一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件7，上方設(shè)有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
【專利說明】一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測半乳糖凝集素-3 (Gal-3)的膠體金試紙。
【背景技術(shù)】
[0002]半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal_3)也稱半乳糖結(jié)合蛋白_3，分子量為31kD，是半乳糖凝集素家族的重要成員之一。Galectin家族的成員需要滿足兩個標準:第一對-半乳糖的親和力；第二在糖識別域(the carbohydrate recognition domain, CRD)有顯著序列相似性。Galectin-3有兩個功能域:羧基端是糖識別域，包含了 135個氨基酸殘基；氨基端包含100?150個氨基酸殘基，由富含脯氨酸和甘氨酸的9個氨基酸殘基串聯(lián)重復組成。Galectin-3主要在巨噬細胞、嗜酸性細胞、中性粒細胞及肥大細胞中表達。其功能依據(jù)其在細胞內(nèi)的定位。在靜止細胞內(nèi)主要存在于胞漿，而在增殖細胞中則主要存在于細胞核。Galectin-3參與調(diào)節(jié)細胞生長，抗凋亡，介導細胞黏附，參與血管形成及炎癥反應等生物學功能。研究表明半乳糖凝集素-3是心肌纖維化標志物，與心力衰竭的發(fā)生和死亡風險增加相關(guān)。心室功能障礙患者的半乳糖凝集素-3含量會升高，而且含量于心衰的嚴重程度直接相關(guān)?？焖俣繖z測患者的半乳糖凝集素-3水平具有重大的臨床意義。
[0003]免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領(lǐng)域。
[0004]目前，檢測半乳糖凝集素-3(Gal-3)的方法目前主要是酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)，ELISA技術(shù)存在以下缺點:檢測設(shè)備要求高，成本高；干擾因素較多，重復性不好；檢測時間長。因此酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測半乳糖凝集素-3不適合臨床快速診斷。鑒于目前尚無快速的定量檢測方法，本發(fā)明的目的是提供一種可用于快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙以及一種可用于快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒，所述膠體金試紙和膠體金試紙盒具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準確等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，本發(fā)明所述的半乳糖凝集素-3的膠體金試紙具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準確等優(yōu)點，適于臨床快速診斷。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:[0007]—種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件7，上方設(shè)有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的Gal_3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
[0008]優(yōu)選地,所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。BSA是牛血清白蛋白。
[0009]優(yōu)選地，所述第一固定部件7為雙面膠，第二固定部件6為單面膠。
[0010]優(yōu)選地，所述兩條控制線9與檢測線8為平行設(shè)置。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供了一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒，在本發(fā)明所述的定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙的基礎(chǔ)上還包括一外殼10。
[0012]所述外殼優(yōu)選塑料外殼。
[0013]所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜I上的檢測線8和兩條控制線9、以及吸水墊4。
[0014]本發(fā)明所述的試紙盒具有方便攜帶和貯存的優(yōu)點。
[0015]本發(fā)明的又一個目的是提供本發(fā)明所述的膠體金試紙在檢測半乳糖凝集素-3中的應用。
[0016]本發(fā)明的再一個目的是提供一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的方法，包括使用權(quán)利要求1所述膠體金試紙來快速定量檢測半乳糖凝集素-3的步驟。
[0017]本發(fā)明所述的快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙或試紙盒的工作原理是:采用雙向側(cè)流免疫反應原理,通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗時樣本中的Gal-3抗原首先與偶合墊上的抗Gal-3抗體偶合物發(fā)生免疫反應，形成免疫復合物。其后免疫復合物隨著樣本在硝基纖維素膜上層析流動，當免疫復合物層析至硝基纖維素膜上的檢測區(qū)(Gal-3檢測線)時，與預先包被在硝基纖維素膜上的抗GAL-3抗體發(fā)生反應從而被固定在硝基纖維素膜的檢測線上。血液中的GAL-3越多，檢測線上的復合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢測過程中，控制線偶合物(即DNP-BSA標記的膠體金)，也會隨樣本在硝基纖維素膜上層析，當層析至硝基纖維素膜的控制線時，DNP-BSA膠體金會與預先包被在硝基纖維素膜上的抗DNP抗體發(fā)生反應從而被固定在對照區(qū)(控制線)上。由于膠體金為紅色，因而固定在硝基纖維素膜控制線上的抗DNP中的DNP-BSA膠體金免疫復合物將顯示紅色。當樣本中不含GAL-3時，則只顯示兩條控制線。當樣本含GAL-3時，檢測線就會清晰的顯示出來。
[0018]當反應結(jié)束后，利用多功能免疫檢測儀(瑞萊生物工程(深圳)有限公司)將控制線和檢測線的光密度進行分析，并將所分析得到的結(jié)果進行運算，從而得到相對光密度值(RI)0然后檢測儀根據(jù)已預先設(shè)置在檢測儀內(nèi)的標準曲線對GAL-3的濃度進行計算并顯示結(jié)果，以ng/mL為單位表示。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明所述快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙的一種優(yōu)選實施方式的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]其中，1:硝酸纖維素膜，2:偶合物墊片，3:樣本墊片，4:吸水墊，5:支撐墊片，6:單面膠，7:雙面膠，8:檢測線，9:控制線。
[0021]圖2是本發(fā)明所述快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒的一種優(yōu)選實施方式的示圖。
[0022]其中，3:樣本墊片，8:檢測線，9:控制線，4:吸水墊，10:外殼。
[0023]實施方式
[0024]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明所述快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙或試紙盒進行詳細說明，不能理解為是對本發(fā)明的限制。以下實施例中所使用的材料和試劑除特別說明外，均為普通市售。
