多肽產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)中的雜質(zhì)定量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于定量測(cè)定出現(xiàn)在多肽產(chǎn)品中的雜質(zhì)的方法，其中所述雜質(zhì)不能從其它雜質(zhì)或主產(chǎn)品中分離。該方法尤其涉及高分辨率質(zhì)譜(MS)檢測(cè)的使用，可聯(lián)用或不聯(lián)用高效液相色譜法(HPLC)。該方法可用于多肽和蛋白質(zhì)，尤其是藥用多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量檢測(cè)。
【專利說明】多肽產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)中的雜質(zhì)定量
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于定量測(cè)定出現(xiàn)在多肽產(chǎn)品中的雜質(zhì)的方法，其中所述雜質(zhì)不 能從主產(chǎn)品或其它雜質(zhì)中分離。該方法尤其涉及高分辨率質(zhì)譜（MS)檢測(cè)的使用，可聯(lián)用或 不聯(lián)用高效液相色譜法（HPLC)。該方法可用于多肽和蛋白質(zhì)，尤其是藥用多肽和蛋白質(zhì)的 質(zhì)量檢測(cè)。
[0002] 使用大家熟知的重組DNA和化學(xué)固相合成技術(shù)，一些蛋白質(zhì)和多肽已被合成用做 藥物。但是，這些蛋白質(zhì)和多肽的制備過程中，往往會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)多種不期望的合成副產(chǎn)品。 尤其是當(dāng)這些蛋白質(zhì)和多肽是由固相合成法生產(chǎn)的時(shí)候更是如此。多肽/蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度增 力口，導(dǎo)致所需的合成步驟增加，這些副產(chǎn)品可能存在于50%至70%的粗產(chǎn)品中。
[0003] 因此，合成的一個(gè)重要部分是從合成副產(chǎn)品中純化主產(chǎn)品。純化主要是通過色譜 方法進(jìn)行的。作為藥物產(chǎn)品的活性成分，最終純化的多肽產(chǎn)品需要進(jìn)行純度方面的分析，這 也大多采用色譜方法進(jìn)行。由于期望的多肽產(chǎn)品與非期望的合成副產(chǎn)品的分子結(jié)構(gòu)差異與 整體結(jié)構(gòu)相比很微小，這些產(chǎn)品的色譜特性可以是相同或幾乎相同。這往往導(dǎo)致這些雜質(zhì) 與其它雜質(zhì)及主產(chǎn)品本身在層析分離中被共洗脫。
[0004] 選擇性分析方法的發(fā)展是藥用多肽產(chǎn)品組合物出廠檢驗(yàn)中的一個(gè)關(guān)鍵方面。但由 于上述原因，使用色譜分離方法，甚至經(jīng)過極大的努力也可能無法分離所有相關(guān)雜質(zhì)。因 此，有必要提供一種新的方法，用于多肽產(chǎn)品中雜質(zhì)的定量測(cè)定，尤其是不能通過色譜方法 定量地從所需的主產(chǎn)品分離出去的雜質(zhì)的定量。
[0005] 本發(fā)明提供一種定量測(cè)定多肽產(chǎn)品組合物中雜質(zhì)的方法，這些雜質(zhì)不能通過色譜 方法從主產(chǎn)品中分離或與組合物中的其他雜質(zhì)或其他成分共洗脫。這種方法可通過多肽利 西拉肽（Lixisenatide) (AVE0010)示例，利西拉肽（AVE0010)是一種44個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的 GLP-I激動(dòng)劑。利西拉肽的氨基酸序列見SEQ ID NO: 1:
[0006] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A -P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0007] 利西拉肽是由化學(xué)固相合成方法生產(chǎn)。通過色譜純化過程，大多數(shù)雜質(zhì)能從期望 的產(chǎn)品中分離出去。
[0008] 然而，兩種雜質(zhì)，Di-Ser(33)-AVE0010和Di-Ala(35)-AVE0010不能通過色譜方法 分離出去。這兩種雜質(zhì)的氨基酸序列如下：
[0009] Di-Ser(33)-AVEOO10(SEQ ID NO:2)
