Trop-2作為對基于cd9、akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分子的抑制劑的抗腫瘤療法的應(yīng)...的制作方法【專利摘要】本發(fā)明包含診斷和治療癌癥的方法，其特征在于基于以下事實(shí)，腫瘤中Trop-2的水平與相應(yīng)正常組織中Trop-2的水平相比的增加構(gòu)成了生物標(biāo)記，其可以預(yù)測所述腫瘤對于用針對Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的藥物的抗癌療法的應(yīng)答，所述藥物包括但不限于抑制CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分子的藥物。更具體來說，發(fā)明涉及生物標(biāo)記Trop-2在篩選新化合物中的用途，并且在臨床環(huán)境下用作靶向Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分子的抗癌藥物的用途的指示，所述抗癌藥物包括但不限于抑制CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分子的藥物?！緦＠f明】TR0P-2作為對基于CD9、AKT和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分子的抑制劑的抗腫瘤療法的應(yīng)答的預(yù)測性標(biāo)記的用途【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及在帶有過度表達(dá)Trop-2的腫瘤的患者中進(jìn)行診斷和抗癌治療，其借助于針對Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的藥物來進(jìn)行，所述藥物包括但不限于抑制⑶9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分子的藥物。Trop-2過度表達(dá)還可以開發(fā)用于體外和體內(nèi)篩選新化合物的抗癌活性?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]最新一代的靶向抗癌療法利用酪氨酸激酶抑制劑（TKI)和/或單克隆抗體（mAb)，其是具有顯性致癌激酶和/或生長因子受體作為其靶標(biāo)。然而，與這些藥劑相關(guān)的臨床獲益一般來說限制于經(jīng)治療的患者的子集，在許多情況下通過腫瘤中的特定分子變化（突變、擴(kuò)增/缺失、表達(dá)的增加/減少）進(jìn)行界定。這個(gè)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)突出了腫瘤基因型/表型作為的決定性因素的可能重要性，所述決定性因素是對特異性治療的靈敏度的決定性因素和患者在治療之前基于用作生物標(biāo)記的分子變化的所得分層的決定性因素。這些生物標(biāo)記經(jīng)研究以便用作"預(yù)測性標(biāo)記"，即，能夠預(yù)測對靶向療法的應(yīng)答或耐受，其目的在于通過有效個(gè)性化治療來優(yōu)化臨床結(jié)果。[0003]預(yù)測性生物標(biāo)記當(dāng)前在臨床中用作選擇極少的靶向治療的指南。實(shí)例包括雌激素（ER)和孕酮的受體，其用以選擇患有乳腺癌的患者，以便用激素療法治療；HER-2的擴(kuò)增，以便用曲妥珠單抗治療；慢性骨髓性白血病中的BCR-ABL的易位和胃腸道間質(zhì)瘤中的c-kit的突變，以便用伊馬替尼治療；肺癌中的EGFR突變，以便用吉非替尼/埃羅替尼治療；結(jié)腸直腸癌中的KRAS突變，以便用西妥昔單抗（Cetuximab)治療。[0004]"富集生物標(biāo)記"，即，可以預(yù)測哪些患者子組可能對治療進(jìn)行應(yīng)答的標(biāo)記，其是至關(guān)重要的需要。實(shí)際上，其可以用以使實(shí)驗(yàn)聚焦于可以適用的子組，增加新藥物的成功的可能性和試驗(yàn)的有效性。HER2/Herceptest/曲妥珠單抗的組合提供了祀向療法的診斷工具的成功使用的一個(gè)實(shí)例。在其它情況下，盡管不是許多情況下，預(yù)測性并且富集的標(biāo)記支持了這個(gè)策略的應(yīng)用。[0005]然而，在大多數(shù)情況下，當(dāng)前可用的生物標(biāo)記是指治療靶標(biāo)本身或主要信號(hào)傳導(dǎo)通路的個(gè)別組分，認(rèn)為靶標(biāo)通過其起作用。這些策略的共同限制在于將單一信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變視為造成腫瘤生長的唯一改變。在腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)上，實(shí)際上，存在多階段進(jìn)展過程。多重證據(jù)，包括從對整個(gè)外顯子組測序獲得的數(shù)據(jù)和腫瘤的基因表達(dá)譜的微陣列分析，都揭示了極其大量的不同突變和腫瘤中的不同信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的相互作用的巨大復(fù)雜性。這些研究將腫瘤分為分化的臨床上相關(guān)的子組，并且突出了在命中多種信號(hào)傳導(dǎo)通路或最終共同通路以便獲得有效治療的重要性。[0006]經(jīng)典地參與腫瘤發(fā)生的基因變化涉及致癌基因，例如PI3K、Ras、BCR-ABL、EGFR、HER-2("致癌基因成癮性"），并且對于觸發(fā)和維持致癌狀況是必需的，并且因此是療法的邏輯靶標(biāo)。然而，致瘤狀態(tài)還取決于多種參與正常細(xì)胞功能的基因和通路，其呈現(xiàn)改變的調(diào)節(jié)，但其本質(zhì)上并不致癌（非致癌基因成癮性）。這種成癮性可以提供在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的差異性毒性的許多藥物靶標(biāo)：其中，一些靶標(biāo)正在臨床前模型上進(jìn)行研究。這些靶標(biāo)中僅有一些靶標(biāo)正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測試或已經(jīng)在治療中使用（VEGF，例如用于用貝伐單抗或索拉非尼/舒尼替尼的治療）。[0007]因此，為了改進(jìn)現(xiàn)有療法的有效性并且鑒別新治療靶標(biāo)，經(jīng)典致癌基因的分析必須伴隨有正常信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究。然而，這些"正常"標(biāo)記雖然呈現(xiàn)為支持腫瘤發(fā)生的重要因子，但仍極少用于預(yù)測人類對于療法的應(yīng)答。[0008]Trop-2(AC:P09758)是一種能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)鈣增加信號(hào)的跨膜糖蛋白[日帕尼(Ripani)，1998#648]，參與上皮組織中的細(xì)胞間粘附，并且驅(qū)動(dòng)了誘導(dǎo)腫瘤生長的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（格拉，特雷羅托拉等人2013)(61161'四，1'代1'〇1:〇136七31.2013)。1'1'(^-2的結(jié)構(gòu)特征不同于粘附分子的四個(gè)經(jīng)典家族（即整合素、鈣粘素、選擇素和Ig-CAM)的結(jié)構(gòu)特征。Trop-2的胞外域含有富含半胱氨酸的球狀部分，其具有EGF樣域（GA733I型域（莊(Chong)和施派歇爾（Speicher)2001)(ChongandSpeicher2001))和甲狀腺球蛋白域(林嫩巴赫（Linnenbach),森（Seng)等人1993;福爾納羅（Fornaro),戴爾阿爾奇普雷特(Dell'Arciprete)等人1995;艾爾斯維迪（ElSewedy),福爾納羅等人1998)(LinnenbachSengetal1993;Fornaro,Dell'Arcipreteetal1995；E1SewedyFornaroetal1998)，其對于同源多聚體的形成是必需的（巴爾扎爾（Balzar),布里亞爾-德布魯因(Briaire-deBruijn)等人2001)(Balzar，Briaire-deBruijnetal2001)。不具有半胱氨酸的區(qū)（"莖干"）將Trop-2的球狀部分連接到疏水性跨膜螺旋。Trop-2的胞內(nèi)部分由缺乏酶促活性、含有磷酸肌醇結(jié)合HIKE的26個(gè)aa的尾區(qū)組成（艾爾斯維迪，福爾納羅等人1998;奇卡雷利（Ciccarelli),阿恰里托（Acciarito)等人2000)(ElSewedy，F(xiàn)ornaroetal.1998;Ciccarelli，Acciaritoetal.2000)。HIKE發(fā)現(xiàn)于信號(hào)-轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中并且可以充當(dāng)效應(yīng)子/調(diào)節(jié)分子/例如G蛋白、PKC、鈣對接位點(diǎn)（阿爾貝蒂（Alberti)1999)(Alberti1999)。HIKE還包括PKC磷酸化位點(diǎn)（S303)(巴蘇（Basu)，戈登伯格（Goldenberg)等人1995)(Basu,Goldenbergetal.1995)〇[0009]Trop-2表達(dá)已經(jīng)與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械哪[瘤生長相關(guān)聯(lián)（克萊因（Klein)，哈特曼(Hartmann)等人1990;巴蘇，戈登伯格等人1995;王（Wang),戴（Day)等人2008;古巴斯（Cubas),張（Zhang)等人2010;戈德斯坦（Goldstein),斯托亞諾娃（Stoyanova)等人2010)(Klein,Hartmannetal.1990;Basu,Goldenbergetal.1995;Wang,Dayetal.2008;Cubas,Zhangetal.2010;Goldstein,Stoyanovaetal.2010)。在人類腫瘤中，Trop-2的過度表達(dá)是胰腺、胃、口腔、卵巢、肺和結(jié)腸直腸癌的腫瘤的消極預(yù)兆因子（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利（Cantanelli)等人2013)(Trerotola,Cantanellietal.2013)。此外，Trop-2還是前列腺癌中的祖細(xì)胞的標(biāo)記（戈德斯坦，斯托亞諾娃等人2010;特雷羅托拉，拉索（Rathore)等人2010)(Goldstein,Stoyanovaetal.2010;Trerotola,Rathoreetal.2010)。[0010]本發(fā)明的作者先前已經(jīng)展現(xiàn)，Trop-2在人類的大多數(shù)腫瘤和腫瘤細(xì)胞系以高水平表達(dá)（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)(Trerotola,Cantanellietal.2013)。具體來說，作者展現(xiàn)，Trop-2即使當(dāng)與已經(jīng)表達(dá)其的起源組織相比時(shí)在癌細(xì)胞中也過度表達(dá)（S.