紅色熒光標(biāo)記EpCAM+循環(huán)肝癌干細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核；左上，紅色熒光標(biāo)記⑶133+循環(huán)肝癌干細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記CD45+白細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核；右下，綠色熒光標(biāo)記CD90+循環(huán)肝癌干細(xì)胞，紅色熒光標(biāo)記⑶45+白細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核；左下，紅色熒光標(biāo)記⑶24+循環(huán)肝癌干細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記⑶45+白細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核。
[0028]圖4為同時(shí)使用商售CellSearch?系統(tǒng)和本專利方案中基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒對(duì)33例原發(fā)性肝癌患者外周血EpCAM+循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)對(duì)比結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例來具體說明本發(fā)明。
[0030]實(shí)施例1
[0031]1、一種基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，由以下組分組成:
[0032](I)微流控芯片，如圖1所示，為微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，所述的微流控芯片微流控芯片包括玻璃芯片基底1，所述的玻璃芯片基底I上設(shè)有長度a為50mm，寬度b為17mm的微流控通道2，微流控通道2內(nèi)設(shè)有軟磁性微陣列。所述的軟磁性微陣列由鎳鐵合金圓柱3構(gòu)成，相鄰兩列鎳鐵合金圓柱3交錯(cuò)排列。所述的相鄰兩列鎳鐵合金圓柱3的距離c為100 μ m，鎳鐵合金圓柱3的直徑d為30 μ m，每列中相鄰兩個(gè)鎳鐵合金圓柱3之間的距離e為50 μ m。后一列鎳鐵合金圓柱3水平中軸線到前一列鎳鐵合金圓柱3邊緣的最短垂直距離f為25 μ m。[0033](2)能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠，包括:抗 EpCAM 的免疫磁珠(Catalog n0.130-061-101.Miltenyi Biotec,Germany)、抗 CD133 的免疫磁珠(Catalog n0.130-050-801.Milteny Biotec)、抗 CD90 的免疫磁珠(Catalog n0.130-096-253, Milteny Biotec)和抗 CD24 的免疫磁珠(Catalogn0.130-095-951, Milteny Biotec)
[0034](3)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體，包括:抗EpCAM-PE的熒光抗體(Catalog n0.130-091-253, Milteny Biotec),抗 CD133-PE 的突光抗體(Catalogn0.130-080-801,Milteny Biotec)，抗 CD90-FITC 的熒光抗體(Catalog n0.130-095-953，Milteny Biotec),抗 CD24-PE 的突光抗體(Catalog n0.130-095403, Milteny Biotec),白細(xì)胞標(biāo)志物的熒光抗體 CD45-FITC (Catalog n0.555482，BD bioscience)和CD45-PE(Catalog n0.561866, BD bioscience)；
[0035]2、制備微流控芯片:
[0036](I)在玻璃基片上濺射Ti/Cu種子層，然后通過正膠光刻得到依據(jù)軟件模擬設(shè)計(jì)的軟磁性微陣列的陽模，接著進(jìn)行電鑄，獲得如圖1所示的由鎳鐵合金圓柱3構(gòu)成的軟磁性微陣列，鎳鐵合金圓柱3的材料由(鎳和鐵按照80: 20的質(zhì)量百分比組成)組成。
[0037](2)通過化學(xué)腐蝕的方法去除Cu/Ti種子層，獲得透明的玻璃芯片；接著劃片，獲得單個(gè)玻璃芯片基底I ;
[0038](3)通過硅片基底上的SU8膠光刻，獲得所需要的微流控通道的陰模，然后通過PDMS快速成型，制備微流控通道2 ；
[0039](4)最后采用常規(guī)方法將微流控通道2與玻璃芯片基底I進(jìn)行加壓鍵合，制成微流控芯片。
[0040]3、使用基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，對(duì)肝癌患者外周血中四種不同標(biāo)志物陽性(包括EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+)的循環(huán)肝癌干細(xì)胞進(jìn)行捕獲，具體步驟為:
[0041]步驟A:采集肝癌患者8ml外周靜脈血，等分成4份，每份2ml，分別與其9X體積的紅細(xì)胞裂解液(Red blood cell lysis solutionlOX, Catalog n0.130094183,Miltenyi Biotec)室溫混勻2分鐘，加入等體積PBS緩沖液(PBS1X, pH = 7.4, Catalogn0.21-040-CVR, Corning,)終止裂紅反應(yīng)，室溫以350g的離心力離心5分鐘，去除上清，300 μ I PBS緩沖液(pH = 7.4)重懸，獲得外周血全部有核細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)。最終獲得4份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液。
