一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法
【專利摘要】一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于利用夾心酶聯(lián)免疫方法來檢測(cè)古代膠結(jié)劑文物材料中的卵蛋白成分，即將Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體結(jié)合到聚苯乙烯固相載體表面形成固相抗體，然后和膠結(jié)劑文物洗脫液結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體，其與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物；加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)，因此可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析；本發(fā)明所采用的方法成本低、檢測(cè)簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快。
【專利說明】一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，主要用于古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]膠結(jié)劑作為一種功能性材料，在印繪、染整等工藝中起著重要的作用。古代膠結(jié)劑材料的主要組分是卵蛋白，因此對(duì)卵蛋白的檢測(cè)對(duì)膠結(jié)劑材料的研究具有重要的科學(xué)價(jià)值。古代文物材料中膠結(jié)劑的蛋白檢測(cè)方法主要有微量化學(xué)實(shí)驗(yàn)法、拉曼光譜法。微量化學(xué)實(shí)驗(yàn)法主要是利用卵蛋白在有機(jī)溶劑中的溶解性及其熔點(diǎn)等化學(xué)物理特性來鑒定，該法簡(jiǎn)單易行，但是特異性差。拉曼光譜法具有較高的空間分辨率，能夠避免不同組分之間的干擾。然而，
[0003]古代文物材料年代久遠(yuǎn)，長(zhǎng)期受光照、氧化等環(huán)境的影響，使得膠結(jié)材料成分復(fù)雜、含量甚微，也難以分析表征單一種類蛋白膠結(jié)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提供一種靈敏度高、簡(jiǎn)單高效的古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:利用夾心酶聯(lián)免疫方法來檢測(cè)古代膠結(jié)劑文物材料中的卵蛋白成分，即將Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體結(jié)合到聚苯乙烯固相載體表面形成固相抗體，然后和膠結(jié)劑文物洗脫液結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體，其與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物；加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)，因此可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析。
[0006]2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下:
[0007]a)溶液配制=PBS 緩沖溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7H202.16g,用去離子水溶解并定容lOOOmL，調(diào)節(jié)PH至7.4，121°C滅菌處理；洗脫液的配制:5mLlmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸鈉(50mL去離子水中含有IOg溶質(zhì))，加去離子水溶解并定容500mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，無菌抽濾后在室溫下儲(chǔ)存；
[0008]b)將PBS緩沖溶液80-100 μ L設(shè)為空白對(duì)照，樣品卵蛋白0.1-0.5mg設(shè)為陽性對(duì)照；將80-10(^ L的PBS緩沖溶液、0.1-0.5mg樣品卵蛋白、0.1-0.5mg的文物材料分別溶于80-120 μ L的洗脫液中 ，室溫下放置2-4天，形成陽性對(duì)照樣品卵蛋白洗脫液、實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液；
[0009]c)取包被液稀釋10000-12000倍的一抗即Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體80-100 μ L，加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，用保鮮膜封板，溫度4°C下保持24h，次日用PBS緩沖溶液充分洗滌3次，甩干；
[0010]d)各孔內(nèi)加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100 μ L，封閉lh，然后用PBS緩沖溶液進(jìn)行洗滌三次，每次三分鐘；
[0011]e)各孔內(nèi)加入40 μ L-70 μ L的步驟b的陽性對(duì)照樣品卵蛋白樣品洗脫液和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，甩干；
[0012]f)各孔內(nèi)加稀釋10000-12000倍之間的酶標(biāo)二抗即堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L) 80-100 μ L，置37°C的烘箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次
三分鐘，并甩干；
[0013]g)各孔內(nèi)加底物液1%的四甲基聯(lián)苯胺溶液100 μ L，置黑暗處使其反應(yīng)20min ；
[0014]h)各孔內(nèi)加2mol/L H2SO4溶液0.05mL,終止反應(yīng)；
[0015]i)將步驟h液體取出，加到酶標(biāo)儀中，讀取在450nm處的吸光度；
[0016]j)比較陽性對(duì)照樣品卵蛋白和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料二者的吸光度數(shù)值OD ;與空白對(duì)照樣品卵蛋白檢測(cè)的OD值相比，如果文物洗脫液中卵蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)OD值明顯增加，證明實(shí)驗(yàn)樣品文物材料中確實(shí)存在卵蛋白；與空白對(duì)照樣品卵蛋白檢測(cè)的OD值相比，如果文物洗脫液中卵蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)OD值無顯著變化，證明實(shí)驗(yàn)樣品文物材料中不存在卵蛋白。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:1、本發(fā)明利用夾心酶聯(lián)免疫的方法對(duì)膠結(jié)劑文物材料中的卵蛋白成分進(jìn)行檢測(cè)，一方面靈敏度高、操作簡(jiǎn)單。另一方面，避免其它蛋白的干擾，特異性強(qiáng)。2、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所采用的方法成本低、檢測(cè)簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明采用的夾心酶聯(lián)免疫方法對(duì)古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白進(jìn)行檢測(cè)，一方面靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，另一方面，特異性強(qiáng)，能夠避免其它蛋白的干擾。將Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體結(jié)合到聚苯乙烯固相載體表面形成固相抗體，然后和膠結(jié)劑文物洗脫液結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)抗體，其與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)，因此可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)定性分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)試具有較高的靈敏度。
