用于從溶液濃縮顆粒的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于濃縮懸浮在液體中的顆粒（例如，細菌、病毒、細胞和核酸）的方法和系統(tǒng)。電場感應(yīng)力將顆粒驅(qū)向浸在液體中的第一電極。當顆?？拷ɡ缃佑|）第一電極時，從液體中撤出電極，撤出的電極與液體表面之間形成的毛細管作用力將顆粒固定在電極上。當從液體撤出電極時，之前浸入液體的電極部分具有固定在其表面上的顆粒。
【專利說明】用于從溶液濃縮顆粒的方法和系統(tǒng)
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00980127572.3、申請日為2009年6月8日、發(fā)明名稱為“用于從溶液濃縮顆粒的方法和系統(tǒng)”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]交叉參考相關(guān)申請
[0003]本申請要求2008年6月6日提交的美國臨時申請61/059708和2008年10月27日提交的美國臨時申請61/108799的權(quán)益，所述申請各自以其全文通過引用合并入本文。
[0004]政府許可權(quán)的申明
[0005]本發(fā)明是在國家科學基金會撥給的基金號0740525下和在由疾病控制中心撥給的基金號200-2007-M-22794下由政府資助進行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0006]背景
[0007]結(jié)核病(TB)，當今全球傳播最廣的疾病之一，已感染了三分之一的世界人口。在2006年，報導了九百二十萬例新TB病例，一百七十萬例涉及死亡，大部分發(fā)生在發(fā)展中國家。在2006年，在美國報導了大約15，000例新TB病例。因為具有活動但未治療的TB的患者每年可傳染平均10至15人，因此新TB患者的快速診斷是有效控制該疾病所必需的。
[0008]目前，存在多種用于TB診斷的技術(shù)。然而，可供利用的方法都不具有低檢測限、分析時間和成本的優(yōu)良組合。具有低檢測限的此類技術(shù)非常費時，而相對快速的檢測又具有高檢測限并且通常需要通過(慢)測試來最終確認。盡管存在用于檢測TB的成熟技術(shù)，但仍然需要改進的檢測方法來在全球范圍內(nèi)對付該疾病。
[0009]另一種目的分析物是細胞外DNA，其在疾病診斷學和環(huán)境分子生物學領(lǐng)域中是極其吸引人的。與活細胞中的基因組DNA不同，細胞外DNA是從瀕死細胞釋放的游離DNA。因此，體液中循環(huán)的細胞外DNA可用作不同急性病例如癌癥的早期指示劑。例如，健康人的細胞外DNA的濃度為大約30ng/mL，但對于癌癥患者其濃度增加至大約300ng/mL。
[0010]為了進行環(huán)境監(jiān)控，溶解在湖泊和土壤中的細胞外DNA是環(huán)境質(zhì)量的指示劑，因為溶解的DNA是由細胞裂解和活生物體的排泄物產(chǎn)生的。
[0011]盡管極具吸引力，但細胞外DNA的研究受到目前利用的標準樣品制備方法的阻礙。常規(guī)方法從粗制樣品過濾、離心和收集DNA開始。樣品制備過程通常需要數(shù)小時，這可降解和突變細胞外DNA。結(jié)果，細胞外DNA的原始信息在分析前就部分或完全丟失。因此，可濃縮細胞外DNA的快速方法對于鑒定病原體信息是非常重要的。
[0012]TB和細胞外DNA的上述實例是科學上重要的分析物，目前使用較慢的、低效的和不足的方法檢測其。用于從溶液提取顆粒分析物例如TB和DNA的改進方法將通過改善用于疾病例如TB和癌癥的測試的效率、成本和準確性而為全球衛(wèi)生提供極大的益處。
[0013]概述
[0014]在一個方面，提供了用于濃縮顆粒的方法，其包括將具有高高寬比(aspectratio)的第一電極浸入含有顆粒的液體，其中第一電極包含具有桿緯向尺寸(shaftlatitudinal dimension)的桿和具有遠端諱向尺寸(distal latitudinal dimension)的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米；通過使用該第一電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力來將顆粒驅(qū)向第一電極；和利用毛細管作用力(通過從液體撤出第一電極而在第一電極與液體之間形成的)將顆粒固定在第一電極的表面上。
[0015]在另一個方面，提供了顆粒濃縮系統(tǒng)，其包含具有高高寬比的第一電極，其中第一電極包含具有桿諱向尺寸的桿和具有遠端諱向尺寸的末端，其中所述遠端諱向尺寸為I納米至I毫米，第一液體包含第一顆粒；執(zhí)行器，所述執(zhí)行器的大小和構(gòu)造適于用來將第一電極浸入第一液體和從其中撤出，以便在抽出的第一電極與第一液體之間形成的毛細管作用力將第一顆粒固定在第一電極的表面上；和電信號發(fā)生器，所述電信號發(fā)生器的大小和構(gòu)造設(shè)計為利用第一電極產(chǎn)生電感應(yīng)力，以便當將第一電極浸入第一液體時，優(yōu)先將第一顆粒驅(qū)向第一電極。
[0016]在另一個方面，提供了用于濃縮顆粒的方法，其包括:將具有高高寬比的第一電極浸入含有顆粒的液體中，其中所述第一電極包含具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米；和通過使用第一電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力來將顆粒驅(qū)向第一電極。
[0017]附圖概述
[0018]當結(jié)合附圖參考下列詳細描述時，本發(fā)明的上述方面和許多相伴的有利方面將變得更容易理解和領(lǐng)會，其中:
[0019]圖1A是本發(fā)明代表性實施方案的一部分的圖解說明，所述實施方案包括通過由第一電極產(chǎn)生的電場感應(yīng)介電泳力驅(qū)動的液體中顆粒向第一電極的基本上線性的運動；
[0020]圖1B是圖1A中舉例說明的本發(fā)明代表性實施方案的一部分的圖解說明，其中從液體中撤出第一電極，并且作為毛細管作用力固定顆粒的結(jié)果，第一電極使顆粒從液體濃縮在其表面上，所述顆粒通過電場感應(yīng)介電泳力被吸引至第一電極；
[0021]圖2是本發(fā)明代表性實施方案的一部分的圖解說明，所述實施方案包括通過電場感應(yīng)電滲力驅(qū)動的液體中顆粒向第一電極的循環(huán)運動；
[0022]圖3是本發(fā)明代表性實施方案的一部分的圖解說明，所述實施方案包括液體中顆粒上介電力和電滲力的組合驅(qū)動顆粒朝向第一電極，所述第一電極包含能夠結(jié)合附著至顆粒的第二結(jié)合伴侶的第一結(jié)合伴侶；
[0023]圖4A和4B是可用于本發(fā)明的由碳化硅和碳納米管制造的代表性第一電極的顯微照片；
[0024]圖4C和4D是可用于本發(fā)明的涂有聚合物的第一電極的顯微照片；
[0025]圖5A-5C是在進行本發(fā)明的方法后由碳化硅和碳納米管制造的并且具有固定在其表面上的聚合物顆粒的代表性第一電極的顯微照片；
[0026]圖6A-6C是具有DNA固定在其表面上的本發(fā)明代表性第一電極的顯微照片；
[0027]圖6D是通過本發(fā)明的方法分析的一系列DNA溶液的DNA濃度對熒光強度的圖；
[0028]圖7是通過本發(fā)明的方法分析的一系列DNA和細胞的溶液的DNA濃度對熒光強度的圖；
[0029]圖8A是具有TB細胞固定在其表面上的第一電極的顯微照片；
[0030]圖8B是通過本發(fā)明的方法分析的一系列TB溶液的TB細胞濃度對熒光強度的圖；
[0031]圖9A是比較參照溶液和含有TB的溶液中第一電極的外施電壓和測量的電流的圖；
[0032]圖9B是通過本發(fā)明的方法分析的一系列包含TB的溶液的TB細胞濃度對標準化電流的圖；
[0033]圖10是具有DNA在其表面上雜交的第一電極和不具有DNA的參照第一電極的電壓對電流的圖；
[0034]圖1lA是使用本發(fā)明的方法進行DNA雜交的AC電壓對熒光的圖；
[0035]圖1lB是使用本發(fā)明的方法進行DNA雜交的DNA雜交時間對熒光的圖；