[0010] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-S-G -A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0011] Di-Ala(35)-AVEOO10(SEQ ID NO:3)
[0012] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A -A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0013] 由于利西拉肽是一種藥用產(chǎn)品，尤其用于治療糖尿病病人，上述雜質(zhì)及其含量需 要測(cè)定，才能允許批量發(fā)售。本發(fā)明的
【發(fā)明者】現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)可通過高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合或 不結(jié)合先期的色譜方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)上述雜質(zhì)的定量分析。
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)主題是提供一種定量測(cè)定出現(xiàn)在多肽產(chǎn)品組合物中的雜質(zhì)的方法， 包括以下步驟：
[0015] a.提供一種多肽產(chǎn)品組合物，其包含一種多肽產(chǎn)品和至少一種未知量的雜質(zhì)，其 中所述雜質(zhì)不能通過色譜方法與組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分相分離；
[0016] b.提供至少一份無上述雜質(zhì)添加的該多肽產(chǎn)品組合物樣品，及可選的至少一種添 加了已知量的上述雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物樣品；
[0017] c.通過質(zhì)譜法定量測(cè)定步驟b中至少一份樣品中的所述雜質(zhì)；
[0018] d.基于步驟c的結(jié)果，計(jì)算多肽產(chǎn)品組合物中所述雜質(zhì)的量。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步的主題是提供一種用于定量測(cè)定存在于多肽產(chǎn)品組合物中的雜質(zhì) 的方法，包括下列步驟：
[0020] a.提供一種多肽產(chǎn)品組合物，其包含一個(gè)多肽產(chǎn)品和至少一種未知量的雜質(zhì)，其 中所述雜質(zhì)不能通過色譜方法與組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分相分離；
[0021] b.提供至少三份多肽產(chǎn)品組合物樣品，其中第一份樣品含未添加所述雜質(zhì)的多肽 產(chǎn)品組合物，并且其中至少兩份另外的樣品含有分別添加了不同已知量的上述雜質(zhì)的多肽 產(chǎn)品組合物；
[0022] c.通過質(zhì)譜法定量測(cè)定步驟b中至少三份樣品中的所述雜質(zhì)含量，及
[0023] d.基于步驟c的結(jié)果，計(jì)算多肽產(chǎn)品組合物中所述雜質(zhì)的量。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步的主題是提供一種用于定量測(cè)定利西拉肽（AVE 0010)產(chǎn)品組合物 中雜質(zhì)含量的試劑盒，包括：
[0025] (i)至少一種 Di-Ser (33)-AVE0010 備用品（stock preparation)，和 / 或
[0026] (ii)至少一種 Di-Ala(35)-AVE0010 備用品
[0027] 另外，本發(fā)明的進(jìn)一步主題是提供一種對(duì)含有唾液素（exendin)多肽產(chǎn)品的 組合物進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，其中的唾液素多肽產(chǎn)品包含氨基酸序列S-S-G-A，優(yōu)選 的是含有利西拉肽（AVE0010)產(chǎn)品的組合物，該方法也包括對(duì)Di-Ser(33)_肽，例如 Di-Ser (33) -AVE0010,和 / 或 Di-Ala (35)-肽，例如 Di-Ala (35) -AVE0010 的定量測(cè)定。