[0042]步驟B:將抗EpCAM-PE的熒光抗體(同上)以比例1: 100、白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-FITC(同上)的熒光抗體以比例1: 200與第一份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液混合，將抗⑶133-ΡΕ的熒光抗體以比例1: 100、白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-FITC(同上)的熒光抗體以比例1: 200與第二份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液混合，將抗⑶90-FITC的熒光抗體以比例1: 100、白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-ΡΕ(同上)的熒光抗體以比例1: 200與第三份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液混合，將抗⑶24-ΡΕ的熒光抗體以比例1: 100、白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-FITC(同上)的熒光抗體以比例1: 200與第四份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液混合，室溫孵育I小時(shí)，室溫以350g離心力離心5分鐘，去除上清，分別加入300 μ I PBS緩沖液(pH = 7.4)重懸，得到4份300 μ I含有針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體的外周血有核細(xì)胞懸液；
[0043]步驟C:取4種抗EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24免疫磁珠各100 μ I與步驟B獲得的4份300 μ I含有針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體的外周血有核細(xì)胞懸液分別充分混勻(針對(duì)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫磁珠在檢測(cè)中與本次檢測(cè)中使用的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物熒光抗體相對(duì)應(yīng))，4°c孵育30分鐘，加入1mlPBS緩沖液(pH = 7.4)，以350g的離心力4°C離心5分鐘,去除上清,加入1ml PBS緩沖液(pH = 7.4)重懸,得到標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液；
[0044]步驟D:取4塊微流控芯片，在微流控芯片底部分別施加外磁場(chǎng)(汝鐵硼永磁鐵)，步驟C獲得的4份Iml標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液以2ml/hr的速度勻速分別泵入微流控芯片的微流控通道2中。熒光顯微鏡下觀察捕獲的EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+循環(huán)肝癌干細(xì)胞。(如圖3所示)
[0045]步驟E:撤除微流控外磁場(chǎng)，回收循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0046]在本實(shí)施例中檢測(cè)了 33名原發(fā)性肝癌患者外周血的EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+循環(huán)肝癌干細(xì)胞。同時(shí)還從這33名患者外周靜脈采集了另一份7.5ml外周血，并使用目前商售的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)(CellSearch?, Johnson & Johnson, USA)對(duì)這33份外周血進(jìn)行EpCAM+循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:使用本發(fā)明方案中的微流控芯片檢測(cè)EpCAM+循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢出率為75.76%，而CellSearch?系統(tǒng)的檢出率為54.54%。(如圖4所示)。此外CellSearch?系統(tǒng)僅能檢測(cè)一種標(biāo)志物的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞。因此本發(fā)明方案的微流控芯片循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢出效率顯著高于目前商售系統(tǒng)，并且可以實(shí)現(xiàn)多種標(biāo)志物循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)。
[0047]實(shí)施例2
[0048]1、一種基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，組成與實(shí)施例1相同:
[0049]2、微流控芯片制備同 實(shí)施例1.[0050]3、制備摻入!fep3B細(xì)胞株的血液樣本，模擬含有循環(huán)腫瘤干細(xì)胞的血樣:
[0051](l)Hep3B細(xì)胞株(購自中科院上海生命科學(xué)園，肝細(xì)胞肝癌腫瘤細(xì)胞，表達(dá) EpCAM、CD133、CD90 和 CD24 的！fep3B 細(xì)胞陽性率分別為 99.8 % 分、98 %,0.2 %和1%，本實(shí)施例中以Hep3B細(xì)胞作為摻入法的循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞)。取4X107的H印3B細(xì)胞，按每份IXlO7細(xì)胞分別與如下熒光抗體以1: 100混合⑶24-PE(Catalogn0.130-095-403, Milteny Biotec), CD90-FITC(Catalog n0.130-095-953, MiltenyBiotec), EpCAM-PE(Catalog n0.130-091-253, Milteny Biotec), CD133-PE (Catalogn0.130-080-801, Milteny Biotec)，4°C 孵育 15min，使用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria, BDBiosciences)分別分選 EpCAM+、CD133+、CD90+ 和 CD24+ 的!fep3B 細(xì)胞各 1000 個(gè)，分別用 ImlPBS(PBS1X,Catalog n0.21-040-CVR,Corning)重懸。取4支Eppendorf 管，每個(gè)管中放入上述四種!fep3B細(xì)胞懸液各100 μ I (每個(gè)管內(nèi)含有100個(gè)!fep3B細(xì)胞)，另取4支Eppendorf管，每個(gè)管中放入上述四種!fep3B細(xì)胞懸液各10 μ I (每個(gè)管內(nèi)含有10個(gè)!fep3B細(xì)胞)。
[0052]將上述制備好的四種Hep3B細(xì)胞懸液分別摻入Iml健康人外周血，分別得到100個(gè)EpCAM+H印3B/Iml外周血樣本、100個(gè)CD133+Hep3B/lml外周血樣本、100個(gè)CD90+!fep3B/lml 外周血樣本和 100 個(gè) CD24+!fep3B/lml 外周血樣本。10 個(gè) EpCAM+H印3B/Iml外周血樣本、10個(gè)CD133+!fep3B/lml外周血樣本、10個(gè)CD90+!fep3B/lml外周血樣本和10個(gè)CD24+!fep3B/lml外周血樣本
[0053]4、使用基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，對(duì)血樣中四種不同標(biāo)志物陽性(包括EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+)的循環(huán)肝癌干細(xì)胞進(jìn)行捕獲，具體步驟為:
[0054]步驟(1):將上述制備好的血液樣本，分別與其9X體積的紅細(xì)胞裂解液(Redblood cell lysis solutionlOX, Catalog n0.130094183, Miltenyi Biotec)室溫混勻 2分鐘，加入等體積 PBS 緩沖液(PBS1X，pH = 7.4Catalog n0.21-040-CVR, Corning)終止裂紅反應(yīng)，室溫以350g的離心力離心5分鐘，去除上清，300 μ IPBS緩沖液(pH = 7.4)重懸，獲得外周血全部有核細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)。最終獲得8份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液。
[0055]步驟(2):取抗EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24免疫磁珠各100 μ I與步驟B獲得的8份300 μ I外周血有核細(xì)胞懸液分別充分混勻(針對(duì)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫磁珠在檢測(cè)中單獨(dú)使用并與本次檢測(cè)中使用的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物熒光抗體相對(duì)應(yīng))，4°C孵育30分鐘，加入Iml PBS緩沖液(ρΗ7.4)，以350g的離心力4°C離心5分鐘，去除上清，加入1ml PBS緩沖液(pH = 7.4)重懸,得到標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液。
[0056]步驟(3):取8塊微流控芯片，在微流控芯片底部分別施加外磁場(chǎng)(汝鐵硼永磁鐵)，將8份Iml標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液以2ml/hr的速度勻速分別泵入微流控芯片的微流控通道2中。熒光顯微鏡下觀察捕獲的EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+循環(huán)肝癌干細(xì)胞。
[0057]步驟⑷:將抗EpCAM-PE的熒光抗體以1: 100的比例和白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-PE的熒光抗體以I: 200的比例一起加入第一份600 μ I PBS緩沖液(ρΗ7.4)，將抗CD133-PE的熒光抗體以1: 100的比例和白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-ΡΕ的熒光抗體以1: 200的比例一起加入第二份600 μ I PBS緩沖液`(ρΗ7.4)，將抗CD90-FITC的熒光抗體以I: 100的比例和白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-ΡΕ的熒光抗體以1: 200的比例一起加入第三份600 μ I PBS緩沖液(ρΗ7.4)，將抗⑶24-ΡΕ的熒光抗體以1: 100的比例和白細(xì)胞標(biāo)志物⑶45-ΡΕ的熒光抗體以1: 200的比例一起加入第四份600 μ I PBS緩沖液(pH = 7.4)，室溫避光的環(huán)境下，以lml/hr的速度分別泵入含有相應(yīng)的免疫磁珠的微流控芯片的微流控通道2中，直至600 μ I全部泵入(需36分鐘)，整個(gè)操作過程保持底部外加磁場(chǎng)存在，顯微鏡鑒定循環(huán)腫瘤干細(xì)胞。