[0036]圖12是通過本發(fā)明的方法將HIV固定在其表面上的第一電極的顯微照片；
[0037]圖13A是第一電極在用于本發(fā)明方法之前的熒光顯微照片；
[0038]圖13B是圖13A中畫出的第一電極在進行本發(fā)明方法后的熒光顯微照片，其中HIV被固定在電極的表面上；
[0039]圖14是作用于固定在根據(jù)本發(fā)明電極上的顆粒的力的圖解說明；
[0040]圖15A是當顆粒被固定在從液體撤出的電極上時液體與不同大小的顆粒之間形成的臨界角的圖解說明；
[0041]圖15B是當顆粒被固定在從液體撤出的電極上時液體與不同大小顆粒之間形成的分離角(split angle)的圖；
[0042]圖16A是作用于固定在從液體撤出的電極上的顆粒的力的圖解說明；和
[0043]圖16B是固定在電極的側(cè)面上的多個顆粒的圖解說明。
[0044]發(fā)明詳述
[0045]在一個方面，提供了濃縮顆粒的方法，其包括將具有高高寬比的第一電極浸沒在含有顆粒的液體中，其中所述第一電極包含具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米；通過使用該第一電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力來驅(qū)動顆粒朝向第一電極；和利用通過從液體撤出第一電極而在第一電極與液體之間形成的毛細管作用力將顆粒固定在第一電極的表面上。
[0046]提供了用于濃縮懸浮于液體中的顆粒(例如，細菌、病毒、細胞和核酸)的方法和系統(tǒng)。電場感應(yīng)力驅(qū)動顆粒朝向浸入在液體中的第一電極。當顆粒緊靠(例如，接觸)第一電極時，從液體撤出電極并且撤出的電極與液體表面之間形成的毛細管作用力將顆粒固定在電極上。在從液體撤出電極時，顆粒被固定在之前浸入液體中的電極的部分上。取決于電極的幾何形狀，顆粒被固定在遠端尖端上、側(cè)面或兩者上。與溶液中的顆粒相比較，電極表面上的顆粒更密集地濃縮在電極上，從而改進了顆粒的分析(例如，通過熒光光譜法)。
[0047]除了濃縮顆粒以進行分析外，可進一步操作濃縮的顆粒。例如，可貯存電極上的顆粒以待將來使用(例如，使用低溫冰凍)或?qū)⑵湟氲诙后w(例如，將顆粒原位引入細胞內(nèi))。
[0048]如將在下文中進一步詳細描述的，本文中公開的方法和系統(tǒng)提供了用于就多種醫(yī)學相關(guān)分析物例如細菌(例如，結(jié)核)、病毒(例如，HIV)、細胞(例如，果蠅細胞)和核酸(例如，DNA和RNA)分析生物流體的簡單、快速和廉價的方法。
[0049]例如，已顯示本發(fā)明的方法通過將TB細菌濃縮和固定在電極上并且用熒光光譜法分析該細菌而在10分鐘內(nèi)直接從人痰中檢測結(jié)核病(TB)。目前接受的檢測TB的方法，即Ziehl-Neelsen涂片試驗，通常需要多至3天來完成。因此，在該示例性實施方案中，本發(fā)明提供了顯著改進的TB檢測；另外的實施方案提供了用于檢測其他疾病的相似能力。
[0050]所述方法從將第一電極浸入含有顆粒的液體中開始。液體通常包含許多顆粒并且顆粒通常是分析物，例如細菌、病毒或待檢測的其他靶分子。
[0051]第一電極是用導電材料例如金屬、摻雜半導體或?qū)щ娋酆衔镏圃斓?。金屬涂層的絕緣體也可用于該方法，只要可使用第一電極產(chǎn)生足夠的電場以產(chǎn)生如下所述的電場感應(yīng)力即可。
[0052]如本文中使用的,術(shù)語關(guān)于第一電極的〃高寬比(aspect ratio) 〃意指第一電極的直徑(例如，遠尖端的直徑)與浸沒在液體中的第一電極的長度的比率。如果電極是圓錐形的，那么電極的平均直徑是第一電極的直徑的估計。
[0053]所述第一電極具有高的高寬比，以便提供相對大的浸沒在液體中的表面積。對于具有高高寬比的第一電極，遠尖端的直徑小于1_，從而提供了相對小的面積用于在進行該方法過程中產(chǎn)生高強度電場。例如，在一個示例性實施方案中，第一電極的高高寬比提供了足以吸引DNA至使用DEP的電極的強電場。在一個實施方案中，高的高寬比具有1:1至1:100的直徑:長度比。
[0054]在一個實施方案中，所述第一電極包括尖端(tip),其中第一電極的尖端是第一電極的遠末端并且終止于單個點。第一電極尖端可以是圓錐形的、圓形的或截斷的。在一個實施方案中，該遠末端是被截斷的并且不具有終止于單個點的尖端。
[0055]第一電極包括具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠端尖端。對于圓錐形尖端，遠端緯向尺寸比桿緯向尺寸小。對于不具有尖端的圓柱形第一電極，兩種緯向尺寸是相等的。
[0056]可改變第一電極的形狀以適合特殊應(yīng)用。尖端的幾何形狀將決定第一電極上通過本發(fā)明的方法優(yōu)先固定顆粒的位置。例如，具有截斷的遠末端的圓柱形第一電極將傾向于將顆粒濃縮在與圓柱形的截斷遠末端相對的圓柱體側(cè)面上。
[0057]術(shù)語“納米尖端”和“微尖端(miCTotip)”在本文中用于描述分別具有小于大約I微米的直徑和大于大約I微米的直徑的第一電極。
[0058]所述液體是能夠懸浮或溶解顆粒的任何液體。代表性液體包括水、有機溶劑和離子性溶劑。該方法的液體可以是溶液或懸浮液，并且代表性液體包括生物流體，例如血液、痰、粘液和唾液。生物流體特別地通常是高度復雜的，并且包含許多顆粒，包括細菌、細胞、蛋白質(zhì)、DNA和其他實體。在本發(fā)明的一個實施方案中，將第一電極直接浸入從活生物體提取的生物流體例如血液樣品、粘液樣品、唾液樣品或痰樣品中。使用本發(fā)明的方法將特定的分析物顆粒例如結(jié)核病細菌濃縮和固定在第一電極上。在一個實施方案中，在從該活生物體提取和測試之間處理所述生物流體。這樣的處理可包括酸和/或堿處理、稀釋、化學處理、加熱/冷卻或制備可用于本方法的樣品所必需的其他處理步驟。然而，與一些已知的用于檢測例如結(jié)核病細菌的方法相比較，本發(fā)明的一個好處是不需要或只需要極少的生物流體制備來進行本發(fā)明的方法，然而對于已知的方法而言需要樣品的大量處理。
[0059]將第一電極浸入液體中以使電極靠近待固定的顆粒。將第一電極完全或部分浸入液體。所述方法通過第一電極產(chǎn)生驅(qū)動顆粒朝向第一電極表面的電場感應(yīng)力而持續(xù)進行。電場感應(yīng)力是從第一電極延伸并且作用于顆粒的電動力或介電動力(dielectrokineticforce)。代表性的電場感應(yīng)力包括介電泳、電滲流、電泳和其組合。在一個實施方案中，在第一電極與和液體接觸的第二電極之間產(chǎn)生所述電場感應(yīng)力。電場感應(yīng)力通常需要第一電極和第二電極來產(chǎn)生該力。第一電極與液體接觸，因為其被浸入液體中。第二電極也與該液體接觸，其可以是插入液體的電極或可以是所述液體的支持物，如將針對圖1A-3進一步論述的。
[0060]第一電極的緯向截面可具有任何形狀。代表性的形狀包括圓形、三角形和正方形截面。圓錐形電極特別有用，因為可用于制造本發(fā)明的第一電極的普通微米或納米尺寸制造方法產(chǎn)生圓錐形電極(例如，將中尺寸的導線切割成點或?qū)⒓{米導線裝配成圓錐形結(jié)構(gòu))。代表性的第一電極還包括一些幾何形狀的截面(例如，正方形)，其然后在逐漸變細的遠末端(“尖端”)截斷，例如在圓錐形或半球形尖端截斷的圓形截面導線。
[0061]可用于本發(fā)明方法的電場感應(yīng)力對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且將只在本文中進行簡要描述。介電泳(DEP)是其中顆粒中的被誘導偶極子導致顆粒至高或低電勢的吸引或排斥(基于DEP效應(yīng)是正DEP還是負DEP)的介電力(dielectric force)。通常將交流電用于驅(qū)動DEP力。在本文中所述的實施方案中，正DEP通常用于將顆粒吸引至第一電極的表面。
[0062]電滲在液體中產(chǎn)生流動，所述流動通過導致顆粒濃縮的曳力(drag force)而將顆粒運輸至第一電極。當將AC場施加于第一電極時，在第一電極的表面上形成離子層。電極(和所得的雙層)的電荷的符號根據(jù)電勢交替而改變。在這樣的情況下，在對表面的切向上產(chǎn)生帶電荷離子的靜電力，該靜電力引起AC電滲流。電場強度隨著離第一電極末端的距離增加而減小，流速在電極遠末端最大并且沿電極桿向上而快速減小。由于由第一電極上的場強引起非均勻流速，因此在液體中產(chǎn)生旋渦(其將顆粒濃縮在第一電極的附近)。