阿爾貝蒂"抗Trop-2單克隆抗體和其在治療和診斷腫瘤中的用途"，一PCT/IT2009/000035)，表明增加的表達(dá)向腫瘤細(xì)胞賦予選擇性優(yōu)勢（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)(Trerotola，Cantanellietal.2013)〇[0011]本發(fā)明的作者先前已經(jīng)展現(xiàn)了Trop-2的刺激對于體外和體內(nèi)腫瘤發(fā)展的功能。Trop-2的過度表達(dá)刺激了永生化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生長，使細(xì)胞周期的S期中細(xì)胞的比例增加。另一方面，針對Trop-2的小干擾（si)RNA的使用消除了表達(dá)Trop-2的乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖。類似結(jié)果也已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤中獲得：Trop-2的表達(dá)顯著增加腫瘤生長，并且這個(gè)生長與表達(dá)水平直接成正比。[0012]Trop-2的細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)的完整性是必需的以便具有生長刺激：整個(gè)尾區(qū)或HIKE域的缺失、絲氨酸303(由daPKCa磷酸化）和322的點(diǎn)突變、四個(gè)谷氨酸殘基的置換，所述置換是其沿著a_螺旋一側(cè)的整個(gè)長度與賴氨酸正殘基交換負(fù)電荷，都致使Trop-2刺激活性損失（圖1)。[0013]體外和體內(nèi)細(xì)胞生長的刺激已經(jīng)通過正常Trop-2的過度表達(dá)來獲得。與這個(gè)一致，本發(fā)明的作者尚未鑒別出腫瘤中的TR0P2基因的突變或結(jié)構(gòu)變化，所述突變或結(jié)構(gòu)變化是在編碼區(qū)中和5'和3'非翻譯區(qū)（UTR)中或者接近于啟動(dòng)子的區(qū)中（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)(Trerotola，Cantanellietal.2013)。[0014]這些結(jié)果表明，在不存在突變下，Trop-2表達(dá)增加對于刺激癌細(xì)胞生長是必需并且充足的（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)(Trerotola，Cantanellietal.2013)。因此，Trop-2是一種"非致癌基因"，腫瘤細(xì)胞的生長對于其過度表達(dá)上癮（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)。這種生長刺激與組織型（癌瘤、肉瘤）無關(guān)并且與物種（人類、鼠類）無關(guān)，這表明Trop-2作用的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（格拉，特雷羅托拉等人2013)(Guerra,Trerotolaetal.2013)是高度保守的（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)(S.阿爾貝蒂"抗Trop-2單克隆抗體和其在治療和診斷腫瘤中的用途"，PCT/IT2009/000035)。[0015]這個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)在將由作者進(jìn)一步定義，以便鑒別表達(dá)Trop-2的腫瘤中特異地并且差異性地活化的效應(yīng)分子，其用作Trop-2依賴性抗癌療法的靶標(biāo)。[0016]作者通過電子顯微鏡進(jìn)行的分析顯示，Trop-2定位于細(xì)胞的頂端表面處的大絨毛的聚集體中、延伸于細(xì)胞之間的絨毛中和細(xì)胞膜的分散區(qū)中（圖2)。進(jìn)一步研究已經(jīng)將這些聚集體鑒別為四跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)，即細(xì)胞膜中的可以引導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用的分子網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)平臺(tái)。通過共焦顯微鏡對Trop-2與這些大分子平臺(tái)的特異性標(biāo)記之間的相互作用的系統(tǒng)分析（巴雷羅（Barreiro),扎邁（Zamai)等人2008)(Barreiro，Zamaietal.2008)展現(xiàn)Trop-2與四跨膜蛋白和與其相關(guān)的分子（⑶9)在完整細(xì)胞（圖3a)中和在"細(xì)胞足跡"中的共定位（哈科莫里（Hakomori)2002)(Hakomori2002)(圖3c)。通過共帽化和共免疫沉淀的技術(shù)還展現(xiàn)，在人類和鼠類細(xì)胞中在Trop-2與⑶9、⑶81、⑶82、⑶151之間存在直接物理相互作用（圖3b，e)。另一方面，Trop-2不與小窩蛋白共定位，所述小窩蛋白是脂質(zhì)筏的特征標(biāo)記（圖3a-c)。[0017]已知，四跨膜蛋白與其搭配物的結(jié)合是膽固醇依賴性的（哈科莫里2002)(Hakomori2002):Trop-2是四跨膜蛋白平臺(tái)的整體組分的事實(shí)的進(jìn)一步證實(shí)由甲基-￠-環(huán)糊精和毛地黃皂苷的能力提供，其分別能夠從細(xì)胞膜去除膽固醇并且使其沉淀(哈科莫里2〇〇2,查林（Charrin)，2〇〇3#17269)(Hakomori20〇2,Charrin,2〇〇3#17269)、從而誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Trop-2的釋放和Trop-2從BRIJ中的細(xì)胞膜的溶解物的沉淀（勒納烏爾(LeNaour),安德烈（Andre)等人2〇〇6)(LeNaour,Andreetal.2〇〇6)(圖3f)。[0018]四跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)向活化脂質(zhì)、蛋白激酶和胞內(nèi)效應(yīng)子的不同細(xì)胞表面受體提供了支持（赫姆勒（Hemler)2003;勒納烏爾，安德烈等人2006)(Hemler2003;LeNaour,Andreetal.2006)。因此，本發(fā)明的作者已經(jīng)展示，Trop-2能夠調(diào)節(jié)跨膜酪氨酸激酶受體（PDGFR、Met、Ret、VEGFR)、酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶、磷酸酶、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)分子的表達(dá)（格拉，特雷羅托拉等人2013)(Guerra,Trerotolaetal.2013)(S.阿爾貝蒂"抗Trop-2單克隆抗體和其在治療和診斷腫瘤中的用途"，PCT/IT2009/000035)。這些結(jié)果此處通過新蛋白質(zhì)組分析而擴(kuò)展（圖4)。生物信息學(xué)工具用于蛋白質(zhì)間接觸的統(tǒng)計(jì)分析（明格斯（Minguez),戈茨（Gotz)等人2009)(Minguez,Gotzetal.2009)和通路分析（IngenuityPathwaysAnalysis軟件）的應(yīng)用使得我們可定義Trop-2的主要信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（格拉，特雷羅托拉等人2013)(Guerra,Trerotolaetal.2013)(圖5)。由Trop-2驅(qū)動(dòng)的分子包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子（跨膜受體、細(xì)胞質(zhì)酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶、磷酸酶）、蛋白質(zhì)合成、折疊和降解的組分、參與核酸合成和碳水化合物代謝的酶。由Trop-2調(diào)節(jié)的所有蛋白質(zhì)中超過三分之二（114/165)(圖4)通過蛋白質(zhì)間的接觸而連接（圖5a)。蛋白質(zhì)間接觸的這個(gè)網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)被鑒別為癌癥生長的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路（圖5b)，其包括PKC、Akt/Gsk30/S6K和ERK通路以及效應(yīng)子NF-kB、Jun、CREB1、STAT、Rb和p53(格拉，特雷羅托拉等人2013)(Guerra,Trerotolaetal.2013)〇[0019]因此，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)使本發(fā)明的作者能夠展現(xiàn)PKC是Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵介體。Trop-2-共調(diào)節(jié)7種PKC底物和PKC的55種底物/調(diào)節(jié)分子（圖4和5)。PKCa展示在表達(dá)Trop-2的細(xì)胞中的其活化位點(diǎn)S657的磷酸化的最高增加（圖4a)，這表明其活化是Trop-2依賴性的。這與ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化以及與由Trop-2誘導(dǎo)的PP2A(參與使PKCa失活的磷酸酶）和TOK1(在其活化位點(diǎn)中使PKCa磷酸化）的調(diào)節(jié)是一致。PKCa經(jīng)常過度表達(dá)于腫瘤中，并且引導(dǎo)參與癌癥的信號(hào)傳導(dǎo)過程。PKCa還是⑶9的主要效應(yīng)子之一（張，邦特拉杰（Bontrager)等人2001)(Zhang,Bontrageretal.2001)，并且募集到四跨膜蛋白復(fù)合物（張，邦特拉杰等人2001;羅斯（1?〇886)，林奇(1；[11011)等人2010)(Zhang,Bontrageretal.2001;Rosse，Linchetal.2010)，在此通過二醜基甘油（DAG)活化（帕雷克（Parekh),齊格勒（Ziegler)等人2000)(Parekh,Ziegleretal.2000)。[0020]基于這些指示，本發(fā)明的作者已經(jīng)展示，⑶9微結(jié)構(gòu)域充當(dāng)PKCa與Trop-2之間的連接體的功能：PKCa與⑶81和⑶151四跨膜蛋白共免疫沉淀并且與⑶9更大程度地共免疫沉淀（圖3e)。以類似方式，Trop-2與⑶9、⑶81、⑶82和⑶151共免疫沉淀（圖3e)。此外，CD9、Trop-2和PKCa共定位于不同的膜子域中并且這種共定位是磷酸化依賴性的(圖3c，d)，因此證實(shí)Trop-2和PKCa都通過與⑶9的相互作用而募集到四跨膜蛋白微結(jié)構(gòu)域。[0021]這個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析隨后已經(jīng)使得作者認(rèn)定Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路為細(xì)胞生長由Trop-2的刺激中的關(guān)鍵通路（圖6)，其是通過GSK3和S6K臂，而不是mTOR組的。Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)子。AktT308和S473活化位點(diǎn)是磷酸化的靶標(biāo)。rictor-mTOR復(fù)合物與ILK(庫爾（Koul),沈（Shen)等人2005)(Koul，Shenetal.2005)一起使S473上的Akt磷酸化（薩爾巴索夫（Sarbassov),古爾?。℅uertin)等人2005)(Sarbassov，Guertinetal.2005)，但在T308磷酸化中和在GSK3和S6K效應(yīng)子的活化中不具有作用（雅辛托（Jacinto),法奇內(nèi)提（Facchinetti)等人2006)(Jacinto,Facchinettietal.2006).。與這個(gè)一致，Trop-2誘導(dǎo)Akt_T308的磷酸化，但不誘導(dǎo)Akt_S473的磷酸化（圖6b)，并且調(diào)節(jié)GSK3和S6K的磷酸化（圖4a)，但不調(diào)節(jié)mTOR的磷酸化。先前由本發(fā)明的作者在蛋白質(zhì)組芯片上所展現(xiàn)的ILK的下調(diào)以及Akt-S473磷酸化通過Trop-2的減少（因PMA進(jìn)一步增加）（圖6b)，與由PKC誘導(dǎo)的ILK和Akt-S473磷酸化的下調(diào)一致（溫(Wen)，黃（Huang)等人2003)(Wen,Huangetal.2003)?。另一方面，Trop-2誘導(dǎo)Akt_T308磷酸化（圖6b)，這也與先前在蛋白質(zhì)組芯片上所展現(xiàn)的PP2A催化和調(diào)節(jié)亞單位的化學(xué)計(jì)量減少一致（PPA是對T308作用的Ca2+依賴性磷酸酶）（弗雷利（Freeley)，帕克（Park)等人2007)(Freeley,Parketal.2007)，而非與PDK1的誘導(dǎo)一致（圖4a)。與PKCa非依賴性機(jī)制一致，PMA對Akt-T308磷酸化水平不具有作用（圖6b)。[0022]Trop-2與四跨膜蛋白膜復(fù)合物并且具體來說與⑶9的相互作用活化了具有Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路作為關(guān)鍵組分的復(fù)合物下游信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，并且刺激細(xì)胞增殖。[0023]作者隨后研究在表達(dá)Trop-2的增殖細(xì)胞中⑶9和Akt的選擇性抑制的作用。⑶9通過siRNA所介導(dǎo)的下調(diào)（圖7a，b)導(dǎo)致表達(dá)Trop-2的MTE4-14細(xì)胞的增殖顯著減少，但對于Trop-2陰性細(xì)胞基本上不具有影響（圖7d)。這個(gè)減少與由Trop-2沉默所造成的減少相當(dāng)（圖7d)，并且與Trop-2在癌細(xì)胞生長中的基本作用一致。此外，考慮到CD9的表達(dá)不受Trop-2影響（圖7c)，這些結(jié)果還表明⑶9對于腫瘤生長由Trop-2的刺激是必需的，但另外對于基線細(xì)胞生長是非活躍的。通過沉默或通過特異性藥物對Akt抑制以劑量依賴性方式誘導(dǎo)了表達(dá)Trop-2的細(xì)胞的細(xì)胞增殖的顯著減少，而其對于對照細(xì)胞不具有作用（圖8)。與這個(gè)一致，動(dòng)物模型中皮下注射的表達(dá)Trop-2的腫瘤在用抑制Akt活性的特異性藥物治療之后展示出生長的顯著減少（圖9)。因此，Akt在介導(dǎo)Trop-2依賴性生長刺激方面具有重要功能作用，并且這種分子的藥理學(xué)抑制在臨床前模型中具有抗癌治療作用?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0024]本發(fā)明的作者已經(jīng)鑒別了新穎的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其刺激腫瘤生長并且通過與⑶9的相互作用和Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化由Trop-2特異性地活化。Trop-2過度表達(dá)指示對于Akt和⑶9抑制劑的靈敏度，所述抑制劑能夠選擇性地終止表達(dá)Trop-2的細(xì)胞的生長。這些結(jié)果為個(gè)人化抗癌療法的初始模式鋪設(shè)了道路。[0025]因此，本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】是一種體外預(yù)測抗癌療法的結(jié)果的方法，所述的抗癌療法是用抑制Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的活性的藥物，其中所述組分選自由以下物質(zhì)組成的群組：CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子，所述方法包含以下步驟或由以下步驟組成：測定生物樣品中Trop-2蛋白質(zhì)或相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平，當(dāng)檢測到Trop-2蛋白質(zhì)或相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平與相應(yīng)正常組織中的水平相比增加時(shí)，有效結(jié)果出現(xiàn)。[0026]如通過本發(fā)明的作者鑒別的是，四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子屬于Trop-2網(wǎng)絡(luò)，并且還是四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的一部分的分子，并且具體來說是表皮生長因子受體（EGFR)、酪氨酸蛋白激酶Met、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶c-RAF、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、小GTP結(jié)合蛋白⑶C42、酪氨酸蛋白激酶JAK2、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位a(PKAC-a)、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11型（SHP2)、胰島素受體底物1(IRS1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK1、絲裂原活化蛋白激酶8(JNK)。[0027]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，生物標(biāo)記Trop-2的陽性意指腫瘤中的Trop_2mRNA或蛋白質(zhì)的增加與相同受試者的相應(yīng)正常組織相比等于或大于10%。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述陽性用以選擇出于治療性目的（包括臨床試驗(yàn)）使用抗癌藥物的患者，所述藥物針對Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分，包括但不限于⑶9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子。因此，本發(fā)明教示了一種新穎的生物標(biāo)記，所述標(biāo)記特征在于Trop-2的過度表達(dá)。這是對特異性療法的應(yīng)答的預(yù)測性標(biāo)記，并且是可以鑒別潛在響應(yīng)性的患者子組的富集標(biāo)記，并且可以在針對由Trop-2驅(qū)動(dòng)的分子（尤其但不限于CD9和Akt)的藥物的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行募集。所述生物標(biāo)記可以單獨(dú)或與其它生物標(biāo)記組合使用。[0028]在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供一種體外篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥物的方法，其中所述藥物針對Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分，其中所述組分選自由以下物質(zhì)組成的群組：CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子，S卩，如由本發(fā)明的作者鑒別為屬于Trop-2網(wǎng)絡(luò)并且還是四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的一部分的分子，并且具體來說是表皮生長因子受體（EGFR)、酪氨酸蛋白激酶Met、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶c-RAF、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、小GTP結(jié)合蛋白⑶C42、酪氨酸蛋白激酶JAK2、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位a(PKAC-a)、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11型（SHP2)、胰島素受體底物1(IRS1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK1、絲裂原活化蛋白激酶8(JNK)。這種方法包含以下步驟：將無菌生理鹽水溶液中的待測試化合物給予到表達(dá)Trop-2和不表達(dá)Trop-2的細(xì)胞；將單獨(dú)的無菌生理鹽水溶液平行給予到表達(dá)Trop-2和不表達(dá)Trop-2的細(xì)胞。與化合物接觸的不表達(dá)細(xì)胞用于控制化合物本身的作用的特異性，而與單獨(dú)的無菌生理鹽水溶液接觸的表達(dá)和不表達(dá)Trop-2的細(xì)胞用于控制化合物本身的活性。隨后，測量化合物的生物活性，即，表達(dá)Trop-2的細(xì)胞的增殖，將其與經(jīng)歷治療的不表達(dá)Trop-2的細(xì)胞以及與不經(jīng)歷治療（即與單獨(dú)的生理鹽水溶液接觸）的表達(dá)和不表達(dá)Trop-2的細(xì)胞相比。最終，選擇在表達(dá)Trop-2并且經(jīng)歷治療的細(xì)胞中能夠減少細(xì)胞增殖至少10%的化合物，與不表達(dá)Trop-2并且經(jīng)歷治療的細(xì)胞和不經(jīng)歷治療的細(xì)胞的增殖相比。[0029]本發(fā)明還提供一種體內(nèi)篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥物的方法，其中所述藥物是針對Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分，包括但不限于CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子。這種方法包含以下步驟：將無菌生理鹽水溶液中的待測試化合物給予到臨床前模型和臨床模型中的對于生物標(biāo)記Trop-2呈陽性（即過度表達(dá)）或陰性（即不過度表達(dá)）的腫瘤；將單獨(dú)的無菌生理鹽水溶液平行給予到過度表達(dá)或不過度表達(dá)Trop-2的腫瘤。