[0028] 本發(fā)明涉及檢測(cè)出現(xiàn)在一種多肽產(chǎn)品組合物中的雜質(zhì)。術(shù)語"多肽產(chǎn)品"包括具 有至少5或10個(gè)氨基酸和高達(dá)50或100氨基酸或更長(zhǎng)的多肽和蛋白質(zhì)。多肽產(chǎn)品可含有 遺傳編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)單元或含有非遺傳編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)單元，例如非天然存在的氨基 酸，D氨基酸或化學(xué)修飾氨基酸，或含有幾條相連的肽鏈，例如通過二硫鍵相連。多肽產(chǎn)品 可另外有N，C端，和/或側(cè)鏈的修飾，例如?；?，酰氨化，或添加非肽側(cè)鏈基團(tuán)，例如親脂基 團(tuán)。多肽產(chǎn)品可以是線性，也可以是環(huán)狀。優(yōu)選的，多肽產(chǎn)品長(zhǎng)度為5到100個(gè)氨基酸。
[0029] 多肽產(chǎn)品的合成中可涉及重組DNA方法和/或化學(xué)合成方法。優(yōu)選的，所述多肽 產(chǎn)品化學(xué)合成，尤其是通過該領(lǐng)域大家所公認(rèn)的固相合成技術(shù)，例如合成過程涉及與載體， 例如合成樹脂，結(jié)合的肽鏈逐步延伸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述多肽產(chǎn)品是唾液 素肽，例如唾液素-4,利拉魯肽（Liraglutide)或利西拉肽（AVE0010)。多肽產(chǎn)品進(jìn)一步的 例子是胰島素和胰島素類似物或DPP-4抑制劑。更優(yōu)選地，所述肽產(chǎn)品是唾液素肽，例如包 含有氨基酸序列S-S-G-A的唾液素肽，最優(yōu)選為利西拉肽（AVE0010)。
[0030] 本發(fā)明涉及多肽產(chǎn)品合成后其中雜質(zhì)的定量測(cè)定，例如通過固相合成法合成后或 儲(chǔ)存中的降解產(chǎn)品。所說雜質(zhì)通常都多肽雜質(zhì)，例如，和期望的多肽產(chǎn)品相差至少一個(gè)氨基 酸結(jié)構(gòu)單元和/或化學(xué)修飾的多肽。例如，雜質(zhì)可能是與期望的多肽產(chǎn)品相差至少一個(gè)二 聚氨基酸結(jié)構(gòu)單元，例如一個(gè)Di-serine或Di-alanine結(jié)構(gòu)單元。在唾液素肽例子中，例 如一個(gè)唾液素肽含有S-S-G-A氨基酸序列，雜質(zhì)可能是例如一個(gè)Di-Ser (33)-唾液素肽，一 個(gè)Di-Ala (35)-唾液素肽或它們的組合。在利西拉肽的例子中，雜質(zhì)可能是例如Di-Ser (3 3)-AVEOO10, Di-Aia (35)-AVEOO10 或它們的組合。
[0031] 本發(fā)明的方法包括定量測(cè)定多肽產(chǎn)品組合物中至少一種雜質(zhì)。多肽產(chǎn)品組合物包 含至少一種多肽產(chǎn)品和至少一種需要定量的雜質(zhì)。進(jìn)一步，多肽產(chǎn)品組合物可含有其他成 分，例如包括雜質(zhì)的肽類或非肽類成分。多肽產(chǎn)品組合物可以是例如藥物制劑或用于生產(chǎn) 藥物制劑，例如批量合成的多肽產(chǎn)品。
[0032] 本發(fā)明的方法中，多肽產(chǎn)品包含至少一種未知量的雜質(zhì)，該雜質(zhì)不能通過色譜方 法與多肽產(chǎn)品定量分離，或者和多肽產(chǎn)品樣品中的其他雜質(zhì)或成分共洗脫。在一些例子中， 多肽產(chǎn)品組合物含有一種未知量的雜質(zhì)。在另一些例子中，多肽產(chǎn)品混合含有至少兩種，例 如2, 3,4, 5,或更多種，這些未知量的雜質(zhì)不能通過色譜方法與多肽產(chǎn)品定量分離，或者可 與多肽產(chǎn)品樣品中其他雜質(zhì)或成分共洗脫。優(yōu)選地，該至少一種雜質(zhì)不能與多肽產(chǎn)品定量 分離。
[0033] 術(shù)語"色譜方法"涉及適合用于多肽產(chǎn)品純化的任一種色譜方法，包括例如：離子 交換層析，疏水相互作用層析，親和層析，尺寸排阻色譜法，尤其是高效液相色譜（HPLC)，更 尤其是反相HPLC，或者幾種方法的組合。
[0034] 本發(fā)明的方法所確定的雜質(zhì)不能與多肽產(chǎn)品或該組合物的其它成分定量分離。這 意味著，色譜分離步驟之后，雜質(zhì)與期望的多肽產(chǎn)品或其他雜質(zhì)或成分共洗脫或基本上共 洗脫，尤其是在上述的色譜分離過程后更是如此，以至通過光學(xué)分析方法定量，例如紫外或 熒光檢測(cè)是不可能的。這意味著，通過合理的努力，該雜質(zhì)依然不能與期望的多肽產(chǎn)品或其 它成分分離，它在給定批次的多肽產(chǎn)品組合物中的含量需要通過本發(fā)明的方法定量測(cè)定。