[0063]圖1A舉例說明其中將第一電極105浸入由第二電極115支持的液體110中的本發(fā)明代表性實施方案的簡圖。許多顆粒120懸浮在液體110中。將電信號發(fā)生器125有效地連接至第一電極105和第二電極155以在電極105和115之間施加AC和/或DC信號。依賴于電極105和115的形狀、來自電信號發(fā)生器125的施加的信號、顆粒120的電/介電性質(zhì)和液體110的電/介電性質(zhì),可產(chǎn)生幾個不同的電場感應(yīng)力來操縱顆粒120。圖1A舉例說明了顆粒120受DEP影響，從而在應(yīng)用電場后驅(qū)動顆粒120線性朝向第一電極105。箭頭130標示顆粒120上的力的方向，并且通常在第一電極105的方向上驅(qū)動整個溶液中的顆粒。
[0064]圖2是與圖1A的簡圖類似的簡圖，只是圖1A與圖2之間電場感應(yīng)力發(fā)生變化。在圖2中，由電信號發(fā)生器125在第一電極105與第二電極115之間產(chǎn)生的電場導致電滲流，如標示電場在液體110內(nèi)產(chǎn)生流動模式(所述模式在液體110中產(chǎn)生環(huán)形循環(huán)模式)的橢圓形205所舉例說明的。顆粒120受電滲流205影響，并且一些顆粒120被優(yōu)先驅(qū)向第一電極 105。
[0065]圖3舉例說明與圖1A和2中舉例說明的系統(tǒng)相似的系統(tǒng)。圖3舉例說明電滲流205和DEP130，并且還包括一層涂鋪第一電極105的表面的第一結(jié)合伴侶305。第一結(jié)合伴侶305優(yōu)先結(jié)合附著至顆粒120的第二結(jié)合伴侶。因此，圖3中舉例說明的系統(tǒng)中有3種力起作用，包括在液體中循環(huán)顆粒120的電滲流205 ;優(yōu)先驅(qū)動顆粒120朝向第一電極105的DEP130 ;和附著至第一電極105上的第一結(jié)合伴侶305，其優(yōu)先結(jié)合附著至顆粒120的第二結(jié)合伴侶。所產(chǎn)生的力在顆粒120通過液體110朝向第一電極105 (顆粒被濃縮在其表面上)的運動中累積到極值。
[0066]本文中公開的方法繼續(xù)進行使用在第一電極與液體之間形成的毛細管作用力(通過從液體撤出第一電極形成的)將分析物固定在第一電極表面的步驟。
[0067]圖1B舉例說明了圖1A中舉例說明的實施方案的圖解說明，其中已從液體110撤出第一電極105，并且液體110與第一電極105之間的界面上的毛細管作用沿著撤出的第一電極105的表面固定在該界面上捕獲的顆粒。例如，在圖1A中舉例說明了在第一電極105與液體110之間的界面上的顆粒120，在所述圖中為了清楚起見以夸張的方式舉例說明了表面張力。當從液體110撤出第一電極105時,界面上的表面張力將與第一電極105相鄰的顆粒120固定在第一電極105的表面上。圖1B舉例說明固定在撤出的第一電極105表面上的顆粒120’和其他顆粒120。
[0068]顆粒在第一電極從液體中撤出時被固定在其表面上。在從液體中撤出之前，電場感應(yīng)力和任選地結(jié)合伴侶相互作用驅(qū)動顆粒緊密靠近第一電極，并且在撤出時，這種與電極的密切靠近結(jié)合在電極和液體以及環(huán)境大氣之間的界面(固體-液體-氣體界面)上的毛細管作用力，在顆粒上產(chǎn)生了朝向第一電極表面的力。一旦顆粒被固定在電極上，在從液體中撤出時，多種力作用以將顆粒保持固定在第一電極的表面上，包括靜電力、毛細管作用力、化學鍵合和主動電動力(active electrical force)(例如，電信號繼續(xù)通過第一電極)。
[0069]從液體撤出電極的速度可影響固定在第一電極表面上的顆粒的大小和數(shù)量。撤出速度范圍為Ιμπι/秒至IOmm/秒。緩慢的撤出速度用于精確地控制毛細管作用，這可幫助測定捕獲的顆粒的大小和數(shù)量。較快的撤出速度可用于不需要精確操作的裝置(例如便攜式和/或一次性裝置)。
[0070]所述方法可用于固定比第一電極在固體-液體-氣體界面處的緯向尺寸(例如，直徑)小的顆粒。用于將顆粒固定在第一電極上的力的平衡通常是使得固定在第一電極的表面上的顆粒的直徑(假定為球狀顆粒)比第一電極的直徑(假定圓錐形或圓柱形的第一電極形狀)小。
[0071]對于圓錐形電極105，如圖1Α-3中所舉例說明的，第一電極的尖端的直徑沿著第一電極的圓錐形部分的長度變化。如圖1A和IB中舉例說明的，線150代表圓錐形第一電極在特定位置上的緯向直徑。從液體固定至第一電極上的顆粒120在直徑上將全都比第一電極在線150上的直徑小。圖1A和IB中舉例說明的圓錐形第一電極105的直徑梯度導致這樣的可能性，即在含有多個顆粒大小的液體110中使用這樣的第一電極105形狀將產(chǎn)生最大顆粒大小的梯度。為了獲得較窄的最大顆粒大小分布，可使用圓柱形第一電極。
[0072]球狀顆粒不是本發(fā)明的方法產(chǎn)生固定所必需的。使用球形來代表顆粒(例如在圖1Α-3中)和描述顆粒(例如，具有“直徑”的顆粒)是比較方便的。然而，除了專門形成的微球和納米球(例如，聚合物或無機納米球)外，在微米和納米尺寸上極少有球狀顆粒。在一個實施方案中，顆粒的至少一個維度小于第一電極的緯向直徑，從而電感應(yīng)力的合力、第一電極的大小和毛細管作用力一起將顆粒固定在第一電極的表面上。
[0073]在一個實施方案中，所述顆粒選自有機顆粒、無機顆粒、病毒、細菌、核酸、細胞和蛋白質(zhì)。本文中未引述的其他顆粒(包括生物顆粒)也與本文中描述的方法相容。
[0074]在一個實施方案中，所述病毒選自柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、EB病毒、單純皰疫病毒I型、單純皰疫病毒2型、人巨細胞病毒、人類皰疫病毒8型、水痘-帶狀皰疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、黃病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風疹病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、伊波拉病毒(ebola)、馬爾堡病毒(marburg)、漢塔病毒(hanta)、呼腸孤病毒(reovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncitial virus)、禽流感病毒和西尼羅病毒。在一個實施方案中，所述細菌選自結(jié)核病細菌(tuberculosis)、大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、沙門氏菌(salmonella)和綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)。在一個實施方案中,所述細胞是果蠅細胞。
[0075]在一個實施方案中，第一電極的纟韋向尺寸小于1_。在一個實施方案中，第一電極的緯向尺寸大于lnm。在一個實施方案中，第一電極的緯向尺寸為Inm至1_。如上所描述的，特定的第一電極的形狀，例如圓錐形電極，具有不斷變化的緯向尺寸，并且此實施方案的尺寸范圍是指測量的最小緯向尺寸，即電極的末端尖端。
[0076]在一個實施方案中，第一電極至少部分涂有表面涂層?？梢詾榱藥讉€目的涂鋪第一電極，包括在電極材料與顆粒和/或液體之間提供緩沖劑；對第一電極功能化以選擇性結(jié)合顆粒；和對第一電極功能化以選擇性排斥特定類型的顆粒(例如，不期望固定的顆粒)。
[0077]在一個實施方案中，表面涂層是單層或聚合物層。已知單層例如自裝配單層(SAM)提供了通過將特定分子類別接枝至表面來功能化該表面的途徑。例如，硫氫基與金之間的鍵對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是特別熟知的，因此，可用含硫氫基的分子對金第一電極功能化，以產(chǎn)生具有范圍從疏水性變化至親水性的表面性質(zhì)和此外定制的化學功能性的金第一電極。