與化合物接觸的非過度表達(dá)腫瘤用于控制化合物本身的作用的特異性，而與單獨(dú)的無菌生理鹽水溶液接觸的過度表達(dá)或不過度表達(dá)Trop-2的腫瘤用于控制化合物本身的活性。隨后，測量化合物的生物活性，即過度表達(dá)Trop-2的腫瘤的生長，將其與經(jīng)歷治療的不過度表達(dá)Trop-2的腫瘤以及與不經(jīng)歷治療（即與單獨(dú)的生理鹽水溶液接觸）的過度表達(dá)或不過度表達(dá)Trop-2的腫瘤相比。最終，選擇在過度表達(dá)Trop-2并且經(jīng)歷治療的腫瘤中能夠減少腫瘤生長至少10%的化合物，其是與經(jīng)治療并且未經(jīng)治療的對照的腫瘤生長相比。[0030]另外，本發(fā)明涉及一種抑制Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的活性的化合物，其中所述組分選自由以下物質(zhì)組成的群組：CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子，其用于治療Trop-2蛋白質(zhì)或相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平高于正常組織的腫瘤。如上所述，四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子是如由本發(fā)明的作者鑒別為屬于Trop-2網(wǎng)絡(luò)并且還是四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的一部分的分子，并且具體來說是表皮生長因子受體（EGFR)、酪氨酸蛋白激酶Met、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶c-RAF、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、小GTP結(jié)合蛋白⑶C42、酪氨酸蛋白激酶JAK2、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位a(PKAC-a)、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11型（SHP2)、胰島素受體底物1(IRS1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK1、絲裂原活化蛋白激酶8(JNK)。[0031]一些已經(jīng)已知的抑制性分子是：MK-2206、A6730、哌立福新、GSK690693、GSK2110183、GDC-0068、AT7867、ARQ092、AZD5363、A-674563、PHT-427、PF-04691502、SureCN1078972、842148-40-7、AClNX3D3、MLS002702033、SureCN10005574、SureCN1559590、SureCN570829、SH-5、SH-6、和厚樸酚、米替福新、磷酸曲西立濱（Akt抑制劑）、K00598a、DAPH2、SureCN238877(EGFR抑制劑）、SureCN4269573(EGFR、c_RAF、Src的抑制劑）、達(dá)沙替尼（Src抑制劑）、SureCN1518805、1，9-吡唑蒽酮、AS-601245、氨基吡啶衍生物2(JNK抑制劑）。[0032]任選地，以上化合物可以與其它療法組合使用，所述療法例如化學(xué)療法、烷化劑(例如二氯甲二乙胺苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、亞硝基脲、白消安、達(dá)卡巴嗪（DTIC)、替莫唑胺、噻替派和六甲蜜胺）、抗代謝劑（例如5-氟尿嘧啶（5-FU)、6-巰基嘌呤（6-MP)、卡培他濱、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、噴司他汀、硫鳥嘌呤）、抗腫瘤抗生素（例如蒽環(huán)霉素、放射菌素-D、博萊霉素、絲裂霉素-C)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（例如拓?fù)涮婵怠⒁亮⑻婵?、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌）、有絲分裂抑制劑（例如太平洋紫杉醇、多西他賽、伊沙匹隆、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、雌莫司?。?、皮質(zhì)類固醇（例如強(qiáng)的松、甲基潑尼松龍、地塞米松）、分化劑（例如類視黃素、維甲酸/ATRA、貝薩羅汀和三氧化二砷）、激素療法、靶向激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑硼替佐米。[0033]根據(jù)本發(fā)明使用的根據(jù)本發(fā)明的化合物可以選自由以下物質(zhì)組成的群組：寡核苷酸；充當(dāng)"顯性陰性"分子的對應(yīng)于CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子的工程化分子；單克隆抗體；藥理學(xué)抑制劑；小分子化學(xué)化合物；或其組合。[0034]如上所述，可以獲得以上分子的活性的抑制，作為一非限制性實(shí)例，借助于充當(dāng)"顯性陰性物"的相應(yīng)工程化分子，即類似于正常分子但缺乏生物活性的分子；這些顯性陰性分子置換了正常分子并且消除了其在細(xì)胞過程中的功能。生物活性的抑制還可以通過用與正常分子的催化和/或調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合并且抑制其活性的特異性單克隆抗體獲得。生物活性的抑制還可以用藥理學(xué)抑制劑獲得。主要實(shí)例之一是MK-2206和A6730，Akt的藥理學(xué)抑制劑，對于其來說，Trop-2表達(dá)構(gòu)成了根據(jù)本發(fā)明的抗癌用途的指示。[0035]本發(fā)明還涉及能夠抑制患者中的腫瘤生長的寡核苷酸（RNA或DNA，雙或單鏈），這種抑制是通過抑制Trop-2的信號(hào)傳導(dǎo)通路的組分的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這些腫瘤對于生物標(biāo)記Trop-2是陽性的，所述組分包括但不限于⑶9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子。作為一個(gè)實(shí)例，一種能夠抑制⑶9表達(dá)的寡核苷酸包含在靶向⑶9的沉默的RNA(siRNA)內(nèi)，其中正義鏈中的靶標(biāo)序列含于⑶9的mRNA(基因庫（GenBank)登記號(hào)：NM_007657.3)中，包括但不限于以下序列：[0036]正義5，GGTAGCAAGTGCATCAAAT3,（SEQIDN0:1)，[0037]反義5,ATTTGATGCACTTGCTACC3,（SEQIDN0:2)。[0038]這些沉默的靶標(biāo)序列還可以與其它序列融合以便獲得當(dāng)插入到適當(dāng)載體中時(shí)轉(zhuǎn)錄到發(fā)夾RNA的寡核苷酸，其具有以下序列作為一個(gè)實(shí)例，其中正義和反義定向中的靶標(biāo)序列加下劃線：[0039]正向5,GATCCCCGGTAGCAAGTGCATCAAATTTCAAGAGAATTTGATGCACTTGCTACCTTTTTGGAAA3'(SEQIDNO:3),[0040]反向5，AGCTTTTCCAAAAAGGTAGCAAGTGCATCAAATTCTCTTGAAATTTGATGCACTTGCTACCGGG3'(SEQIDN0:4)〇[0041]作為一個(gè)實(shí)例，一種抑制AKT表達(dá)的方法在于靶向AKT的siRNA，其中正義鏈中的革巴標(biāo)序列含于AKT的mRNA(NM_009652.3)中，包括但不限于以下序列：[0042]正義5'GCACCTTTATTGGCTACAA3'（SEQIDN0:5)，[0043]反義5'ITGTAGCCAATAAAGGTGC3'（SEQIDN0:6)，[0044]和轉(zhuǎn)錄到發(fā)夾RNA的相應(yīng)寡核苷酸：[0045]正向5,GATCCCCGCACCTTTATTGGCTACAATTCAAGAGATTGTAGCCAATAAAGGTGCTTTTTC3'（SEQIDNO:7),[0046]反向5'TCGAGAAAAAGCACCTTTATTGGCTACAATCTCTTGAATTGTAGCCAATAAAGGTGCGGG3'（SEQIDNO:8);[0047]或[0048]正義5，GGAAGGTGATTCTGGTGAA3,（SEQIDN0:9)，[0049]反義5'ITCACCAGAATCACCTTCC3'（SEQIDN0:10)，[0050]和轉(zhuǎn)錄到發(fā)夾RNA的相應(yīng)寡核苷酸：[0051]正向5,GATCCCCGGAAGGTGATTCTGGTGAATTCAAGAGATTCACCAGAATCACCTTCCTTTTTC3'（SEQIDNO:11)，[0052]反向5'TCGAGAAAAAGGAAGGTGATTCTGGTGAATCTCTTGAATTCACCAGAATCACCTTCCGGG3'（SEQIDNO:12)。[0053]根據(jù)本發(fā)明，序列SEQIDNO:1到SEQIDNO:12可以作為單鏈寡核苷酸或雙鏈寡核苷酸的形式使用。所述序列可以插入克隆載體中。[0054]工業(yè)應(yīng)用和實(shí)施方式[0055]本發(fā)明可以在臨床上用于診斷過度表達(dá)Trop-2的腫瘤并且用于治愈帶有所述腫瘤的患者，其中Trop-2過度表達(dá)構(gòu)成了生物標(biāo)記，其引導(dǎo)對于靶向Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的化合物和/或治療的治療選擇，所述組分包括但不限于CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子。本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用在于篩選用于癌癥療法的新藥物和療法，其是使用過度表達(dá)Trop-2并且體外和體內(nèi)對針對屬于Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子中所鑒別的靶標(biāo)的物質(zhì)和/或治療靈敏的細(xì)胞和腫瘤，所述分子具體來說是CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子。[0056]腫瘤細(xì)胞中與相應(yīng)對照細(xì)胞相比的TR0P2mRNA增加可以在培養(yǎng)物中的細(xì)胞和由新鮮或冷凍細(xì)胞和組織組成的活體組織切片中進(jìn)行定量。mRNA可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過應(yīng)用可用技術(shù)來提取和純化。用于提取和純化的試劑盒和儀器可以從商業(yè)來源獲取。如本發(fā)明中所述，TR0P2mRNA通過cDNA合成和PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR的檢測和定量可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來進(jìn)行。