[0035] 本發(fā)明的方法步驟a提供一種多肽產(chǎn)品組合物，其含有至少一種未知量的雜質(zhì)， 這種雜質(zhì)不能通過上述色譜方法與組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分分離。這種多肽產(chǎn)品可 能是例如藥物用途產(chǎn)品，比如用于人獸醫(yī)療的藥物。
[0036] 本發(fā)明的方法步驟b涉及提供至少一種無上述雜質(zhì)添加的多肽產(chǎn)品組合物樣品， 及可選的至少另一種添加了已知量的上述雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物樣品。在一個(gè)優(yōu)選的是實(shí) 施例中，步驟b涉及提供至少三份多肽產(chǎn)品組合物樣品，其中第一份樣品含未添加所述雜 質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物，并且其中至少兩份另外的樣品含有分別添加了不同已知量的上述雜 質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物。
[0037] 至少一個(gè)樣品是指未添加雜質(zhì)的包含多肽產(chǎn)品組合物的樣品，即未加標(biāo)樣品，含 有未知量的待測(cè)定雜質(zhì)。除了這個(gè)樣品，提供至少一份，例如兩份，三份，四份另外的樣品， 這些樣品為加標(biāo)樣品，包含有未知量雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物，以及另外添加的不同已知量 的待測(cè)定雜質(zhì)。這些加標(biāo)樣品可以通過向未加標(biāo)多肽產(chǎn)品組合物樣品中添加雜質(zhì)來制備， 雜質(zhì)來自雜質(zhì)備用品，優(yōu)選通過至少兩個(gè)包含不同濃度的雜質(zhì)備用品制備。雜質(zhì)備用品可 以是任何適當(dāng)?shù)男问剑绺苫蛞后w形式的制劑。優(yōu)選的備用品為儲(chǔ)存液。
[0038] 測(cè)試樣品包括含有未知量待測(cè)定雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品及可選的添加雜質(zhì)。這些化合 物以不同的濃度存在，允許通過質(zhì)譜方法分析。多肽產(chǎn)品的濃度變動(dòng)范圍很大?？梢允窃?0· OOl ?50mg/ml，優(yōu)選 0· 01-10mg/ml 或更優(yōu)選是 0· 02 - 5. Omg/ml，例如約 I. Omg/ml。在 加標(biāo)樣品，加入的雜質(zhì)量?jī)?yōu)選為樣品中多肽產(chǎn)品濃度的〇. I %?5%，優(yōu)選是0. 1-2%。
[0039] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括：對(duì)一個(gè)未加標(biāo)的多肽產(chǎn)品樣品進(jìn)行 檢測(cè)，同時(shí)對(duì)至少一份，優(yōu)選是至少兩份，三份或四份或更多的用至少一種雜質(zhì)加標(biāo)的樣品 進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)不同的實(shí)施例中，本發(fā)明的方法涉及僅對(duì)一個(gè)加標(biāo)多肽產(chǎn)品樣品進(jìn)行檢 測(cè)。未加標(biāo)樣品中的未知量雜質(zhì)可以通過參考加標(biāo)樣品的測(cè)量來確定，和/或通過比較未 加標(biāo)樣品中雜質(zhì)測(cè)量值與參照系，例如標(biāo)準(zhǔn)或校正曲線來確定。
[0040] 本發(fā)明的方法步驟c包括通過高分辨率質(zhì)譜定量測(cè)定所述步驟b中至少一份樣品 中的雜質(zhì)。除了質(zhì)譜法，測(cè)定方法可包括一個(gè)前期的色譜方法，比如為了使其他雜質(zhì)與組合 物中的多肽產(chǎn)品或其他成分分離。優(yōu)選質(zhì)譜分析結(jié)合HPLC。每個(gè)樣品可能要經(jīng)過幾次獨(dú)立 測(cè)定，以提高測(cè)量的精確度。