[0078]聚合物層也可用于涂鋪第一電極。在一個實施方案中，所述聚合物是聚硅氧烷。示例性的聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其用作第一電極的導電材料與顆粒和液體之間的緩沖劑以保持第一電極材料的完整性。在一個示例性實施方案中，電極是由碳化硅(SiC)納米線和碳納米管(CNT)的雜化材料制造的。所述聚合物保護第一電極免受由于對液體的暴露而引起的降解，并且還阻止顆粒例如DNA與第一電極的CNT之間的非特異性結(jié)
八
口 ο
[0079]表面涂層至少部分涂鋪第一電極，并且，通常整個電極均被涂層覆蓋。然而，只選擇性涂鋪第一電極的部分可用于指導顆粒朝向或離開被涂鋪的或未涂鋪的第一電極的部分。
[0080]在一個實施方案中，表面涂層可增強顆粒在第一電極上的固定。由涂層產(chǎn)生的固定的增強可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何機制來實現(xiàn)。特別地，通過提供優(yōu)先結(jié)合具有相似的疏水或親水特征的顆粒的疏水或親水性涂層(例如，第一電極上的氟代烷烴涂層將通過疏水-疏水相互作用而優(yōu)先結(jié)合具有疏水特征的顆粒)。
[0081]在一個實施方案中，表面涂層包含第一結(jié)合伴侶，并且顆粒包含能夠結(jié)合第一結(jié)合伴侶的第二結(jié)合伴侶。此類結(jié)合伴侶的利用提供了當通過使用電場感應(yīng)力在液體中驅(qū)動顆?？拷谝浑姌O時第一電極與顆粒之間的結(jié)合。結(jié)合伴侶對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且包括化學結(jié)合伴侶、抗體-抗原伴侶、核酸結(jié)合(例如，DNA和/或RNA)、酶-底物結(jié)合、受體-配體結(jié)合、核酸-蛋白質(zhì)結(jié)合和細胞結(jié)合(例如，細胞、細胞膜或細胞器與細胞、細胞膜或細胞器的配體的結(jié)合)。下文中提供了本發(fā)明的方法中第一結(jié)合伴侶與第二結(jié)合伴侶的結(jié)合的幾個示例性實施方案。[0082]在將顆粒固定在第一電極上之后，可提供幾個任選的額外步驟以進一步處理濃縮的顆粒，包括固定顆粒的分析、貯存和釋放。在一個實施方案中，所述方法包括分析固定在第一電極的表面上的顆粒。
[0083]分析可在顆粒的固定之前、期間或之后進行。代表性的分析技術(shù)包括在第一電極浸沒時進行的技術(shù)(例如，電阻檢測)，和在溶液外進行的其他技術(shù)。代表性的分析技術(shù)包括電學、機械、光學和表面成像技術(shù)和其組合。在一個實施方案中，光學分析包括將發(fā)光化合物(例如，熒光標記物)連接至顆粒(例如，DNA分子)以提供發(fā)光顆粒和使用熒光顯微鏡和/或熒光光譜法檢測來自發(fā)光顆粒的發(fā)光的步驟。
[0084]可將固定的顆粒浸入含有與固定顆粒相互作用以產(chǎn)生特殊效應(yīng)(例如熒光)的化合物的第二液體中。例如，可將固定在電極上的DNA浸入含有當與DNA雜交時發(fā)熒光的分子的溶液中。在與DNA雜交后，DNA可通過熒光光譜法檢測。
[0085]用于分析物顆粒的電學檢測的代表性技術(shù)包括用于測量電容、電阻、電導、阻抗和其組合的技術(shù)。
[0086]所述方法還可以貯存第一電極以保存固定的顆粒。在一個代表性的實施方案中，貯存第一電極包括低溫冰凍以保存固定的顆粒。低溫冰凍任選包括在冷凍前將固定的顆粒浸入冷凍保護劑(例如，DMS0)?？杀４尜A存的顆粒以待將來使用上述技術(shù)進行分析，或可在更遲的時間進行進一步操作。
[0087]在一個實施方案中，所述方法還包括釋放固定的顆粒，例如將顆粒從第一電極釋放至溶液中，從而使這樣的溶液富含之前固定的顆粒。釋放固定的顆?？砂▽㈩w粒釋放入選自細胞、病毒和細菌的實體中。如下文中進一步描述的，所述方法可用于從一種溶液例如人血液樣品選擇性濃縮一種類型的顆粒(例如DNA)，然后從血液樣品收回第一電極上濃縮的DNA并且將DNA插入第二環(huán)境(例如，細胞)，將固定的DNA釋放入細胞中以提供富集DNA的第二樣品。可使用本文中描述的任意顆粒進行該選擇性連接、濃縮和釋放順序，因此，可通過固定和釋放所選擇的顆粒以形成期望的復合物來獲得分子和納米尺寸的構(gòu)造物。
[0088]可通過操作熱能、化學能、電能、機械能或其組合來實現(xiàn)固定和釋放。
[0089]在一個實施方案中，所述方法包括將相對大的顆粒(例如，細胞)固定在微尖端上和使用納米尖端固定來自該較大顆粒內(nèi)部的相對小的顆粒(例如，DNA)。
[0090]在一個實施方案中，產(chǎn)生電場感應(yīng)力包括確定表面涂層的方向。具體地，如果表面涂層是單層分子或薄層聚合物分子，那么提供該電場感應(yīng)力的電場可能傾向于將表面涂層的分子例如沿著電場線排列一并且該排列可通過提供定向和對齊的表面以在液體中吸引結(jié)合至顆粒的結(jié)合伴侶來促進第一結(jié)合伴侶與第二結(jié)合伴侶之間的結(jié)合。
[0091]在一個實施方案中，第一電極由通過美國專利申請案61/108799(以其全文通過引用合并入本文)中描述的方法形成的碳化硅納米線和碳納米管的雜化材料(CNT/SiC)組成。簡而言之，所述雜化材料由金屬材料(例如具有金涂層的鎢)的微米大小的尖端制造。使用超聲處理數(shù)小時將組合的碳納米管和碳化硅線分散在分開的容器中。在使用之前合并溶液并且超聲處理I小時。將微尖端插入合并的CNT/SiC溶液并且將AC電勢施加于該微尖端，然后以大約10 μ m/秒的速度撤出微尖端，這導致產(chǎn)生碳納米管束粘附、到碳化硅納米線上并與之連接在一起，如圖4A和圖4B的顯微照片中所舉例說明的。在圖4C和4D中舉例說明了涂鋪有PDMS的CNT/SiC電極。[0092]所述方法還提供了上述的單個第一電極濃縮器(concentrator)的多路形式(multiplexed version)。在該實施方案中，所述方法還包括將具有高高寬比的第三電極浸入含有所述顆粒的液體中；使用第三電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力以便液體中的顆粒被優(yōu)先驅(qū)向第三電極；和從液體撤出第三電極，以使得撤出的第三電極與液體之間形成的毛細管作用力將顆粒固定在第三電極的表面。第三電極與之前描述的實施方案中的第一電極類似?？扇芜x地將第四電極引入該實施方案的方法以便第一電極與第二電極配對，從而在液體中產(chǎn)生一個電場感應(yīng)力，以及第三與第四電極配對，從而在液體中產(chǎn)生另一個電場感應(yīng)力。在可選擇的實施方案中，將第一電極和第三電極浸入分開的液體實體內(nèi)(例如，第一電極存在于第一液體內(nèi)，并且第三電極存在于第二液體中)，其中各液體可包含相同或不同的顆粒。因此，可將幾個電極用于從單個液體實體或從多個液體實體濃縮顆粒，例如用于藥物候選物篩選或生物測試的平行測定中。此外，通過電極(例如第一電極)的表面功能化，可同時特異性固定和檢測和/或貯存多個類別，這可增加處理量以及減少檢測成本和時間。
[0093]在另一個方面，本發(fā)明提供了顆粒濃縮系統(tǒng)。在一個實施方案中，所述顆粒濃縮系統(tǒng)包括具有高高寬比和的第一電極；包含緯向尺寸小于第一電極的緯向尺寸的第一顆粒的第一液體；執(zhí)行器，所述執(zhí)行器的大小和構(gòu)造被設(shè)置成將第一電極浸入第一液體和從其撤出，以便在撤出的第一電極與第一液體之間形成的毛細管作用力將第一顆粒固定在第一電極的表面上；和電信號發(fā)生器，所述電信號發(fā)生器的大小和構(gòu)造被設(shè)置成用第一電極產(chǎn)生電感應(yīng)力，以便當將第一電極浸入第一液體時，優(yōu)先將第一顆粒驅(qū)向第一電極。
[0094]在上文中已通過參考本發(fā)明的方法描述了顆粒濃縮系統(tǒng)，并且這樣的方面如電極、液體和顆粒均適用于所述方法和系統(tǒng)。
[0095]其大小和構(gòu)造被設(shè)置成將第一電極浸入液體和從其中撤出的執(zhí)行器可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何執(zhí)行器，在一個優(yōu)選實施方案中，執(zhí)行器是機械執(zhí)行器例如壓電執(zhí)行器或可人工定位的執(zhí)行器(例如，顯微操作器)。執(zhí)行器具有能夠?qū)⒌谝浑姌O的一部分伸入液體和將整個第一電極從液體撤出以便可進一步操作或分析固定的顆粒的移動范圍。