用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR的試劑和儀器是市場上可獲得的。[0057]腫瘤細(xì)胞中與相應(yīng)對照細(xì)胞相比的Trop-2蛋白質(zhì)增加可以借助于免疫組織化學(xué)、ELISA分析、蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting)或本領(lǐng)域中已知的其它等效技術(shù)在培養(yǎng)物中的細(xì)胞和由新鮮、冷凍或福爾馬林固定的細(xì)胞和組織組成的活體組織切片中進(jìn)行定量。用于執(zhí)行這些測試和測量的Trop-2反應(yīng)性抗體、試劑盒和設(shè)備是市場上可獲得的。[0058]永生化鼠類細(xì)胞系MTE4_14(納凱，勒拍桑等人1989)(Naquet,Lepesantetal.1989)可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Trop-2的表達(dá)載體和用空載載體轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞可以體外生長并且用于篩選靶向于Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的化合物，所述化合物包括CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子的抑制劑。細(xì)胞增殖可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)通過直接計(jì)數(shù)或染色用于細(xì)胞成分或代謝分析來測量。[0059]待用于體內(nèi)篩選直接針對Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組分的化合物的臨床前模型由根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行皮下注射有過度表達(dá)或不過度表達(dá)Trop-2的細(xì)胞（異種移植物）的免疫功能不全小鼠和類似模型組成，所述化合物包括CD9、Akt和四跨膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的分子的抑制劑。[0060]本發(fā)明現(xiàn)將具體參考附后的附圖的詳細(xì)實(shí)施例和附圖，根據(jù)但不限于其一些優(yōu)選【具體實(shí)施方式】以以說明和實(shí)例方式描述?！緦＠綀D】【附圖說明】[0061]圖1:負(fù)責(zé)生長刺激的Trop-2細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)決定子。（a)Trop-2的C端部分（aa275-323)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；帶負(fù)電的氨基酸加下劃線。所用的預(yù)測軟件在左側(cè)指示，h(以深灰色突出）：a-螺旋，e(以黑色突出）鏈；c(以淡灰色突出）：連接區(qū)（環(huán)路）。根據(jù)預(yù)測的共同二級(jí)結(jié)構(gòu)在底部指示，逐殘基分?jǐn)?shù)是1到10。預(yù)測準(zhǔn)確性分?jǐn)?shù)>80%(cubic.bioc.columbia.edu)。（b)Trop_2細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)突變體的序列；正常序列（wt)在頂部展示。HIKE域以灰色方框突出顯示；假定的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的位置以白色突出。S303A，S322A:絲氨酸303和322分別變?yōu)楸彼岬狞c(diǎn)突變；E-K:谷氨酸310、313、316和320變?yōu)橘嚢彼岬狞c(diǎn)突變；AHIKE:HIKE區(qū)缺失；Acyto:整個(gè)細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)缺失。（c)Trop-2細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)突變對于Trop-2依賴性生長的作用。結(jié)果用空載載體或用wtTrop-2或突變Trop-2轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞的生長曲線表示。wt與突變Trop-2之間的差異：P〈0.0001(雙向AN0VA)。星形指示個(gè)別時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)顯著差異（用于多個(gè)比較的邦弗朗尼檢驗(yàn)（Bonferronitest))林0.0001。條狀物：平均標(biāo)準(zhǔn)差。[0062]圖2:Trop_2信號(hào)傳導(dǎo)簇。Trop-2表達(dá)的電子顯微鏡分析。（a)用結(jié)合到金納米球的抗Trop-2抗體染色的MCF7乳腺癌細(xì)胞（黑點(diǎn)）。Trop-2經(jīng)鑒別在細(xì)長絨毛突起和大絨毛中（箭頭）并且在分散細(xì)胞膜區(qū)域中。白色圓圈（直徑30nm)集中在個(gè)別金顆粒上并且涵蓋發(fā)現(xiàn)結(jié)合到Trop-2的抗體分子的機(jī)率最高的區(qū)域。條狀物：50nm。（b)用結(jié)合到免疫過氧化酶的抗Trop-2抗體染色的Trop-2表達(dá)細(xì)胞（深色顆粒狀沉積物）。Trop-2轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞（i)，0VCA-432卵巢癌細(xì)胞（ii)，MCF-7乳腺癌細(xì)胞（iii)。Trop-2定位于分散細(xì)胞膜區(qū)域（箭頭）中，在細(xì)胞間接觸點(diǎn)處（i插圖：放大的接觸區(qū)域），在絨毛突起中（ii)，和在分散細(xì)胞膜區(qū)域中（iii)。還在胞質(zhì)內(nèi)囊泡的層面（箭頭）處檢測到Trop-2存在。[0063]圖3:Trop_2和PKCa與四跨膜蛋白分子和⑶9的相互作用。（a-d)對下列結(jié)構(gòu)進(jìn)行共焦顯微鏡分析：完整細(xì)胞膜（a);顯示共帽化的細(xì)胞膜區(qū)域（b);用Tr〇p-2(a-c，d頂部）或用空載載體（d底部）轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞的細(xì)胞膜的足跡（c，d)，同時(shí)用與熒光分子結(jié)合的抗Trop-2和抗CD9(四跨膜蛋白網(wǎng)的成員）或抗小窩蛋白（陰性對照）（a-c)或抗CD9和抗PKCa(d)染色。共定位的區(qū)域由箭頭指示。（e)Trop-2、PKCa、CD9和四跨膜蛋白的免疫共沉淀（IP)。使用針對鼠類⑶9、⑶81和⑶151(MTE4-14細(xì)胞）或人類⑶9、⑶82和⑶151(MCF7細(xì)胞）的初級(jí)抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；免疫沉淀物中Trop-2和PKCa的存在通過蛋白質(zhì)印跡法檢測。用抗Trop-2的IP:陽性對照。（f)Trop-2/膽固醇關(guān)聯(lián)。在用甲基-￠-環(huán)糊精處理之后培養(yǎng)基中Trop-2的釋放（左）。用毛地黃皂苷從BRIJ溶解物的沉淀Trop-2(右）。對用Trop-2轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞進(jìn)行處理，并且通過蛋白質(zhì)印跡法評估可溶和不溶部分中Trop-2的存在。[0064]圖4:Trop-2蛋白質(zhì)組。（a)通過蛋白質(zhì)印跡法測量的MTE4-14轉(zhuǎn)染子中信號(hào)傳導(dǎo)分子的量和磷酸化。V:單獨(dú)的載體；T2:Tr〇p-2。具有四個(gè)條帶的圖展示了兩對獨(dú)立測量。（b)來自用單獨(dú)的載體（左）或Trop-2(右）轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物的2D凝膠；圓圈表示通過Trop-2表達(dá)抑制（R，左）或誘導(dǎo)（I，右）的蛋白質(zhì)。[0065]圖5:Trop-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。（a)由Trop-2驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)（SNOW分析）。圓圈：可以彼此間進(jìn)行物理上相互作用的由Trop-2調(diào)節(jié)的所有蛋白質(zhì)（所鑒別的165種蛋白質(zhì)中的114種）。矩形：兩種蛋白質(zhì)之間的"連接體"。線（"邊緣"）表示蛋白質(zhì)間接觸。（b)由Trop-2驅(qū)動(dòng)的癌癥信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。使用程序IngenuityPathwayAnalysis對由Trop-2調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)（呈黑色）進(jìn)行映射定位。六邊形：激酶；梯形：小G蛋白和其相互作用體；矩形：細(xì)胞凋亡因子；橢圓形：轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)重塑蛋白質(zhì)；雙圓圈：蛋白質(zhì)復(fù)合物。以灰色突出的是信號(hào)傳導(dǎo)分子，其不是蛋白質(zhì)。粗灰色線：細(xì)胞膜；灰色方框：細(xì)胞核和線粒體腔室。P=6.19X10-45。[0066]圖6:由Trop-2的控制的Akt信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。（a)Trop_2/Akt信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的映射定位。使用IngenuityPathwayAnalysis軟件對由Trop-2調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)（呈黑色）進(jìn)行映射定位。六邊形：激酶；矩形：細(xì)胞凋亡因子；菱形：磷酸酶；橢圓形：轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)重塑蛋白質(zhì)；雙圓圈：蛋白質(zhì)復(fù)合物。以灰色突出的是信號(hào)傳導(dǎo)分子，其不是蛋白質(zhì)。粗灰色線：細(xì)胞膜。（b)通過Trop-2的調(diào)節(jié)Akt蘇氨酸308和絲氨酸473處的磷酸化水平。在存在或不存在PMA下用單獨(dú)的載體或用Trop-2轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析；對于每個(gè)條帶，表示相對于對照標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度。[0067]圖7:Trop-2影響對⑶9抑制劑的靈敏度。（a，b)⑶9沉默在MTE4-14/載體和MTE4-14/Trop-2中的效率的控制。（a)在用無效siRNA(對照）或特異性抗⑶9siRNA轉(zhuǎn)染之后24小時(shí)通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR對CD9的mRNA水平的測量。