[0041] 質(zhì)譜是建立在測(cè)定帶電粒子的質(zhì)荷比基礎(chǔ)上的。在一個(gè)典型的質(zhì)譜過程中，樣品 被加載到質(zhì)譜分析儀上并氣化。樣品組分被電離，所得離子在質(zhì)量分析器中被電磁場(chǎng)分 離。所得離子的探測(cè)信號(hào)被處理成質(zhì)譜。對(duì)多肽產(chǎn)品的電離，電噴霧電離（ESI)和基質(zhì)輔 助激光解吸/電離（MLDI)都可以使用。所得離子可以通過高度敏感的方法進(jìn)行探測(cè)，例 如軌道講（Orbitrap)或傅里葉變換（FT) -離子回旋共振（Fourier Transform(FT)-Ion Cyclotron Resonance) (ICR)探測(cè)系統(tǒng)。
[0042] 根據(jù)步驟c，至少一個(gè)與待測(cè)定雜質(zhì)關(guān)聯(lián)的峰通過質(zhì)譜法進(jìn)行分析。這個(gè)峰可以 是源自去卷積或非去卷積質(zhì)譜。優(yōu)選地，該方法涉及與待測(cè)定雜質(zhì)相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)單 一同位素峰的判定。在雜質(zhì)是Di-Ser (33)-AVE0010的情況下，在非去卷積質(zhì)譜中例如位于 1237. 1529Da的四重帶電峰或去卷積質(zhì)譜中位于4944. 5822Da的四重帶電峰都可以應(yīng)用。 在雜質(zhì)是Di-Ala (35)-AVE0010的情況下，在非去卷積質(zhì)譜中例如位于1233. 1550Da的四重 帶電峰或去卷積質(zhì)譜中位于4928. 5908Da的四重帶電峰都可用于分析。
[0043] 應(yīng)用上述高分辨率設(shè)置和高靈敏度探測(cè)，可以在質(zhì)譜中確定所述的至少一個(gè)需要 進(jìn)行分析的雜質(zhì)峰。
[0044] 步驟d包括基于所述質(zhì)譜分析結(jié)果計(jì)算多肽產(chǎn)品組合物中雜質(zhì)的含量。在一個(gè)更 優(yōu)的實(shí)施例中，計(jì)算可以通過包括回歸分析的方法，尤其是線性回歸的方法來完成。回歸分 析可以包括：從至少兩份加標(biāo)樣品，即含未知量雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物并分別添加了不同 已知量雜質(zhì)的兩份樣品，從它們的雜質(zhì)測(cè)量值生成一條曲線，例如一條直線（或從標(biāo)準(zhǔn)或 校正測(cè)量產(chǎn)生的此類樣品的參考值）。在這條曲線上，比如一條直線，插入非加標(biāo)樣品中雜 質(zhì)的測(cè)量值，并以此定量測(cè)定樣品中未知量雜質(zhì)的含量。
[0045] 優(yōu)選地，通過如下線性直線方程來計(jì)算：
[0046] y = ax+b
[0047] 其中，y對(duì)應(yīng)于樣品中雜質(zhì)的測(cè)定的峰面積（可以是加標(biāo)或未加標(biāo)樣），X對(duì)應(yīng)于 加標(biāo)樣品中雜質(zhì)的已知添加量，a是直線的斜率，b是直線與y軸截距，對(duì)應(yīng)于未添加雜質(zhì)的 樣品中雜質(zhì)的測(cè)量信號(hào)（X = O)。未加標(biāo)樣品中的雜質(zhì)xt，可以使用如下獲得的回歸參數(shù) 定量：
[0048] xt = b · a-1
[0049] 本發(fā)明還包括一種試劑盒，用于測(cè)定利西拉肽產(chǎn)品中的雜質(zhì)含量，包括至少一種 Di-Ser(33)-AVE0010和/或Di-Ala(35)-AVE0010備用品，及可選的進(jìn)一步試劑例如溶 齊U，緩沖液等。試劑盒可作為利西拉肽產(chǎn)品的一種質(zhì)量控制方法，測(cè)定利西拉肽產(chǎn)品中的 Di-Ser (33)-AVE0010和/或Di-Ala (35)-AVE0010含量。優(yōu)選地，定量測(cè)定通過質(zhì)譜方法來 完成，比如上述質(zhì)譜方法。
[0050] 本發(fā)明通過以下圖表和實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)行解釋。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0051] 圖 1 顯示了利西拉肽（AVE0010)，Di-Ser(33)-AVE0010 和 Di-Ala(35)-AVE0010 在 高效液相色譜中的共洗脫峰。
[0052] 圖 2 顯示了利西拉肽（AVE0010)及雜質(zhì) Di-Ser (33)-AVEOO10 和 Di-Ala (35)-AVEOO10的四重帶電分子離子質(zhì)譜。
[0053] 圖3顯示了非加標(biāo)和加標(biāo)（每種雜質(zhì)1% )的AVEOO10制劑的質(zhì)譜比較。