[0096]電信號發(fā)生器可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何信號發(fā)生器，例如能夠?qū)C和/或DC信號傳遞至系統(tǒng)的第一和第二電極的發(fā)生器。
[0097]還預期包括另外的電極對的系統(tǒng)，并且各電極對的電信號和傳動可獨立于其他電極對或結(jié)合其他電極對來控制。
[0098]在另一個方面，提供了用于濃縮顆粒的方法，其包括:將具有高高寬比的第一電極浸入含有顆粒的液體，其中第一電極包含具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米；和通過使用第一電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力而將顆粒驅(qū)向第一電極。在本文中已就上述方面和實施方案描述了本實施方案的各種細節(jié)(例如，顆粒、電極材料和液體)。
[0099]在一個實施方案中，如上所述，使用電場感應(yīng)力將顆粒固定在第一電極的表面上。固定任選地包括如上所述的結(jié)合相互作用。在此實施方案中，電學檢測(例如，電阻測量)可用于檢測第一電極的表面上的結(jié)合事件，如本文中所描述的。
[0100]聚合物納米球的固定和大小選擇性
[0101]在此示例性的實施方案中，介電泳和毛細管作用力用于將聚苯乙烯納米球固定在電極上。將CNT/SiC電極(〃納米尖端〃)浸入含有納米球的水溶液，作為鎢線圈(用作第二電極)內(nèi)的2 μ L微滴形式支持著。在電極之間施加IOkHz的20VPP的AC電勢，并且納米尖端附近的聚苯乙烯球被產(chǎn)生的DEP力吸引至納米尖端。當以8 μ m/s的速度從溶液撤出時，球被固定在納米尖端上，如圖5A(450nm的球；525nm的尖端);圖5B(475nm的球；515nm的尖端)和圖5C(100nm的球,從IOOnm的球和6微米的球的混合物中捕獲在600nm的尖端上)中舉例說明的。圖5C舉例說明本發(fā)明的大小選擇性:固定比尖端直徑更少的球，然而不固定更大的球。
[0102]當電極被一簇球圍繞時，多顆粒相互作用可發(fā)生并且球被固定至尖端的側(cè)面，如圖5B中顯示的。圍繞電極的簇狀構(gòu)造(cluster formation)在納米球固定過程中產(chǎn)生，因為球被毛細管作用驅(qū)向固體-液體-氣體界面。球至界面的遞送可通過DEP力結(jié)合液體的蒸發(fā)和因毛細管作用而引起的壓縮力來產(chǎn)生。
[0103]除了幾何效應(yīng)和多顆粒相互作用效應(yīng)外，電極的表面性質(zhì)和電場效應(yīng)(例如電濕潤)可影響表面張力，從而影響起著固定顆粒作用的力的平衡。此外，還存在分子相互作用力(例如，范德瓦爾斯力)。因此，有幾個變量會影響導致顆粒固定在氣體-液體-固體介面上的條件，并且各顆粒系統(tǒng)、電感應(yīng)力、液體和環(huán)境條件將產(chǎn)生獨特的參數(shù)組合而固定靶顆粒?？勺顑?yōu)化實驗條件以優(yōu)先固定目的靶顆粒。
[0104]DNA的固定
[0105]在該示例性實施方案中，將DNA捕獲在電極上。在TRIS EDTA(乙二胺四乙酸)緩沖液中制備λ-DNA。通過使用CNT/SiC納米尖端和AC場，通過介電泳和毛細管作用將λ -DNA濃縮在電極上。圖6A-6C舉例說明了以小纖維的形式存在于納米尖端上的捕獲的λ -DNA分子。
[0106]通過將納米尖端浸入DNA溶液(濃度:500 μ g/mL)和從其中撤出，在尖端的末端形成了約400 μ m長的DNA纖絲。因為許多DNA分子存在于溶液中，因此當從溶液中撤出尖端時分子通過毛細管作用力形成纖絲。圖6A是納米尖端上的捕獲DNA的光學顯微照片，圖6B是相應(yīng)的熒光顯微照片(熒光由與PIC0GREEN?試劑混合的DNA產(chǎn)生)。圖6C是圖6A的樣品的電子顯微照片。
[0107]固定的DNA 的 EDS(能譜法，Energy Dispersive Spectroscopy)分析(加速電B:1OkV)鑒定了元素，包括C、N、0、Na、S1、P和Cl。C和Si源于SiC納米線和CNT。Na和Cl存在于緩沖溶液中。還檢測到DNA的元素C、N、O和P。特別是P，其是該系統(tǒng)中DNA所獨有的元素。因此，纖絲被確認為DNA。在不含DNA的對照樣品中未檢測到P。
[0108]檢查了純樣品和混合樣品的DNA固定。將具有不同濃度的DNA分子固定在納米尖端上。通過熒光顯微鏡檢查分析捕獲的DNA。以10為系數(shù)制備從lpg/mL(32aM)至I μ g/mL(32pM)的一系列DNA溶液濃度。圖6D是使用本發(fā)明方法測量的不同DNA濃度的熒光強度的圖。對于每一個DNA濃度重復實驗3次。將熒光強度與使用純PIC0GREEN?試劑測量的陰性對照相比較。用于該實驗實例的納米尖端的檢測限是10pg/mL(320aM)。
[0109]為了檢查從含有細胞的樣品混合物中大小特異性地捕獲DNA，將果蠅細胞與純λ -DNA分子混合在TRIS EDTA緩沖液中。制備的DNA濃度為0.67pg/mL (2IaM)至0.67 μ g/mL (2IpM)，10倍梯度。圖7是將具有從DNA/細胞混合物提取的固定DNA的電極的所檢測熒光強度與含有DNA但無細胞的溶液的重復組相比較的圖。所得的強度值表明DNA溶液中存在細胞并不影響所述方法的準確性。DNA分子被固定在納米尖端上，而細胞由于其更大的尺寸和相對更大的毛細管作用力將它們保持在液體中而留在溶液中。因為果蠅細胞的標準化直徑(?ομπι)比納米尖端直徑(544nm)大得多，因此細胞未被捕獲在納米尖端上。然而，在一個接下來的實驗中，使用AC電勢(20Vpp@5MHz)將細胞固定在直徑250 μ m的微尖端上。這種大小特異性捕獲使得能夠在粗制劑或最低限度處理的樣品中進行DNA檢測，從而無需純化樣品即可檢測DNA，而純化樣品是已知的DNA檢測方法所必需的。
[0110]還可使用本發(fā)明的方法檢測游離核酸(例如，循環(huán)或溶解的DNA)。循環(huán)DNA在疾病診斷和環(huán)境分子生物學領(lǐng)域特別引人注意。與正常細胞中的基因組DNA不同，循環(huán)DNA是從死亡細胞釋放的游離DNA。因此，在體液中循環(huán)的細胞外DNA可用作各種急性疾病例如癌癥的早期指征。例如，健康人的循環(huán)DNA的濃度為大約30ng/mL，但對于癌癥患者而言其濃度增加至高達大約300ng/mL。
[0111]對于環(huán)境監(jiān)控，溶解在湖泊和土壤中的循環(huán)DNA是環(huán)境質(zhì)量的指標。
[0112]盡管存在其診斷潛力，但循環(huán)DNA的研究受到標準樣品制備方法的限制。常規(guī)技術(shù)始于從粗樣品過濾、離心和收集DNA。在此類方案中，基因組DNA被釋放出來并且與循環(huán)DNA混合。此外，較慢的樣品制備過程可降解和突變循環(huán)DNA。因此，可濃縮循環(huán)DNA的快速方法將是一種有益的診斷和分析工具。
[0113]本發(fā)明的方法可以直接濃縮和檢測游離DNA。例如，將CNT/SiC納米尖端電極用于從湖水中固定游離DNA。實驗結(jié)果顯示了循環(huán)dsDNA(雙鏈DNA)的大小選擇性捕獲，同時排除使用光學顯微鏡在粗溶液中觀察到的細胞或其他更大的顆粒。通過熒光標記和顯微鏡檢查鑒定了游 離DNA。
[0114]使用介電泳進行的DNA的序列特異性濃縮
[0115]在此示例性實施方案中，在高頻AC場下利用感應(yīng)偶極子(DCP)力矩遞送樣品溶液中的靶DNA并且將其濃縮在CNT/SiC納米尖端電極上。通過與固定化的探針DNA進行序列特異性雜交來實現(xiàn)靶DNA的特異性結(jié)合。在從溶液撤出納米尖端的過程中用毛細管作用力促進了 DNA最終固定至納米尖端上。通過熒光和/或電學測量檢測捕獲的DNA。