[0025]【實施例1】制備快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙
[0026]如圖1所示的膠體金試紙結(jié)構(gòu)，包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4，另一端上方層疊連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片遠離硝酸纖維素膜I的一端上方層疊連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7，上方粘接單面膠6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
[0027]所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。
[0028]其中，硝酸纖維`素膜I在膠體金試紙中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應的發(fā)生處；檢測線8是將Gal-3抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0.5mg/ml的濃度，取lul/cm劃線于所述硝酸纖維素膜I上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制線9是將抗DNP抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0.5mg/ml的濃度,取lul/cm劃線于所述硝酸纖維素膜I上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0029]其中，所述偶合物墊片2的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩沖液(包含0.1-1%的酪蛋白，0.5-5%的牛血清白蛋白、
0.005-0.5%的硼酸、0.01-0.2%的PEG)中浸泡5分鐘后取出，37°C干燥后，用Biodot包膜儀器將金標記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物涂布在偶合物墊片2上，涂布量是lul/mm，干燥，即得。優(yōu)選地，所述偶合物墊片2的預封閉緩沖液包含0.8%的酪蛋白，4%的牛血清白蛋白，0.007%的硼酸，0.1%的PEG。
[0030]其中，所述樣本墊片3可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片用141封閉液(包含:0.1-1%的Tris,0.1-1%的Tween20,0.1-1%的酪蛋白，0.05-0.5%的鼠抗人紅細胞)浸泡5分鐘后，過夜37°C干燥，即得。優(yōu)選地，所述141封閉液包含:0.3%的Tris，0.8%的酪蛋白，0.3%的鼠抗人紅細胞。
[0031]將上述各組成部件按圖1所示結(jié)構(gòu)粘貼在支撐墊片5上，獲得快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙。
[0032]【實施例2】用本發(fā)明所述膠體金試紙快速定量檢測半乳糖凝集素-3。
[0033]取本發(fā)明優(yōu)選的一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，如圖1所示，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4，另一端上方層疊連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片遠離硝酸纖維素膜I的一端上方層疊連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7，上方粘接單面膠6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。按以下步驟進行檢測:1)抽取的病人血清、血漿或全血等待檢樣本，如低溫保存樣本需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應。3)判讀，將所述膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳)有限公司)中判定結(jié)果。
[0034]【實施例3】用本發(fā)明所述膠體金試紙盒快速定量檢測半乳糖凝集素-3。
[0035]取本發(fā)明優(yōu)選的一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒，如圖1和圖
2所示，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7，上方粘接單面膠6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。所述膠體金試紙還包括一外殼10，所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜I上的檢測線8和兩條控制線9、以及吸水墊4。按以下步驟進行檢測:1)抽取的病人血清、血漿或全血等待檢樣本，如低溫保存樣本 需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應。3)判讀，將所述膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳)有限公司)中判定結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，包括支撐墊片(5)，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜(1)，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊(4)，另一端連接偶合物墊片(2)，所述偶合物墊片連接樣本墊片(3)，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件(7)，上方設(shè)有第二固定部件(6)，其特征在于，所述硝酸纖維素膜(I)中間部位檢測線(8)包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線(9)，所述偶合物墊片(2)上涂布有金標記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
2.如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述控制線(9)包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。
3.如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述第一固定部件(7)為雙面膠，第二固定部件(6)為單面膠。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的膠體金試紙，其特征在于，所述膠體金試紙外還包括一外殼(10),所述外殼包裹所述膠體金試紙外,露出樣本墊片(3)、硝酸纖維素膜(I)上的檢測線(8)和兩條控制線(9)、以及吸水墊(4)。
5.如權(quán)利要求4所述的膠體金試紙，其特征在于，所述兩條控制線(9)與檢測線(8)為平行設(shè)置。
6.如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙在檢測半乳糖凝集素-3中的應用。
7.一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的方法，其特征在于，包括使用權(quán)利要求1所述膠體金試紙來快速定量檢測半乳糖凝集素-3的步驟。
【文檔編號】G01N33/68GK103869079SQ201410080580
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】劉紅劍, 趙俊平, 吳偉云, 夏宣喜 申請人:瑞萊生物工程（深圳）有限公司