[0054] 圖 4 顯示了 Di-Ser (33)-AVE0010 在 m/z400 時(shí)，分辨率在 6, 000 和 100, 000 時(shí)各 自的質(zhì)譜范圍放大視野及重疊物質(zhì)的理論計(jì)算模型。
[0055] 圖5顯示了重疊物質(zhì)的理論計(jì)算模型的去卷積質(zhì)譜。
[0056] 圖6顯示了用于定量Di-Ser (33)-AVE0010的雜質(zhì)峰的放大視野。
[0057] 圖7顯示了一個(gè)檢驗(yàn)樣品中的Di-Ser(33)-AVE0010和Di-Ala(35)-AVE0010的四 重帶電離子同位素的提取單離子色譜被顯示為非去卷積質(zhì)譜。
[0058] 圖8顯示了一個(gè)檢驗(yàn)樣品中的Di-Ser(33)-AVE0010和Di-Ala(35)-AVE0010的四 重帶電離子同位素的提取單離子色譜被顯示為去卷積質(zhì)譜。
[0059] 圖9顯示了計(jì)算一個(gè)檢驗(yàn)樣品中雜質(zhì)Di-Ala(35)_AVE0010濃度的例子。 實(shí)施例
[0060] Di-Ser (33)-利西拉肽和Di-Ala (35)-利西拉肽通過HPLC/S的定量分析方法。
[0061] 1.材料與方法
[0062] I. 1相關(guān)材料
[0063] 利西拉肽（AVE0010)相關(guān)材料：通過固相合成，隨后進(jìn)行純化。
[0064] Di-Ser (33)-AVE0010相關(guān)材料：通過兩步偶聯(lián)的33位的絲氨酸保護(hù)固相合成，隨 后進(jìn)行純化。
[0065] Di-Ala(35)-AVE0010相關(guān)材料：通過兩步偶聯(lián)的35位的丙氨酸保護(hù)固相合成，隨 后進(jìn)行純化。
[0066] 利西拉肽的未加標(biāo)樣品試劑（含有未知量的雜質(zhì)Di-Ser (33) -AVEOO10和 Di-Ala(35)-AVE0010)制備濃度為l·0mg利西拉肽/ml。
[0067] 四個(gè)加標(biāo)樣品試劑中雜質(zhì)Di-Ser (33)-AVE0010或Di-Ala(35)-AVE0010的濃度 為：分別為L(zhǎng)Omg利西拉肽/ml試劑質(zhì)量的0.2% ,0.4% ,0.6%和0.8%。
[0068] L 2分析條件
[0069] 一個(gè)梯度高效液相色譜系統(tǒng)包括：二元HPLC泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，和一個(gè)高分 辨率質(zhì)譜儀，例如m/z400分辨率在100, 000的LTQ-Orbitrap (ThermoFisher)，或其等效者。 [0070] 由C18反相HPLC分析柱（Jupiter C18 3um 300A)進(jìn)行色譜，其長(zhǎng)度為150mm，內(nèi) 徑為2. Omm。
[0071] 流動(dòng)相A包含850體積單位的水，150體積單位的乙腈和1體積單位的三氟乙酸。 流動(dòng)相B包含250體積單位的水，750體積單位的乙腈和1體積單位的三氟乙酸。濃度梯度 設(shè)置如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于定量測(cè)定存在于多肽產(chǎn)品組合物中的雜質(zhì)的方法，包括下列步驟： a. 提供一種多肽產(chǎn)品組合物，其包含一個(gè)多肽產(chǎn)品和至少一種未知量的雜質(zhì)，其中所 述雜質(zhì)不能通過色譜方法與組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分相分離； b. 提供至少一種無上述雜質(zhì)添加的多肽產(chǎn)品組合物樣品，及可選的至少另一種添加了 已知量的上述雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品組合物樣品； c. 通過質(zhì)譜法定量測(cè)定b步驟所述樣品中的所述雜質(zhì)； d. 基于步驟c的結(jié)果，計(jì)算多肽產(chǎn)品組合物中所述雜質(zhì)的量。
2. -種用于定量測(cè)定存在于多肽產(chǎn)品組合物中的雜質(zhì)的方法，包括下列步驟： a. 提供一種多肽產(chǎn)品組合物，其包含一個(gè)多肽產(chǎn)品和至少一種未知量的雜質(zhì)，其中所 述雜質(zhì)不能通過色譜方法與組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分相分離； b. 提供至少三份多肽產(chǎn)品組合物樣品，其中第一份樣品含未添加所述雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品 組合物，并且其中至少兩份另外的樣品含有分別添加了不同已知量的上述雜質(zhì)的多肽產(chǎn)品 組合物； c. 通過質(zhì)譜法定量測(cè)定b步驟所述樣品中的所述雜質(zhì)，及 d. 基于步驟c的結(jié)果，計(jì)算多肽產(chǎn)品組合物中所述雜質(zhì)的量。