[0116]假設(shè)2mm直徑的球狀小滴中的靶DNA被濃縮在納米尖端末端的Iym3區(qū)域中，那么濃縮倍數(shù)將為大約101°倍。由于這種顯著的濃縮效應(yīng)，因此檢測DNA的靈敏度比常規(guī)的非酶促生物傳感器提高IO6至IO8倍。此外，通過高頻AC場加速了 DNA的雜交，這導致與已知的檢測方法所需的數(shù)小時或數(shù)天相比較，本方法僅需10分鐘的檢測時間。
[0117]在該示例性實施方案中，用聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂鋪CNT/SiC納米尖端以避免DNA分子與納米尖端的CNT之間的非特異性結(jié)合。為了研究尖端傳感器的靈敏度，將AC場(5MHz)和雜交時間最優(yōu)化，得到分別為IOVpp和5分鐘的參數(shù)。將結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis) (MTB)的探針 DNA 制備為 5’-生物素-CAG CGC CGA CAGTCG GCG CTT GTG-3’ (SEQ ID N0.1)(初始濃度:38.3 μ M, Invitrogen)。該序列包括 MTBrpoB基因(野生型)的密碼子531，其被視為TB的系統(tǒng)發(fā)育標志，也被當作對利福平(兩種常用的一線抗肺結(jié)核藥中的一種)的敏感性的靈敏指標。將探針DNA固定在納米尖端的末端。模擬的靶 DNA 是具有序列 5’-CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG-3’ (SEQ ID N0.2)的寡核苷酸(初始濃度:35.3 μ M)。將嵌入染料(PIC0GREEN?，Invitrogen)用于通過熒光確認雜交。按10倍的增量將靶濃度控制在IaM至InM。測量的檢測限為10aM(10_17M，或6，000個拷貝/mL)，這與現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法例如涂片顯微鏡檢查法相當。[0118]使用電滲流進行的細菌固定
[0119]為了進行細菌的無培養(yǎng)檢測(culture-free detection),將微米尺寸的電極(〃微尖端")用于固定和濃縮結(jié)核分枝桿菌(MTB)的細菌細胞。用通過AC場產(chǎn)生的循環(huán)流(電滲流)濃縮水溶液中的細菌。濃縮的細菌被電滲流和靜電引力(電泳)吸引至微尖端表面。在從液體撤出電極的過程中由毛細管作用力導致細菌的最終固定。圖8A顯示在光學(上)和熒光(下)成像下在其表面上具有固定化MTB細胞的微尖端的顯微照片。
[0120]使用熒光顯微鏡檢測MTB。為了進行熒光測量，使用特異于MTB的表面抗原的熒光素標記多克隆抗體(ViroStat Inc, Portland, ME) 0將具有固定化MTB細胞的微尖端浸入抗體溶液中進行5分鐘，用去離子水漂洗。然后在熒光顯微鏡(Olympus BX-41, OlympusAmerica Inc., Melville, NY)下檢測 MTB 細胞。
[0121]微尖端傳感器的靈敏度為至少800個細胞/mL，如圖8B中舉例說明的。檢測在10分鐘內(nèi)完成。這種細菌濃縮方法可從粗制生物樣品例如人痰中捕獲MTB細菌。為了增強捕獲的特異性，可將抗體任選地固定在電極上。
[0122]在另外的實施方案中，將固定化的MTB細菌釋放入純水(例如，通過浸入沸水中)以提取其基因組DNA用于使用納米尖端的種特異性檢測，如上文中針對DNA所描述的。由于本發(fā)明的方法是非酶促性的，從而不對裂解物中的干擾物質(zhì)高度易感，因此可通過快速且簡單如在裂解/雜交緩沖液中短暫煮沸、然后使用納米尖端進行本發(fā)明提供的方法以選擇性捕獲釋放的DNA的方法來完成DNA的提取。
[0123]MTB細朐的電學檢測
[0124]上述之前的示例性實施方案包括使用光學和/或熒光檢測進行的固定化顆粒的檢測。在此示例性實施方案中，將電學檢測用于MTB檢測。
[0125]將XYZ平臺用于精確地定位控制涂有金的鎢的微尖端(用于TB的傳感)和類似構(gòu)建的參照傳感器，將這兩者都浸入樣品溶液。將MTB傳感器用于捕獲和檢測MTB，而參照傳感器用于補償溶液體積、電極之間的距離和緩沖液的溫度及離子濃度。在一個可選擇的實施方案中，可使用包括用于參照傳感的微電極的微孔(microwell )。
[0126]使用5 μ L的溶液體積。
[0127]圖9Α圖解性地舉例說明具有MTB傳感器和參照傳感器的系統(tǒng)的典型電流-電壓曲線。隨著外施電壓增加，測量的電流增加。在抗體-抗原反應(yīng)后，電阻減小。與參照傳感器的電流相比較，MTB傳感器的電流增加。評估MTB與參照傳感器之間的電流差異用于MTB的檢測。
[0128]為了檢查用于陰性對照的傳感器的性能，將不具有MTB細胞的微尖端浸入抗體溶液中進行5分鐘。然后，將電流測量為電壓的函數(shù)。然后測量參照和MTB傳感器(傳感探針)的電流。為了進行此電學測量，將具有固定化的MTB細胞的尖端浸入抗體溶液。5分鐘后測量電流，并且針對參照傳感器的電流對其進行標準化。在使用3個不同微尖端對的3個測試中，MTB傳感器與參照傳感器的電流比[(ΙΤΒ-Ι#Μ)/Ι#Μ]顯示平均值和標準差為
0.04±0.06。
[0129]當就0、8χ103和8x104個細胞/mL的MTB濃度測量電流比時，電流比在80，000個細胞/mL處快速增加，如圖9B中舉例說明的。
[0130]使用單電極進行的電學DNA檢測[0131]上述示例性實施方案利用2個電極(探針電極和參照電極)在抗體/抗原反應(yīng)中檢測細菌。在此示例性實施方案中，使用單個電極進行顆粒的電學檢測。靶顆粒包括金屬顆粒以提聞檢測靈敏度。
[0132]例如，用摻雜胺的SWCNT或金屬-SWCNT涂鋪的CNT/SiC納米尖端可提高檢測用金屬顆粒標記的顆粒的靈敏度。摻雜胺的SWCNT的能帶隙在DNA結(jié)合后快速改變。
[0133]金屬-SWCNT提高了裝置的信噪比，因為SWCNT與金屬電極之間的接觸電阻與非金屬SWCNT相比較有所減小。
[0134]為了進行雜交實驗，在將顆粒固定在電極上之后測量電阻(Rf)和電容(Cdl)的變化。Cdl的變化歸功于電極上的電雙層效應(yīng)，而Rf的變化歸于DNA雜交。監(jiān)控這些值的變化即可測定納米尖端電極對雜交事件的靈敏度。當用矩形波信號完成了信號分析，即進行1-V(圖10中顯示的)或連續(xù)-DC分析以檢測事件，然后可將其與熒光測量值相比較以進行確認。
[0135]使用電場增強電極上的反應(yīng)
[0136]通過將電場施加于電極，可因電極表面上分子(例如，第一結(jié)合伴侶)的定向和其對附著至顆粒的第二結(jié)合伴侶的吸引而加速生物和化學反應(yīng)。下面描述使用本發(fā)明的方法進行的DNA雜交的加速。
[0137]用PDMS涂鋪CNT/SiC納米尖端電極，然后用鏈霉抗生物素蛋白作為DNA的結(jié)合伴侶涂鋪其。以0、5和IOVpp將AC電位施加于電極來雜交靶DNA (ΙρΜ，1.5 μ L)，進行5分鐘。不施加大于IOVpp的電壓，因為在這樣的電壓下會發(fā)生電擊穿。在雜交后，將嵌入染料用于使用熒光光譜法研究DNA的雜交。將熒光強度用于測定在施加AC場后雜交的變化。
[0138]圖1lA顯示在不同AC電位下固定的DNA的熒光強度。隨著AC電位增加，強度因電極上更高濃度的DNA而增加。IOVpp提供了 DNA雜交的最大增強。
[0139]也對雜交時間進行了研究。在IOVpp下在不同的雜交時間上測量熒光強度。當雜交時間大于5分鐘時，熒光強度飽和，如圖1lB中舉例說明的。
[0140]因此，對于上述系統(tǒng)，最佳AC電位和雜交時間分別測定為IOVpp和5分鐘。
[0141]HIV-B病毒的固定和RNA檢測
[0142]在該例性實施方案中，將電極用于固定病毒(HIV-B)。在固定病毒后,使用突光光譜法檢測來自病毒的RNA。
[0143]將CNT/SiC納米尖端(直徑500nm)用作電極。HIV-B病毒溶液是Armored RNAQuant HIV-B 試劑盒(Asuragen, Inc, Austin, TX)，濃度為 50，000 個拷貝 /mL。為 了進行 RNA檢測，使用DMSO中的Quant-1T RiboGreen RNA試劑，其中當與核酸結(jié)合時熒光激發(fā)/發(fā)射為500/525nm。將試劑稀釋200x(從所購買的濃度)以進行RNA檢測。