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0020]實(shí)施例1
[0021]一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，它包括如下步驟:
[0022]a)溶液配制=PBS 緩沖溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7Η202.16g,用去離子水溶解并定容IOOOmL,調(diào)節(jié)PH至7.4，121°C滅菌處理。洗脫液的配制:5mLlmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸鈉(50mL去離子水中含有IOg溶質(zhì))，加去離子水溶解并定容至500mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。無菌抽濾后在室溫下儲(chǔ)存。
[0023]b)將PBS緩沖溶液IOOyL設(shè)為空白對(duì)照，樣品卵蛋白0.1mg設(shè)為陽性對(duì)照。將100 μ L的PBS緩沖溶液、0.1mg樣品卵蛋白、0.1mg的文物材料分別溶于100 μ L的洗脫液中，室溫下放置2天，形成陽性對(duì)照樣品卵蛋白洗脫液、實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液。[0024]c)取包被液稀釋10000倍的一抗(Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體)100 μ L，加 到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，用保鮮膜封板，4°C冰箱里面保持24h。然后用PBS緩沖溶液充分 洗滌3次，甩干。[0025]d)各孔內(nèi)加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100 μ L，封閉lh。然后用PBS緩沖溶 液進(jìn)行洗滌三次，每次三分鐘。[0026]e)各孔內(nèi)分別加入40 μ L步驟b的陽性對(duì)照樣品卵蛋白樣品洗脫液和實(shí)驗(yàn)樣品文 物材料洗脫液，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，甩干。[0027]f)各孔內(nèi)加稀釋10000倍的酶標(biāo)二抗(堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)) ΙΟΟμ L，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)。移去液體，用PBS緩沖液洗滌三次，每次三分鐘，并甩干。[0028]g)各孔內(nèi)加入1%的底物液四甲基聯(lián)苯胺溶液100 μ L，置黑暗處使其反應(yīng)20min。[0029]h)各孔內(nèi)加2mol/LH2S040.溶液0.05mL,終止反應(yīng)。[0030]i)將步驟h液體取出，加入到酶標(biāo)儀中，讀取在450nm處的吸光度[0031]j)比較陽性對(duì)照樣品卵蛋白和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料的吸光度數(shù)值0D。[0032]實(shí)施例2[0033]一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，它包括如下步驟:[0034]a)溶液配制=PBS 緩沖溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g, NaH2PO4.7Η202.16g,用去離子水溶解并定容IOOOmL,調(diào)節(jié)PH至7.4，121°C滅菌處理。洗脫 液的配制:5mLlmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶 液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸鈉(50mL去離子水中含有IOg溶質(zhì))，加去離子水溶解 并定容至500mL，用NaOH溶液pH至7.4。無菌抽濾后在室溫下儲(chǔ)存。[0035]b)將PBS緩沖溶液IOOyL設(shè)為空白對(duì)照，樣品卵蛋白0.1mg設(shè)為陽性對(duì)照。將 100 μ L的PBS緩沖溶液、0.1mg樣品卵蛋白、0.3mg的文物材料分別溶于100 μ L的洗脫液 中，室溫下放置3天，形成陽性對(duì)照樣品卵蛋白洗脫液、實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液。[0036]c)取包被液稀釋11000倍的一抗(Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體)IOOyLjP 到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，用保鮮膜封板，在4°C冰箱里面保持24h。然后用PBS緩沖溶液 充分洗漆3次，甩干。[0037]d)各孔內(nèi)加入1%牛血清蛋白(BSA)溶液100 μ L，封閉lh。然后用PBS緩沖溶液 進(jìn)行洗滌三次，每次三分鐘。[0038]e)各孔內(nèi)分別加入50 μ L步驟b的陽性對(duì)照樣品卵蛋白樣品洗脫液和實(shí)驗(yàn)樣品文 物材料洗脫液，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，甩干。[0039]f)各孔內(nèi)加稀釋11000倍的酶標(biāo)二抗(堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)) ΙΟΟμ L，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)。移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，并甩干。[0040]g)各孔內(nèi)加1%的底物液四甲基聯(lián)苯胺溶液100 μ L,置黑暗處使其反應(yīng)20min。[0041]h)各孔內(nèi)加2mol/LH2S04溶液0.05mL,終止反應(yīng)。[0042]i)將步驟h液體取出，加到酶標(biāo)儀中，讀取在450nm處的吸光度[0043]j)比較陽性對(duì)照樣品卵蛋白和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料的吸光度數(shù)值0D。
[0044]實(shí)施例3
[0045]一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，它包括如下步驟:
[0046]a)溶液配制=PBS 緩沖溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7Η202.16g,用去離子水溶解并定容IOOOmL,調(diào)節(jié)PH至7.4，121°C滅菌處理。洗脫液的配制:5mLlmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸鈉(50mL去離子水中含有IOg溶質(zhì))，加去離子水溶解并定容至500mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。無菌抽濾后在室溫下儲(chǔ)存。
[0047]b)將PBS緩沖溶液IOOyL設(shè)為空白對(duì)照，樣品卵蛋白0.1mg設(shè)為陽性對(duì)照。將100 μ L的PBS緩沖溶液、0.1mg樣品卵蛋白、0.5mg實(shí)驗(yàn)樣品文物材料分別溶于100 μ L洗脫液中，室溫下放置4天，形成陽性對(duì)照樣品卵蛋白洗脫液、實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液。
[0048]c)取包被液稀釋12000倍的一抗(Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體)IOOyLjp到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，用保鮮膜封板，在4°C冰箱里面保持24h。次日用PBS緩沖溶液充分洗漆3次，甩干。
[0049]d)各孔內(nèi)加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100 μ L，封閉lh。然后用PBS緩沖溶液進(jìn)行洗滌三次，每次三分鐘。
[0050]e)各孔內(nèi)分別加入60 μ L步驟b的陽性對(duì)照樣品卵蛋白樣品洗脫液和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，甩干。
[0051]f)各孔內(nèi)加稀釋12000倍的酶標(biāo)二抗(堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L) 100 μ L，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)。移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分
鐘，并甩干。
[0052]g)各孔內(nèi)加1%的底物液四甲基聯(lián)苯胺溶液100 μ L,置黑暗處使其反應(yīng)20min。
[0053]h)各孔內(nèi)加2mol/LH2S04溶液0.05mL,終止反應(yīng)。
[0054]i)將步驟h液體取出，加到酶標(biāo)儀中，讀取在450nm處的吸光度
[0055]j)比較陽性對(duì)照樣品卵蛋白和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料的吸光度數(shù)值0D。
[0056]除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于利用夾心酶聯(lián)免疫方法來檢測(cè)古代膠結(jié)劑文物材料中的卵蛋白成分，即將Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體結(jié)合到聚苯乙烯固相載體表面形成固相抗體，然后和膠結(jié)劑文物洗脫液結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體，其與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物；加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)，因此可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下: a)溶液配制:PBS緩沖溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7H202.16g,用去離子水溶解并定容lOOOmL，調(diào)節(jié)PH至7.4，121°C滅菌處理；洗脫液的配制:5mLlmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸鈉(50mL去離子水中含有IOg溶質(zhì))，加去離子水溶解并定容500mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，無菌抽濾后在室溫下儲(chǔ)存； b)將PBS緩沖溶液80-100μ L設(shè)為空白對(duì)照，樣品卵蛋白0.1-0.5mg設(shè)為陽性對(duì)照；將80-100 μ L的PBS緩沖溶液、0.1-0.5mg樣品卵蛋白、0.1-0.5mg的文物材料分別溶于80-120 μ L的洗脫液中，室溫下放置2-4天，形成陽性對(duì)照樣品卵蛋白洗脫液、實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液； c)取包被液稀釋10000-12000倍的一抗即Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體80-100 μ L，加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，用保鮮膜封板，溫度4°C下保持24h，次日用PBS緩沖溶液充分洗滌3次，甩干； d)各孔內(nèi)加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100μL，封閉lh，然后用PBS緩沖溶液進(jìn)行洗滌三次,每次三分鐘； e)各孔內(nèi)加入40μ L-70 μ L的步驟b的陽性對(duì)照樣品卵蛋白樣品洗脫液和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料洗脫液，置37°C溫箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，甩干； f)各孔內(nèi)加稀釋10000-12000倍之間的酶標(biāo)二抗即堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L) 80-100 μ L，置37°C的烘箱中一個(gè)小時(shí)，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，并甩干； g)各孔內(nèi)加底物液1%的四甲基聯(lián)苯胺溶液100μ L，置黑暗處使其反應(yīng)20min ； h)各孔內(nèi)加2mol/LH2SO4溶液0.05mL,終止反應(yīng)； i)將步驟h液體取出，加到酶標(biāo)儀中，讀取在450nm處的吸光度； j)比較空白對(duì)照樣品卵蛋白和實(shí)驗(yàn)樣品文物材料二者的吸光度數(shù)值OD ;與空白對(duì)照樣品卵蛋白檢測(cè)的OD值相比，如果文物洗脫液中卵蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)OD值明顯增加，證明實(shí)驗(yàn)樣品文物材料中確實(shí)存在卵蛋白；與空白對(duì)照樣品卵蛋白檢測(cè)的OD值相比，如果文物洗脫液中卵蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)OD值無顯著變化，證明實(shí)驗(yàn)樣品文物材料中不存在卵蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103575907SQ201310527117
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】劉苗苗, 鄭益煒, 王秉 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)