3. 如權(quán)利要求1或2的所述方法，其中的多肽產(chǎn)品具有5到100個(gè)長(zhǎng)度的氨基酸。
4. 如權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其中的多肽產(chǎn)品通過化學(xué)方法合成，尤其是 通過固相合成或通過重組DNA途徑生產(chǎn)。
5. 如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽產(chǎn)品組合物為藥物制劑或用 于生產(chǎn)藥物制劑的組合物。
6. 如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽產(chǎn)品是一種唾液素多肽，尤其是利 西拉肽（AVE0010)。
7. 如權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其中雜質(zhì)是多肽雜質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中雜質(zhì)不能通過高效液相色譜（HPLC)， 尤其是通過反相HPLC的方法與該組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分定量分離。
9. 如權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽產(chǎn)品包含至少2種未知量的雜質(zhì)， 該雜質(zhì)不能通過色譜方法與該組合物的多肽產(chǎn)品或另一種成分定量分離。
10. 如權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的方法，將雜質(zhì)加入到至少一個(gè)多肽產(chǎn)品組合物樣 品中，該樣品來自備用品，優(yōu)選的，來自含有不同濃度雜質(zhì)的至少兩種備用品。
11. 如權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，提供至少3個(gè)或4個(gè)其它添加了不 同已知量雜質(zhì)的樣品，并進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。
12. 如權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述質(zhì)譜法是高分辨率質(zhì)譜法，如 包括傅立葉變換質(zhì)譜法。
13. 如權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的方法，其中計(jì)算包括線性回歸分析方法。
14. 權(quán)利要求13所述的方法，其中計(jì)算通過以下方程進(jìn)行： y = ax+b 其中a =斜率 y =樣品中雜質(zhì)的測(cè)定的峰值面積 X =樣品中雜質(zhì)的添加量 b =截距 雜質(zhì)的未知量xt可通過以下方程求得 xt = b · a-1
15. -種用于測(cè)定利西拉肽（AVE 0010)產(chǎn)品組合物中雜質(zhì)含量的試劑盒，包括 (i) 至少一種Di-Ser (33) -AVE0010備用品，和/或 (ii) 至少一種 Di-Ala(35)-AVE0010 備用品
16. -種用于含有唾液素多肽產(chǎn)品的組合物質(zhì)量控制的方法，唾液素多肽產(chǎn)品中有 S-S-G-A氨基酸序列，優(yōu)選的該組合物包括利西拉肽（AVE0010)產(chǎn)品，該方法也包括定量測(cè) 定上述組合物中的 Di-Ser (33)-肽，如 Di-Ser (33) -AVE0010 和 / 或 Di-Ala (35)-肽，如 Di-Ala(35)-AVE0010。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的方法進(jìn)行定量測(cè) 定。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104246508SQ201380020553
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月27日
【發(fā)明者】M·沃格爾, W·米勒 申請(qǐng)人:賽諾菲-安萬特德國(guó)有限公司