[0144]將納米尖端(第一電極)浸入懸浮在金屬線圈(第二電極)中的20μ L病毒溶液微滴中。將14Vpp，5MHz的信號施加到電極之間進行I分鐘以將HIV固定在納米尖端上。然后以大約10 μ m/秒撤回納米尖端以進一步固定HIV。然后使用SEM對納米尖端上的固定化HIV成像，如圖12中舉例說明的。
[0145]將納米尖端上的固定化HIV進一步用于檢測RNA。在電場不存的情況下將具有固定化HIV的納米尖端浸入2uL的RIB0GREEN試劑微滴進行5分鐘，在該時間內(nèi)將RIB0GREEN插入病毒內(nèi)部的RNA。然后從溶液中撤出納米尖端，通過熒光顯微鏡檢查分析納米尖端。圖13A是在浸入RIBOGREEN溶液之前在其表面上具有固定化HIV-B的納米尖端的熒光顯微照片。提供白線以舉例說明納米尖端在顯微照片中的位置。圖13B是在用RIBOGREEN處理后納米尖端的熒光顯微照片。在用RIBOGREEN處理后固定在納米尖端上的HIV-B中的RNA發(fā)熒光。
[0146]因此，可使用本發(fā)明的方法固定和檢測病毒和病毒中包含的RNA。
[0147]固定化細胞中的核酸的檢測
[0148]在此示例性實施方案中，描述了原位雜交(ISH)。利用熒光探針檢測細胞中的核酸在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。該技術(shù)被認為是直接研究細胞(例如，檢測細菌細胞中的rRNA或mRNA作為活細菌的指標)和病毒(例如，檢測病毒顆粒中的RNA或DNA)的強有力分析工具。然而，已知的ISH法受困于有限的靈敏度和將細胞固定至固體支持物(這是已知的方法所必需的)的困難。
[0149]此處描述的實施方案利用電極(例如，納米尖端或微尖端)固定細胞以用于ISH分析。在所述方法中，將細胞固定在微尖端(第一電極)上，然后浸入含有允許檢測細胞內(nèi)的細胞核酸的核酸探針的第二溶液。細胞中核酸的原位檢測可以實現(xiàn)提高的檢測時間和最低限度的處理以獲得細胞核酸的靈敏性檢測。
[0150]首先，使用本發(fā)明的方法和任選地使用將細胞特異性結(jié)合至微尖端的功能化的微尖端來將細胞固定在微尖端上。將固定的細胞浸入含有核酸探針的第二溶液，該核酸探針具有與細胞中的遺傳核酸(genetic nucleic acids)的特定區(qū)域相匹配的序列。探針滲入固定的細胞并且與細胞內(nèi)的匹配遺傳區(qū)域雜交。在雜交后，形成可檢測的部分(例如，熒光部分)從而檢測雜交的核酸。
[0151]異質(zhì)顆粒溶液的純化
[0152]本發(fā)明的方法可用于純化顆粒的異質(zhì)溶液(例如，不同大小和/或組成的顆粒)。按照本文中描述的方法進行顆粒在電極上的大小選擇性固定。例如，如果固定的顆粒包含DNA和蛋白質(zhì)的混合物，那么可將固定的顆粒浸入第二溶液并且從電極釋放。然后將具有DNA和蛋白質(zhì)的第二溶液過濾(例如使用濾紙或色譜法)。如果蛋白質(zhì)從第二溶液中過濾出，那么DNA保留在第二溶液中。然后通過按照所提供的方法將DNA固定在電極上來重捕獲DNA。
[0153]因此，可使用本文中描述的方法來純化復雜混合物(例如，生物流體)?？墒褂盟峁┑姆椒ǚ蛛x本文中描述的任何顆粒混合物。
[0154]操作細菌、細胞和其他顆粒
[0155]可將本發(fā)明的方法用于分子工程。具體地，可將納米尖端上的固定化分子用于操作生物顆粒和其它分子的性質(zhì)用于分子設(shè)計；納米制造；和精度控制(precisioncontrol)。
[0156]在一個實施方案中，將固定的分子定位在生物顆粒例如細菌內(nèi)。因此，單個細菌(病毒)被用作由細胞膜限定的生物化學實驗室。在這樣的系統(tǒng)中，利用化學能擴增DNA，并且可就生物相容性和抗生素測試和檢測蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法使得能夠進行這樣的自主"分子鑄造(molecular foundry) 〃。
[0157]在提供的分子鑄造中，可通過使用選自電能、熱能、機械能和化學能的能量以特異性的方式捕獲和釋放核酸和/或蛋白質(zhì)?？蓪募{米尖端插入細菌或病毒的顆粒用作疾病指示器(傳感器)，用于藥物遞送(治療劑)，用于遺傳修飾和用于基因工程。[0158]裝置的形式
[0159]可在許多裝置上實施本發(fā)明的方法。例如，一個示例性裝置包括具有擁有光學和電學檢測單元以及用于裝置所有方面的控制單元的電極陣列的全自動化裝置。
[0160]全自動化裝置可用于多種病原體和各種分析物。
[0161]在一個示例性實施方案中，用于進行所述方法的裝置包括便攜式濃縮器，其包括用于分析的電子單元和尖端電極。這樣的裝置可以是高度便攜的和一次性的，例如經(jīng)塑形具有鋼筆形狀的裝置，其具有用于開動尖端浸入樣品溶液和將電極撤出樣品溶液的手動“點擊”功能。
[0162]顆粒固定的機制的分析
[0163]圖14舉例說明了使用AC電場和毛細管作用的顆粒固定方法。為了捕獲顆粒，將納米尖端電極浸入溶液，在納米電極和與溶液接觸的第二電極之間施加AC場。由電極產(chǎn)生的不均勻電場導致顆粒的極化和顆粒被DEP吸引至納米尖端。當從溶液撤回尖端時，可基于毛細管作用和DEP力的組合效應(yīng)將被吸引的顆粒捕獲或釋放在尖端上。DEP力將顆粒吸引至尖端，而毛細管力可將顆粒捕獲或釋放在尖端上。為了預測顆粒的捕獲過程，下面檢查因毛細管作用而產(chǎn)生的捕獲和釋放力。
[0164]為了測定作用在球上的毛細管作用力，使用通過楊-拉普拉斯公式產(chǎn)生的彎月面特征(meniscus profile)分析由于毛細管作用而產(chǎn)生的捕獲和釋放力。圖15A舉例說明了大小特異性捕獲的機制。取決于顆粒對尖端的直徑比，所述顆?？蓮募舛瞬东@或釋放。利用分離解α測定捕獲，因為用于捕獲和釋放的毛細管作用力依賴于分離點(split point)上的周長。在分離點上，溶液被分成上和下部分。當分離角大于90°時，顆粒留在溶液中(圖15A中的情況(I))。當分離角小于90°時，顆粒被捕獲在尖端上(圖15A中的情況(3))。在正好90°的分離角上(圖15A中的情況(2))，不能測定顆粒的捕獲，因為作用于尖端和溶液的毛細管力相等。
[0165]臨界標準化直徑[(Cln)raitieal]定義為分離角為90°時的標準化直徑。通過數(shù)值分析，圖15A的情況(2)的構(gòu)型中(dn)raitic;al估計為0.39，如圖15B中顯示的。通過該理論分析，只要顆粒直徑(dp)與尖端直徑(dt)的比率小于0.39，顆粒就可被捕獲至尖端上?？赏ㄟ^(I)選自電能、化學能、機械能和熱能的表面相互作用能量，(2)尖端形狀和顆粒形態(tài)學和(3)顆粒-顆粒相互作用(例如，細胞的集落形成)改變(dn)raitic;al。
[0166]在毛細管作用力的上述比較中，當計算(Cln)eritieal時未考慮電學力(例如，DEP)。例如，如果將DEP包括在該計算中，那么(dn) critical將增加，因為將DEP力加入至捕獲毛細管作用力。此外，(dn)raitic;al受實驗條件包括尖端幾何形狀、尖端顆粒相互作用以及顆粒和尖端與液體的接觸角影響。
[0167]表I概括了聚苯乙烯球和CNT/SiC納米尖端的固定結(jié)果。針對尖端直徑標準化由尖端捕獲的最大球體直徑，以獲得(dn)raitic;al。根據(jù)表1，通過使用情況(2)、(3)、⑷和(5)，(d丄ritical在0.84±0.07(平均值土標準差)的范圍內(nèi)。
[0168]這樣，使用聚苯乙烯納米球的(dn)eHtieal經(jīng)測定在0.77至0.92(0.84±0.07)的范圍內(nèi)。在上文關(guān)于圖5C所述的IOOnm和6 μ m球體的混合實驗中,6 μ m的球體未被固定在納米尖端上，因為6μπι的球體的(dn)_遠大于(dn)raitic;al的范圍。
[0169]表1:聚苯乙烯球在電極上的大小特異性固定[0170]
【權(quán)利要求】
1.用于濃縮顆粒的方法，其包括: (a)將具有高高寬比的第一電極浸入含有顆粒的液體中，其中第一電極包含具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米； (b)通過使用第一電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力而將顆粒驅(qū)向第一電極；和 (c)利用通過從溶液撤出第一電極而在第一電極與液體之間形成的毛細管作用力將顆粒固定在第一電極的表面上。