[0058]步驟(5):撤除微流控外磁場(chǎng)，回收循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0059]本試劑盒捕獲的EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的H印3Β細(xì)胞數(shù)量分別為:摻入100個(gè)/ml細(xì)胞，每種標(biāo)志物細(xì)胞的捕獲效率高達(dá)99 %、98 %、98 %和99 %，摻入10個(gè)/ml細(xì)胞，每種標(biāo)志物細(xì)胞的捕獲效率高達(dá)100 %、80 %、90 %和90 %，。使用目前商售的MACS細(xì)胞富集系統(tǒng)(QuadroMACS? Separator and Starting Kits, Miltenyi Biotec, Germany),按照產(chǎn)品說明書對(duì)相同的血樣進(jìn)行處理，摻入100個(gè)/ml細(xì)胞，每種標(biāo)志物標(biāo)志物Hep3B細(xì)胞的捕獲率分別僅為32%、25%、30%、36%。摻入10個(gè)/ml細(xì)胞，四種標(biāo)志物標(biāo)志物H印3B細(xì)胞回收效率為零。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明方案中微流控芯片對(duì)外周血不同標(biāo)志物循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分類捕獲效率，尤其是外周血中極微量細(xì)胞(< 10個(gè)/ml)捕獲效率明顯高于目前商售系統(tǒng)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含微流控芯片、至少一種能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠以及至少一種針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體，其中，所述的微流控芯片包括玻璃芯片基底(I)，所述的玻璃芯片基底(I)上設(shè)有微流控通道(2)，微流控通道(2)內(nèi)設(shè)有軟磁性微陣列。
2.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的軟磁性微陣列由鎳鐵合金圓柱(3)構(gòu)成，相鄰兩列鎳鐵合金圓柱(3)交錯(cuò)排列。
3.如權(quán)利要求2所述的基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的相鄰兩列鎳鐵合金圓柱(3)的距離(a)為100 μ m，鎳鐵合金圓柱(3)的直徑(b)為30 μ m，每列中相鄰兩個(gè)鎳鐵合金圓柱(3)之間的距離(c)為50μπι。
4.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物包括EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24、⑶13、ICAM-1、SALL4、⑶44和ALDH的至少一種。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，具體步驟包括: 步驟1:裂解外周血紅細(xì)胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細(xì)胞懸液； 步驟2:將能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠摻入外周血有核細(xì)胞懸液，孵育，得到標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液； 步驟3:在微流控芯片底部施加外磁場(chǎng)，將標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液泵入微流控芯片的微流控通道(2)中； 步驟4:將相應(yīng)的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體泵入微流控芯片的微流控通道(2)中，孵育，顯微鏡鑒定循環(huán)腫瘤干細(xì)胞； 步驟5:撤除微流控外磁場(chǎng)，回收循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的基于磁珠和微流控芯片的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，具體步驟包括: 步驟A:裂解外周血紅細(xì)胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細(xì)胞懸液； 步驟B:將針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體摻入外周血有核細(xì)胞懸液，孵育，得到含有針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體的外周血有核細(xì)胞懸液； 步驟C:將相應(yīng)的能夠與循環(huán)腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記有腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的免疫磁珠摻入有針對(duì)腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物的熒光抗體的外周血有核細(xì)胞懸液，孵育，得到標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液； 步驟D:在微流控芯片底部施加外磁場(chǎng)，將標(biāo)記有免疫磁珠的外周血有核細(xì)胞懸液泵入微流控芯片的微流控通道(2)中，顯微鏡鑒定循環(huán)腫瘤干細(xì)胞； 步驟E:撤除微流控外磁場(chǎng)，回收循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以進(jìn)行下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK103869060SQ201410081509
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】樊嘉, 楊欣榮, 孫云帆, 徐泱, 周儉 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院