條狀物：測量的標(biāo)準(zhǔn)差。（b)在用無效siRNA(對照）或特異性抗⑶9siRNA轉(zhuǎn)染之后48小時(shí)對⑶9水平的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。白色輪廓：未染色的對照抗體；灰色輪廓：結(jié)合到Alexa-488的抗CD9抗體。（c)用Trop-2(MTE4-14/Trop-2、IGR0V/Trop-2、KM12-SM/Trop-2)或內(nèi)源性表達(dá)Trop-2(HCT116U5.5、MCF7、HT29)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的鼠類細(xì)胞或人類細(xì)胞中的CD9水平的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。白色輪廓：未染色的對照抗體；灰色輪廓：結(jié)合到Alexa-488的抗CD9抗體。(d)用無效siRNA(對照）或特異性抗⑶9或抗Trop-2siRNA轉(zhuǎn)染的MTE4-14/載體（左）和MTE4-14/Trop-2(右）的生長曲線。條狀物：平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。[0068]圖8:Trop-2影響對Akt抑制劑的靈敏度。用單獨(dú)的載體或用Trop-2轉(zhuǎn)染并且使用400nM的劑量或如所指示的不同劑量的無效siRNA(對照）或特異性抗AKTsiRNA(左）或用單獨(dú)的溶劑或Akt的藥理學(xué)抑制劑（中，右）處理的MTE4-14細(xì)胞的生長曲線。條狀物：平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。[0069]圖9:通過Akt的抑制對表達(dá)Trop-2的腫瘤的生長進(jìn)行抑制。用單獨(dú)的溶劑或用Akt的MK-2206藥理學(xué)抑制劑處理的用Trop-2轉(zhuǎn)染的C〇1〇205結(jié)腸癌細(xì)胞（上）或MTE4-14細(xì)胞（下）的體內(nèi)生長曲線。用空載載體轉(zhuǎn)染的MTE4-14對照細(xì)胞在這個(gè)模型中不具有致瘤能力。對照與經(jīng)治療的腫瘤之間的差異：P〈〇.0001(雙向AN0VA)。星形表示個(gè)別時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)顯著差異（用于多個(gè)比較的邦弗朗尼校驗(yàn)（Bonferroniadjustment)):*<0.05，**<0.01，***<0.001<0.001****。條狀物：平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。插圖，腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)染子中的Trop-2表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析：白色輪廓，未染色的對照抗體；灰色輪廓，結(jié)合到Alexa-488的抗Trop-2。實(shí)施例[0070]細(xì)朐培養(yǎng)[0071]將人類MCF-7和0VCA-432細(xì)胞系在RPMI1640培養(yǎng)基（GibcoBRL,佩斯利，蘇格蘭）（GibcoBRL,Paisley,Scotland)中生長。將人類293和KM12SC以及鼠類永生化MTE4_14(納凱，勒拍桑等人1989)(Naquet,Lepesantetal.1989)和L細(xì)胞系維持在DMEM中。所有培養(yǎng)基都補(bǔ)充有1〇%胎牛血清（6讓(^此)、100幾/1111青霉素和10〇1^/1111鏈霉素(優(yōu)洛克隆，米蘭，意大利）（Euroclone,Milano,Italy)。[0072]DNA轉(zhuǎn)染[0073]將細(xì)胞用DNA在脂質(zhì)體（Lipofectamine)2000或LTX(英杰，卡爾斯巴德，加利福尼亞州）（Invitrogen,Carlsbad,CA)中根據(jù)制造商的說明書轉(zhuǎn)染。選擇在含G-418的培養(yǎng)基中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。[0074]免疫熒光分析[0075]用與AlexaFluor-488/546/633結(jié)合的指定抗體或用由與AlexaFluor-488/546/633結(jié)合的二級(jí)抗體檢測的相同未結(jié)合的抗體對涂布在玻璃蓋玻片上的細(xì)胞染色。將細(xì)胞在固定之前在37°C下用10%FBS在培養(yǎng)基中活染色5分鐘，或在固定之后通過在室溫下在PBS中與相關(guān)抗體一起孵育而染色30分鐘。將細(xì)胞用4%多聚甲醛在PBS中固定20分鐘。用10%FCS、0.1%皂苷進(jìn)行非特異性相互作用的透化和封閉。隨后將載玻片在PBS中洗滌，并且固定以便通過LSM-510META共焦顯微鏡（蔡司，上科亨，德國）(Zeiss,Oberkochen,Germany).分析。[0076]細(xì)朐足跡[0077]"細(xì)胞足跡"是在用EDTA分離細(xì)胞之后組織培養(yǎng)皿上的細(xì)胞膜殘余物（哈科莫里2002)(Hakomori2002)。基本上如所描述進(jìn)行細(xì)胞處理和免疫熒光分析（哈科莫里2002)。[0078]免疫共沉淀分析[0079]將細(xì)胞溶解于BRIJ緩沖液（150mMNaCl，50mMTris-HCl，pH7.5,ImMMgC12,ImMCaC12，l%BRIJ，蛋白酶抑制劑）中。通過在4°C下與蛋白G瓊脂糖凝膠（通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔威，新澤西州）（GEHealthcare，Piscataway，NJ)-起孵育1小時(shí)使細(xì)胞溶解物澄清。將澄清的溶解物在4°C下與針對假定Trop-2相互作用體的初級(jí)抗體一起孵育2小時(shí)，隨后與蛋白G瓊脂糖凝膠一起孵育（在4°C下，1小時(shí)）。將蛋白質(zhì)復(fù)合物用0.1M甘氨酸在pH2.5下從樹脂上洗脫，并且通過蛋白質(zhì)印跡法用所指定的特異性抗體探測。[0080]3曰固醇從細(xì)朐臘的消耗和沉淀[0081]為了消耗細(xì)胞膜上的膽固醇，將完整細(xì)胞在PBS中洗滌三次以去除血清，并且在37°C下在DMEM中用10mM甲基-￠-環(huán)糊精孵育45分鐘。將對照細(xì)胞在不存在甲基-3-環(huán)糊精的條件下平行處理。將樣品在2000g下離心以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將上清液中的蛋白質(zhì)沉淀于三氯乙酸中，并且通過蛋白質(zhì)印跡法分析。[0082]還將細(xì)胞通過刮擦而收集并且溶解于具有1%BRIJ的緩沖液中。將上清液與1/10(體積/體積）甲醇（對照）或1/10(體積/體積）甲醇中的10%毛地黃皂苷混合，并且在冰上孵育10分鐘。將細(xì)胞膜通過在12,OOOg下離心15分鐘而恢復(fù)。將團(tuán)粒在冷丙酮中洗漆，再懸浮于勒姆利緩沖液（Laemmlibuffer)中，并且通過蛋白質(zhì)印跡法分析。[0083]免疫電子顯微術(shù)[0084]為進(jìn)行免疫金電子顯微術(shù)（EM)，將細(xì)胞在37°C下固定于4%甲醛、0.05%戊二醛、0.15MHEPES，pH7.3中10分鐘，并且在室溫下進(jìn)行后固定于4%多聚甲醛、0.15MHEPES，pH7.3中50分鐘，如所描述（波利修克，波利修克等人2000)(Polishchuk,Polishchuketal.2000)。陽離子化金、蛋白A-金和金結(jié)合的抗兔抗體（10nm膠態(tài)金顆粒）來自英國BioCell(加的夫，英國）（Cardiff，UK)。免疫過氧化酶EM如所描述進(jìn)行（布朗（Brown)和法科1989)(BrownandFarquhar1989)。假定抗體分子的平均長度是llnm，進(jìn)行最小標(biāo)記面積的估計(jì)。[0085]體外細(xì)朐牛長分析[0086]將用空載載體或用Trop-2轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞以1.5-3X103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中（每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)五個(gè)復(fù)孔）。通過MTT比色分析（羅氏分子生物化學(xué)品（RocheMolecularBiochemicals)，曼海姆（Mannheim),德國）或通過用結(jié)晶紫染色來定量細(xì)胞數(shù)目。將細(xì)胞數(shù)目針對連續(xù)稀釋的細(xì)胞樣品的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。[0087]抗體[0088]通過用已經(jīng)在細(xì)菌中產(chǎn)生的重組Trop-2皮下免疫來產(chǎn)生兔多克隆抗Trop-2抗血清（福爾納羅，戴爾阿爾奇普雷特等人1995)(?〇1'仙1'〇,〇611'41'(^口代丨66丨31.1995)。將Trop-2反應(yīng)性抗體通過與固定到NHS-瓊脂糖凝膠柱（法瑪西，烏普薩拉，瑞典）(Pharmaci,Uppsala,Sweden)上的重組Trop-2結(jié)合來純化，并且用0?2M甘氨酸，在pH2.5洗脫。山羊抗Trop-2多克隆抗體AF650獲自研發(fā)系統(tǒng)公司（R&DSystems,Inc.)(明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州）以1皿6&?〇1&，1^)。針對鼠類分子的其它抗體是：大鼠單克隆抗CD9(sc-18869);兔單克隆抗Akt(ser473)(D9E)(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)，馬薩諸塞州）(CellSignalTechnology，MA);山羊多克隆抗CD151(sc-18753)、抗磷酸化PKCa(S657)(sc-12356)抗Akt(sc-1618);兔多克隆抗小窩蛋白-1(sc-894)、抗PKCa(sc-208)、抗磷酸化Akt(Thr308)(sc-16646-R)(圣克魯茲生物技術(shù)，圣克魯茲，加利福尼亞州）(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz,CA);倉鼠多克隆抗CD81(GTX75430)(基因文本，歐文，加利福尼亞州）（GeneText，Irvine，CA)。針對相應(yīng)人類分子的小鼠單克隆抗體是：抗⑶9(14-0098)、抗⑶98(14-0982)(電子生物科學(xué)，圣地亞哥，加利福尼亞州）（eBioscience,SanDuego,CA)、抗CD1S1(HOOOO〇977_M〇2)(亞諾法，臺(tái)灣，中國）（Abnova,Taiwan,China)和抗⑶81(TS81)(由F?蘭扎（F.Lanza)博士慷慨供應(yīng)）(generouslysuppliedbyDr.F.Lanza)。二級(jí)AlexaFluor-488/546/633結(jié)合的抗體來自英杰。