2.權(quán)利要求2的方法，其還包括分析固定在第一電極表面上的顆粒。
3.權(quán)利要求2的方法，其中分析顆粒包括選自電學、機械、光學、表面成像技術(shù)和其組合的方法。
4.權(quán)利要求3的方法，其中光學分析包括將發(fā)光化合物附著至顆粒以提供發(fā)光顆粒和檢測來自該發(fā)光顆粒的發(fā)光。
5.權(quán)利要求3的方法，其中電學檢測包括用于測量選自電容、電阻、電導、阻抗和其組合的特征的技術(shù)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中第一電極包括選自金屬、摻雜半導體和導電聚合物的材料。
7.權(quán)利要求1的方法，其中第一電極的緯向尺寸小于I毫米。
8.權(quán)利要求1的方法，其中第一電極的緯向尺寸大于顆粒的縱向尺寸。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一電極至少部分涂有表面涂層。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述表面涂層選自單層和聚合物層。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述表面涂層增強顆粒在第一電極上的固定。
12.權(quán)利要求11的方法，其中表面涂層包含第一結(jié)合伴侶，并且顆粒包含能夠結(jié)合該第一結(jié)合伴侶的第二結(jié)合伴侶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是抗體或其片段，并且第二結(jié)合伴侶是抗原。
14.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是抗原，并且第二結(jié)合伴侶是抗體或其片段。
15.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是第一核酸，并且第二結(jié)合伴侶是第二核酸。
16.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是酶，并且第二結(jié)合伴侶是底物。
17.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是受體，并且第二結(jié)合伴侶是受體的配體。
18.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是核酸，并且第二結(jié)合伴侶是蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求12的方法，其中第一結(jié)合伴侶是細胞、細胞膜或細胞器，并且第二結(jié)合伴侶是所述細胞、細胞膜或細胞器的配體。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述電場感應(yīng)力選自電泳、電滲、介電泳和其組合。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述電場感應(yīng)力在第一電極和與液體接觸的第二電極之間產(chǎn)生。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述液體選自溶液和懸浮液。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述液體是選自血液、痰、粘液和唾液的生物流體。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述顆粒選自顆粒、病毒、細菌、核酸、細胞和蛋白質(zhì)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述 病毒選自柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、EB病毒、單純皰疫病毒I型、單純皰疫病毒2型、人巨細胞病毒、人類皰疫病毒8型、水痘-帶狀皰疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、黃病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風疹病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、伊波拉病毒、馬爾堡病毒、漢塔病毒、呼腸孤病毒、禽流感病毒和西尼羅病毒。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述細菌選自結(jié)核病細菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、沙門氏菌和綠膿桿菌。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述細胞是果蠅細胞。
28.權(quán)利要求1的方法，其還包括貯存被固定的顆粒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中貯存包括低溫冰凍。
30.權(quán)利要求1的方法，其中第一電極的表面是連續(xù)的外表面。
31.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生電場感應(yīng)力包括電學定向該表面涂層。
32.權(quán)利要求1的方法，其還包括釋放被固定的顆粒。
33.權(quán)利要求32的方法，其中釋放被固定的顆粒包括將固定的顆粒釋放至選自細胞、病毒和細菌的實體內(nèi)。
34.權(quán)利要求1的方法，其還包括 (d)將具有高高寬比的第三電極浸入含有所述顆粒的液體中，其中第三電極包含具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米； (e)通過使用第三電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力，以便將液體中的顆粒優(yōu)先驅(qū)向第三電極；和 (f)從液體中撤出第三電極，以便在撤出的第三電極與液體之間形成的毛細管作用力將所述顆粒固定在第三電極的表面上。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述顆粒包含第一顆粒和第二顆粒，其中第一顆粒被優(yōu)先驅(qū)向第一電極，并且第二顆粒被優(yōu)選驅(qū)向第三電極。
36.顆粒濃縮系統(tǒng)，其包含: (a)具有高高寬比的第一電極，其中所述第一電極具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米； (b)包含第一顆粒的第一液體； (c)執(zhí)行器，其大小和構(gòu)造被設(shè)置成將第一電極浸入第一液體和從其中撤出，以便在撤出的第一電極與第一液體之間形成的毛細管作用力將第一顆粒固定在第一電極的表面上；和 (d)電信號發(fā)生器，其大小和構(gòu)造被設(shè)置成用第一電極產(chǎn)生電感應(yīng)力，以便當將第一電極浸入第一液體時，所述第一顆粒被優(yōu)先驅(qū)向第一電極。
37.用于濃縮顆粒的方法，其包括: (a)將具有高高寬比的第一電極浸入含有顆粒的液體中，其中第一電極包含具有桿緯向尺寸的桿和具有遠端緯向尺寸的遠末端，其中所述遠端緯向尺寸為I納米至I毫米；和 (b)通過使用第一電極產(chǎn)生電場感應(yīng)力來將顆粒驅(qū)向第一電極。
【文檔編號】G01N33/569GK103900894SQ201310717230
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2009年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2008年6月6日
【發(fā)明者】鄭在鉉, 呂運弘, 李庚勳, J·W·張伯倫, G·福圖希, 劉翔, 吳基錫, D·M·拉特納, 高大勇, 周峯立 申請人:華盛頓大學