[0089]藥理學(xué)抑制劑[0090]將細(xì)胞用50-100-200-400nMA6730_SIGMA(西格馬技術(shù)公司，圣路易斯，密蘇里州63178-9916)(SigmaTechnicalCompany,StLouis,M063178-9916)或用400nMMK-2206(賽萊克化學(xué)品，休斯頓，德克薩斯州）（SelleckChemicals,Houston,TX)處理以抑制Akt。將儲(chǔ)備溶液于DMS0中制備并且用乙醇或水稀釋，DMS0和乙醇的最終濃度分別決不超過0.1%和1%。對照細(xì)胞接受單獨(dú)的媒劑。在接種之后24小時(shí)進(jìn)行第二處理。[0091]體內(nèi)樽型：無胸腺裸小鼠中的異種移棺體[0092]將用Trop-2轉(zhuǎn)染的MTE4-14永生化細(xì)胞系（阿爾貝蒂，紐蒂尼等人1994)(Alberti,Nutinietal.1994)或內(nèi)源性表達(dá)Trop-2的C〇1〇205結(jié)腸癌細(xì)胞皮下注射(4X106個(gè)細(xì)胞/注射）到裸小鼠組（8周大的雌性⑶1-Foxnlnu/nu小鼠（查爾斯河實(shí)驗(yàn)室，卡爾科，萊科，意大利）（CharlesRiverLaboratories，Calco，Lecco，Italy)中。將用Trop-2轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞與基質(zhì)膠（低生長因子基質(zhì)，碧迪生物科學(xué)，富蘭克林湖，美國新澤西州）（growthfactorreducedmatrix,BDBiosciences,FranklinLakes,NJUSA)以1:3體積/體積的比例共注射。[0093]在使用時(shí)將M-2206于DMS0中的儲(chǔ)備溶液用不致熱生理鹽水溶液中稀釋到0.7mg/ml的最終濃度，并且從腫瘤變得摸得出的時(shí)間開始，將藥物以每天每小鼠0.35mg的劑量腹膜內(nèi)給予。將對照組小鼠用單獨(dú)的媒劑處理。每5-7天目測檢驗(yàn)小鼠，并且測量實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的大直徑和小直徑。使用用于橢球體積的式子（DXd2/2)計(jì)算腫瘤體積。用空載載體轉(zhuǎn)染的MTE4-14細(xì)胞在這個(gè)模型中不致瘤。涉及動(dòng)物和其護(hù)理的程序按照制度指南、國家法律和國際方案（D.L.第116期，G.U.，增刊40,1992年2月18日；第8期，G.U.，1994年7月；關(guān)于實(shí)驗(yàn)瘤形成中的動(dòng)物福利的UKCCCR指南（UKCCCRGuidelinesfortheWelfareofAnimalsinExperimentalNeoplasia);EEC委員會(huì)指令（EECCouncilDirective)86/609,0JL358.1，1987年12月12日；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南（GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals),美國國家研究委員會(huì)（UnitedStatesNationalResearchCouncil)，1996)進(jìn)行。[0094]抗體介導(dǎo)的共帽化[0095]將細(xì)胞使用胰蛋白酶從培養(yǎng)板分離，并且與初級(jí)抗Trop-2抗體（T16)-起在冰上孵育20分鐘（阿爾貝蒂，苗蒂等人1992)(Alberti,Miottietal.1992)。在洗滌之后，在37°C下將細(xì)胞與二級(jí)AlexaFluor488結(jié)合的抗體一起孵育10分鐘，以使靶標(biāo)分子交聯(lián)并且誘導(dǎo)抗原-抗體復(fù)合物的帽化（利維和肖哈姆2005)(LevyandShoham2005)。將'帽化的'細(xì)胞在室溫下用1%多聚甲醛固定10分鐘。將多聚甲醛用FBS淬滅，并且將細(xì)胞用針對所關(guān)注的膜蛋白質(zhì)的抗體染色。[0096]蛋白質(zhì)印跡分析[0097]如先前所述進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（艾爾斯維迪，福爾納羅等人1998)(ElSewedy，F(xiàn)ornaroetal.1998)。簡單來說，將細(xì)胞溶解物通過在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳（SDS-PAGE)來分析，并且轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。將濾膜與相關(guān)初級(jí)抗體（艾賓，劍橋，英國；圣克魯茲）（Abeam,Cambridge,UK;SantaCruz)-起在具有5%脫脂奶粉的TBS中孵育。將雜交的濾膜在TBS，0.1%Tween-20中進(jìn)行洗滌。通過化學(xué)發(fā)光（ECL，安瑪西亞，艾爾斯伯里，英國）（ECL，Amersham,Aylesbury,UK)使用辣根過氧化酶結(jié)合的抗小鼠或抗兔二級(jí)抗體（卡爾生物化學(xué)，拉荷亞，加利福尼亞州）（Calbiochem,LaJolla,CA)揭示抗體結(jié)合。用NIH-圖像1.62、使用柯達(dá)（Kodak)灰階標(biāo)準(zhǔn)功率曲線（www.kodak,com)作為參考來定量信號(hào)強(qiáng)度。[0098]質(zhì)粒[0099]pEYFP表達(dá)載體獲自克隆科技（Clontech)(帕洛阿爾托，加利福尼亞州）（PaloAlto,CA)。缺乏EYFP的編碼序列的相應(yīng)載體用以表達(dá)野生型或誘變處理的Trop-2cDNA。將野生型人類TR0P2的編碼序列通過PCR用正向引物5'GCGAITCTCGAGTCCGGTCCGCGITCC3'（SEQIDN0:13)和反向引物5'GCGCCGGTACCAAGCTCGGTTCCTTTC3'（SEQIDN0:14)擴(kuò)增，并且亞克隆到pEYFP-Nl載體中。表達(dá)載體pCMV-SP0RT6和CD316pCMV-SP0RT6獲自伊馬基因（Imageries)(柏林，德國）（Berlin,Germany)。按照標(biāo)準(zhǔn)程序構(gòu)筑⑶9(EcoRI/BamHI)、0)316(EcoRI/Agel)與mCherry之間的嵌合蛋白。[0100]siRNA[0101]按照根據(jù)以下的程序使用四種設(shè)計(jì)策略：突施爾準(zhǔn)則（Tuschlcriteria)(艾爾巴希爾，哈博特等人2001)(￡]^3811；[1'，]^1'13〇1'1：116七31.2001):英杰（1'1^1(168181161'.invitrogen.com/rnaiexpress/)，懷特黑德研究所（WhiteheadInstitute)網(wǎng)站（jura,wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)(塞米扎羅夫，弗羅斯特等人2003)(Semizarov,Frostetal.2003);松哈默（Sonnhammer)(sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch)(查克，瓦勒斯泰特等人2004)(Chalk,Wahlestedtetal.2004)。所選擇的siRNA是通過以上方法中的超過一者鑒別或由其中的至少一者視為最優(yōu)的siRNA。對所關(guān)注的基因具有特異性的來自相應(yīng)siRNA的發(fā)夾RNA(shRNA)的編碼序列（艾爾巴希爾，哈博特等人2001)(Elbashir，Harborthetal.2001)已經(jīng)在針對RNA聚合酶-IIIH1基因的啟動(dòng)子的控制下亞克隆于pSUPER載體（布魯梅爾坎普，伯納茲等人2002)(Brummelkamp,Bernardsetal.2002)中。借助于抗CD9siRNA，通過靶標(biāo)正義序列5'GGTAGCAAGTGCATCAAAT3'（SEQIDN0:1)和反義序列5'ATTTGATGCACTTGCTACC3'（SEQIDN0:2)獲得CD9的抑制，作為一個(gè)實(shí)例包括于以下序列中用于轉(zhuǎn)錄發(fā)夾RNA，其中正義和反義定向中的靶標(biāo)序列加下劃線：[0102]正向5,GATCCCCGGTAGCAAGTGCATCAAATTTCAAGAGAATTTGATGCACTTGCTACCTTTTTGGAAA3'(SEQIDNO:3),[0103]反向5'AGCTTTTCCAAAAAGGTAGCAAGTGCATCAAATTCTCTTGAAATTTGATGCACTTGCTAC￡GGG3'（SEQIDNO:4)。[0104]通過借助于抗AKTsiRNA已經(jīng)獲得Akt抑制，靶標(biāo)正義序列5'GCACCTTTAT一個(gè)實(shí)例包括于以下序列中用于轉(zhuǎn)錄發(fā)夾RNA:[0105]正向5,GATCCCCGCACCTTTATTGGCTACAATTCAAGAGATTGTAGCCAATMAGGTGCTTTTTC3'(SEQIDNO:7),[0106]反向5,TCGAGAAAAAGCACCTTTATTGGCTACAATCTCTTGAAHGTAGCCAATAAAGGTGCGGG3'（SEQIDNO:8);[0107]或靶標(biāo)正義序列5'GGAAGGTGATTCTGGTGAA3'（SEQIDN0:9)、反義序列5'TTCACCAGAATCACCTTCC3'（SEQIDN0:10)作為一個(gè)實(shí)例包括于以下序列中用于轉(zhuǎn)錄發(fā)夾RNA:[0108]正向5,GATCCCCGGAAGGTGATTCTGGTGAATTCAAGAGATTCACCAGAATCACCTTCCTTTTTC3'（SEQIDN0:11)，[0109]反向5'TCGAGAAAAAGGAAGGTGATTCTGGTGAATCTCTTGAATTCACCAGAATCACCTTCCGGG3'（SEQIDNO:12)。[0110]將相應(yīng)構(gòu)筑體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MTE4-14細(xì)胞中，并且評估其對于細(xì)胞增殖的作用。通過實(shí)時(shí)RT-PCR定量沉默之后的轉(zhuǎn)錄水平。針對無關(guān)靶標(biāo)的siRNA用作陰性對照，在充分校驗(yàn)對于細(xì)胞生長不存在假性作用之后進(jìn)行選擇。以下給出相應(yīng)序列；對于每種siRNA，用根據(jù)參考序列（RefSeq)數(shù)據(jù)庫（基因庫）的標(biāo)識(shí)碼指定相應(yīng)基因。[0111]針對鼠類C〇-029/Tspan8的siRna(NM_146010.2)用作人類細(xì)胞的陰性對照，其具有靶標(biāo)序列正義5'CITTCAAACCTGAGTATAA3'（SEQID勵(lì)：15)、反義5'11^14(：1^八6GTTTGAAAG3'（SEQIDNO:16)作為一個(gè)實(shí)例包括于以下序列中用于轉(zhuǎn)錄發(fā)夾RNA:[0112]正向5,GATCCCCCTTTCAAACCTGAGTATAATTCAAGAGATTATACTCAGGTTTGAAAGTTTTTGGAAA3'（SEQIDN0:17)，[0113]反向5'AGCTTTTCCAAAAACTTTCAAACCTGAGTATAATCTCTTGAATTATACTCAGGTTTGAAAQGGG3'（SEQIDNO:18)。[0114]針對人類⑶133的siRNA(NM_006017.2)用作鼠類細(xì)胞的陰性對照，其具有靶標(biāo)3'（SEQIDN0:20)作為一個(gè)實(shí)例包括于以下序列中用于轉(zhuǎn)錄發(fā)夾RNA:[0115]正向5,GATCCCCCTTGACAACGTTAATAACGTTCAAGAGACGTTATTAACGTTGTCAAGTTTTTGGAAA3'（SEQIDNO:21)，[0116]反向5，AGCTTTTCCAAAAACTTGACAACGTTAATAACGTCTCTTGAACGTTATTAACGTTGTCAAGGGG3'（SEQIDNO:22)。[0117]針對人類⑶316的siRNA(NM_052868.2)用作鼠類細(xì)胞的陰性對照，其具有靶標(biāo)3'（SEQIDN0:24)作為一個(gè)實(shí)例包括于以下序列中用于轉(zhuǎn)錄發(fā)夾RNA:[0118]正向5,GATCCCCTGCAGGAAGTGGTGGGAATTTCAAGAGAATTCCCACCACTTCCTGCATTTTTGGAAA3'(SEQIDNO:25),[0119]反向5'AGCTTTTCCAAAAATGCAGGAAGTGGTGGGAATTCTCTTGAAATTCCCACCACTTCCTGCAGGG3'（SEQIDNO:26)。[0120]如先前所述獲得TR0P2沉默（特雷羅托拉，坎它內(nèi)利等人2013)(Trerotola,Cantanellietal.2013)〇[0121]Troo-2的細(xì)朐質(zhì)域的誘奪[0122]通過PCR用以下引物獲得Trop-2的細(xì)胞質(zhì)域的突變體：[0123]Trop-2Acyto[0124]正向5,CTCGGATCCACCATGGCTCGGGGCCCC3,（SEQIDN0:27)，[0125]反向5,CTCGAATTCCCGGTTGGTGATCACCAG3,（SEQIDN0:28)。[0126]Trop_2E-K[0127]正向5'GCGGAATTCCGTCCGGTCCGCGTTCCT3'（SEQIDN0:29)，[0128]反向5，GCGTCTAGACTACAAGCTCGGTTTCTTTCTCAACTTCCCCAGTTTCTTGATCTTCACCTTCTTG3'（SEQIDN0:30)。[0129]Trop-2AHIKE[0130]正向5,GCGGAATTCCGTCCGGTCCGCGTTCCT3,（SEQIDNO:31)，[0131]反向5,GCGTCTAGACTACAAGCTCGGTTCCTTTCTCAACTCCCCCAGTTCCTTGATCTCCACTCTCCGGTTGGTGATCAC3'（SEQIDN0:32)。[0132]Trop-2S303A[0133]正向5,CTCGGATCCACCATGGCTCGGGGCCCC3,（SEQIDNO:33)，[0134]反向5,GCGTCTAGACTACAAGCTCGGTTCCTTTCTCAACTCCCCCAGTTCCTTGATCTCCACCTTCTTGTACTTCCCCGCCTTTCTCCGG3'（SEQIDN0:34)。[0135]Trop-2S322A[0136]正向5,CTCGGATCCACCATGGCTCGGGGCCCC3,（SEQIDNO:35)，[0137]反向5,GCGTCTAGACTACAAGGCCGGTTCCTTTCTCAACTCCCC3,（SEQIDNO:36)。[0138]對所有擴(kuò)增區(qū)域完全測序以驗(yàn)證通過Taq聚合酶誘導(dǎo)的突變的不存在。[0139]實(shí)時(shí)定量RT-PCR[0140]在Trizol(英杰）中按照制造商的說明書從指定細(xì)胞系中提取總RNA。將一iig總RNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用ImProm-II逆轉(zhuǎn)錄酶（普洛麥格（Promega))用于每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄（RT)反應(yīng)。使用ABI-PRISM7900HT序列檢測系統(tǒng)（PE應(yīng)用生物系統(tǒng)，福斯特市，加利福尼亞州）（PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)用特異性引物（Hs99999905;CD9:MmO〇514275_gl;B2M:Mm00437762_ml)(應(yīng)用生物系統(tǒng)）和相應(yīng)TaqMan?(羅氏(Roche))熒光探針根據(jù)制造商說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)（朱列蒂，奧弗伯格等人2001)(Giulietti,Overberghetal.2001)〇一式三份地分析每種樣品，并且將2-AAGT方法用以計(jì)算基因表達(dá)的相對變化（利瓦克和施米特根2001)(LivakandSchmittgen2001)。使用1.834的更準(zhǔn)確基準(zhǔn)（格拉，特雷羅托拉等人2008)(Guerra,Trerotolaetal.2008)，其需要1.1個(gè)周期來使擴(kuò)增物質(zhì)加倍。GAPDH和B2M管家基因用作內(nèi)部控制。對于每種cDNA，計(jì)算ACT(CT，靶標(biāo)基因-CT，GAPDH/B2M):使用最小二乘線性回歸分析。由于擴(kuò)增效率在所用RNA量的范圍內(nèi)是線性的，所以將擴(kuò)增曲線用以計(jì)算經(jīng)siRNA處理的樣品的交叉點(diǎn)值。通過使用非逆轉(zhuǎn)錄的RNA作為PCR反應(yīng)的模板，常規(guī)地評估每種樣品的基因組DNA污染。[0141]2D凝膠和質(zhì)譜法[0142]通過如所描述進(jìn)行的2D-PAGE獲得整個(gè)基因組的幻像（瑞士生物信息學(xué)研究所(SwissInstituteofBioinformatics,SIB),http://us.expasy.org/ch2d/protocols/)〇在約克大學(xué)（UniversityofYork)進(jìn)行質(zhì)譜分析(www.yorLac.uk/depts/biol/tf/proteomics/)。[0143]Tr〇D-2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的通路分析和鑒別[0144]使用SNOW(snow,bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi)和IngenuityPathwaysAnalysis(IPA，Ingenuity系統(tǒng)，www.ingenuity,com)生物信息學(xué)工具分析Trop-2的蛋白質(zhì)組。SN0W(snow.bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi)構(gòu)建了蛋白質(zhì)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，使蛋白質(zhì)映射定位于參考相互作用組上。參考相互作用組是一組逐對直接蛋白質(zhì)相互作用，其中節(jié)點(diǎn)是蛋白質(zhì)本身并且連接邊緣是相互作用事件。使用HPRD(人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫）、IntAct、BIND(生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫）、DIP(相互作用蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫）和MINT(分子相互作用數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建Trop-2依賴性相互作用組。將這些數(shù)據(jù)庫用以構(gòu)建最小連接網(wǎng)絡(luò)（MCN)?；谝韵略u估拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)：節(jié)點(diǎn)連接程度（即每個(gè)節(jié)點(diǎn)邊緣的數(shù)目）；中間性（即節(jié)點(diǎn)向心性及其分布的量度）；簇聚系數(shù)分布（即每個(gè)節(jié)點(diǎn)的鄰近的連接性）；網(wǎng)絡(luò)的組分的數(shù)目（即在網(wǎng)絡(luò)分析中產(chǎn)生的節(jié)點(diǎn)的不同群組）；雙組分（即通過單一邊緣連接到另一個(gè)節(jié)點(diǎn)群組的節(jié)點(diǎn)群組的數(shù)目）；和關(guān)節(jié)點(diǎn)（即在網(wǎng)絡(luò)中加入雙組分的邊緣）。使用迪杰斯特拉（Dijkstra)算法、應(yīng)用如下嚴(yán)格選項(xiàng)來鑒別MCN:允許在所分析的任何輸入蛋白質(zhì)對之間引入僅一個(gè)外部連接蛋白質(zhì)。以這種方式，可能獲得將經(jīng)歷分析的由Trop-2調(diào)節(jié)的165種蛋白質(zhì)中的114種與22種連接體組合的單一網(wǎng)絡(luò)。相較于整個(gè)參考相互作用組上產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)并且相較于隨機(jī)組成的網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證來說具有統(tǒng)計(jì)上的顯著性。為了使用IngenuityPathwaysAnalysis軟件分析，將表示為Trop-2與對照轉(zhuǎn)染子之間的標(biāo)準(zhǔn)化平均信號(hào)強(qiáng)度之間的比率的蛋白質(zhì)表達(dá)值轉(zhuǎn)化為倍數(shù)變化值，其中對于〇與1之間的值，獲取負(fù)倒數(shù)（-1/x)。在過濾數(shù)據(jù)集時(shí)，不設(shè)定臨限取舍點(diǎn)。將所有分子（Swiss-Prot標(biāo)識(shí)符）映射定位到IngenuityKnowledgeBase上作為聚焦點(diǎn)。IngenuityKnowledgeBase將蛋白質(zhì)相互作用組織為實(shí)體格式，如通過人工管理從公開的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取。通過使特定連接性最大化來產(chǎn)生聚焦分子的網(wǎng)絡(luò)，所述特定連接性是即分子之間的實(shí)際互連性相較于KnowledgeBase中的所有分子的互連性。通過分?jǐn)?shù)（通過右尾費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)（Fisher'sexacttest)計(jì)算的p值的負(fù)對數(shù)）對網(wǎng)絡(luò)分級(jí)，其考慮網(wǎng)絡(luò)中的合格分子的數(shù)目和其最終大小以及輸入數(shù)據(jù)集大小和包括于網(wǎng)絡(luò)中的IngenuityKnowledgeBase中的分子的總數(shù)目。分?jǐn)?shù)越高，隨機(jī)相互作用網(wǎng)絡(luò)的機(jī)率越低。隨后將聚焦分子映射定位到Ingenuity典型路徑上。[0145]統(tǒng)計(jì)分析[0146]使用雙向AN0VA檢驗(yàn)來比較腫瘤生長曲線（羅西，迪麗娜等人2008)(Rossi,DiLenaetal.2008)〇[0147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